摘要：光果柱花草（Stylosanthes leiocarpa）是柱花草屬（Stylosanthes Sw.）中可用于林果園間作的一個(gè)野生種。截至目前，光果柱花草的轉(zhuǎn)基因體系尚未建立。本研究以光果柱花草的子葉節(jié)為外植體，比較不同的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株與潮霉素B濃度對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率及轉(zhuǎn)基因陽性率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以K599為誘導(dǎo)菌株且培養(yǎng)基添加8 mg·L-1潮霉素B為篩選壓，是最優(yōu)的毛狀根誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)率達(dá)23.33%，陽性率為100%。在此基礎(chǔ)上，利用轉(zhuǎn)基因毛狀根制備原生質(zhì)體，結(jié)果表明，添加2.5%纖維素酶和2%離析酶，以及8 h的酶解時(shí)間為最優(yōu)條件，原生質(zhì)體的產(chǎn)量達(dá)2.745×105個(gè)·g-1，活力為91.02%，制備的原生質(zhì)體100%為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。本研究成功建立了一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的光果柱花草轉(zhuǎn)基因毛狀根誘導(dǎo)體系及原生質(zhì)體制備體系，為后續(xù)光果柱花草的基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：光果柱花草；發(fā)根農(nóng)桿菌；轉(zhuǎn)基因毛狀根；原生質(zhì)體制備

中圖分類號(hào)：Q789 """文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A """"文章編號(hào)：1007-0435（2024）05-1583-09

Development of Transgenic Hairy Root Induction and Protoplast

Preparation Systems for Stylosanthes leiocarpa

SUN Hao1，2，3， ZHANG Jian-yu1，2，3， LUO Li-juan1，2*， LIU Pan-dao3*

（1. School of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan Province 570228， China; 2. Sanya Institute

Breeding and Multiplication， Hainan University， Sanya， Hainan Province 572025， China; 3. Tropical Crops Genetic Resources

Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences amp; Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm

Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rual Affairs amp; Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm

Resources Genetic Improvement and Innovation of Hainan Province， Haikou， Hainan Province 571101， China）

Abstract：The wild species Stylosanthes leiocarpa，belonging to the genus Stylosanthes Sw. is suitable for intercropping in agroforestry systems. As of now，a transgenic system for Stylosanthes leiocarpa has not been established. In this study，cotyledonary nodes of Stylosanthes leiocarpa were used as explants to investigate the effects of different Agrobacterium rhizogenes strains and concentrations of hygromycin B on hairy root induction efficiency and transgenic positivity. The results showed that induction using strain K599 with the addition of 8 mg·L-1 hygromycin B as the selection pressure was the optimal condition，resulting in a hairy root induction efficiency of 23.33% and 100% transgenic positivity. Subsequently，transgenic hairy roots were used to prepare protoplasts，and the optimal conditions for this process were the addition of 2.5% cellulase R-10 and 2% macerozyme R-10，with an enzymatic digestion time of 8 hours. The protoplast yield reached 2.745×105 cells·g-1 and a viability of 91.02%. Notably，all obtained protoplasts were derived from transgenic cells. This study successfully established an Agrobacterium rhizogenes-mediated transgenic hairy root induction system and a protoplast preparation system for Stylosanthes leiocarpa，laying the foundation for further investigation of gene function in this species.

Key words：Stylosanthes leiocarpa;Agrobacterium rhizogenes;Transgenic hairy roots;Protoplast preparation

柱花草屬（Stylosanthes Sw.）系豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionoideae）植物，全屬大約有50個(gè)種，起源中心為南美洲［1］。柱花草屬已被馴化并栽培利用的種質(zhì)資源主要來自圭亞那柱花草（S. guianensis）和西卡柱花草（S. scabra）兩個(gè)種，它們具有耐瘠薄土壤、耐旱等優(yōu)點(diǎn)，是熱帶與亞熱帶地區(qū)重要的豆科牧草［2］。柱花草屬資源豐富、形態(tài)多樣，該屬許多野生種具有作為牧草和綠肥開發(fā)利用的潛力，其中，光果柱花草（S. leiocarpa）具有分枝數(shù)多、草層自然高度低、覆蓋度好及根蘗性等特點(diǎn)，可作為綠肥（覆蓋作物）用于林果園間作（圖1）。國內(nèi)外對(duì)光果柱花草的已有研究主要集中于分類學(xué)、栽培及利用技術(shù)［3］，而對(duì)其育種技術(shù)研發(fā)及新品種培育工作尚處于起步階段。截至目前，仍未有關(guān)于光果柱花草轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系的研究報(bào)道。建立光果柱花草的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，將為進(jìn)一步開展該種柱花草的基因功能研究及分子育種奠定基礎(chǔ)。

農(nóng)桿菌（Agrobacterium）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是最常用的植物轉(zhuǎn)基因方法之一，相較于其它轉(zhuǎn)基因技術(shù)，該技術(shù)具有低成本、高效率以及基因重排概率低等特點(diǎn)［4］。用于轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌主要包括發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens），兩者均為革蘭氏陰性菌，分別具有Ri質(zhì)粒和Ti質(zhì)粒。這兩種農(nóng)桿菌分別具有誘導(dǎo)植物形成毛狀根和引起植物產(chǎn)生冠癭瘤的能力，主要機(jī)制是通過將Ri/Ti質(zhì)粒上攜帶的T-DNA片段轉(zhuǎn)移并整合到目標(biāo)植物基因組中［5］。根癌農(nóng)桿菌主要用于植物的整株遺傳轉(zhuǎn)化，而發(fā)根農(nóng)桿菌主要用于誘導(dǎo)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因毛狀根?；诎l(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因毛狀根技術(shù)具有轉(zhuǎn)化流程簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化周期短、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)［6］。此外，由發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根具有可離體生長(zhǎng)等特點(diǎn)，因此可被作為一種生物反應(yīng)器，可用于代謝產(chǎn)物分析、基因功能驗(yàn)證以及基因編輯等方面［7］。柱花草屬的圭亞那柱花草和細(xì)莖柱花草（S. gracilis）已通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)建立了轉(zhuǎn)基因毛狀根體系［8-9］，但截至目前尚未有光果柱花草轉(zhuǎn)基因體系研究的文獻(xiàn)報(bào)道。此外，雖然已有研究利用圭亞那柱花草的葉肉提取原生質(zhì)體［10］，但利用柱花草轉(zhuǎn)基因毛狀根制備原生質(zhì)體的體系尚未建立。

本研究以光果柱花草子葉節(jié)作為外植體，比較了4種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率，以及潮霉素B濃度對(duì)毛狀根陽性率的影響，旨在建立一種高效的光果柱花草轉(zhuǎn)基因毛狀根誘導(dǎo)體系。此外，本研究還進(jìn)一步摸索了利用毛狀根制備原生質(zhì)體的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 光果柱花草種質(zhì)材料‘CIAT10105’（圖1），由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。與圭亞那柱花草‘熱研5號(hào)’（‘Reyan No.5’）相比，光果柱花草‘CIAT10105’具有分枝數(shù)量多、草層自然高度低矮（10～20 cm）、草層覆蓋度好、根蘗性強(qiáng)等特點(diǎn)（圖1），作為綠肥（覆蓋作物）用于林果園間作的利用前景廣闊。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 發(fā)根農(nóng)桿菌ArQua1，C58C1，K599與MSU440購于上海唯地生物技術(shù)有限公司；pCXSN-EGFP質(zhì)粒由本課題組前期構(gòu)建并保存。

1.1.3 試劑 潮霉素B（Hygromycin B）購于Biofroxx（德國）公司；纖維素酶（Cellulase R-10）與離析酶（Macerozyme R-10）購于Yakult（日本）公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的選擇和活化 將4種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株分別涂布在50 mg·L-1鏈霉素（Streptomycin，Stre）的LB固體培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。挑取單克隆菌株接種在50 mg·L-1鏈霉素和50 mg·L-1卡那霉素（Kanamycin，Kan）的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r·min-1培養(yǎng)12 h。取100 μL菌液轉(zhuǎn)移至10 mL含有Stre和Kan的LB液體培養(yǎng)基，在200 r·min-1的搖床上震蕩培養(yǎng)，使菌液的OD600=0.9，5 000 r·min-1離心10 min，棄上清，使用不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基重懸菌體至OD600=0.3，重懸菌液用于侵染光果柱花草的子葉節(jié)外植體。

1.2.2 pCXSN-EGFP轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌 參考上海唯地生物科技有限公司的發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化方法，將pCXSN-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ArQua1，C58C1，K599與MSU440發(fā)根農(nóng)桿菌中，取100 μL菌液涂布于含有50 mg·L-1Stre和50 mg·L-1 Kan的LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h，挑取單克隆菌落，進(jìn)行PCR鑒定，鑒定出陽性克隆菌落在50 mg·L-1 Stre和50 mg·L-1 Kan的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并保存（圖2）。

1.2.3 外植體的制備及毛狀根的誘導(dǎo) 選取顆粒飽滿的光果柱花草種子，剝?nèi)シN皮后置于2 mL離心管中加入適量無菌水80℃熱激3 min，在超凈工作臺(tái)中吸出無菌水，加入等體積75%乙醇溶液消毒3 min，無菌水沖洗3次，0.1%氯化汞溶液消毒12 min，無菌水沖洗6次。將消毒后的種子鋪在浸滿無菌水的滅菌濾紙上，密封在無菌培養(yǎng)皿中，25℃，12 h·d-1光照條件下吸脹萌發(fā)處理2 d。參照趙興坤等人［9］建立的細(xì)莖毛狀根轉(zhuǎn)化方法，待種子萌發(fā)并長(zhǎng)出下胚軸后，使用無菌手術(shù)刀片在子葉節(jié)下0.5～1 mm處切去下胚軸，沿下胚軸將兩片子葉節(jié)平均分開，利用手術(shù)刀片在每片子葉節(jié)劃出3個(gè)平行傷口，作為發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的外植體。

將制備好的外植體放入侵染液中浸泡侵染15 min，侵染完成后從侵染液中分離外植體，用無菌濾紙吸干外植體表面多余的侵染液，將外植體置于MS固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)4 d；待暗培養(yǎng)完成后，利用200 mg·L-1特美汀溶液清洗外植體，最后吸干多余水分將外植體插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（1/2 MS+2%蔗糖+200 mg·L-1特美汀+8 mg·L-1潮霉素B+0.35%植物凝膠Phytagel）中，在25℃，12 h·d-1光照條件下以誘導(dǎo)其生發(fā)根。

1.2.4 發(fā)根農(nóng)桿菌及潮霉素B濃度的確定 為了研究不同發(fā)根農(nóng)桿菌和篩選壓濃度對(duì)光果柱花草誘導(dǎo)毛狀根誘導(dǎo)率和陽性率的影響，本試驗(yàn)采用兩因子4×4完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因子1為4種不同的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株（ArQua1，C58C1，K599和MSU440）；因子2為誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選壓，即添加不同濃度的潮霉素B（0，4，8和12 mg·L-1）。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20～25個(gè)外植體。3周后，統(tǒng)計(jì)毛狀根誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)基因陽性率。使用雙波長(zhǎng)便攜式熒光蛋白激發(fā)光源（LUYOR-3415RG）觀察發(fā)綠色熒光（EGFP）的毛狀根為轉(zhuǎn)基因陽性毛狀根。計(jì)算公式如下：

誘導(dǎo)率=產(chǎn)生毛狀根外植體數(shù)量/外植體總數(shù)量×100%

陽性率=發(fā)綠色熒光毛狀根外植體數(shù)量/產(chǎn)生毛狀根外植體數(shù)量×100%

1.2.5 轉(zhuǎn)基因毛狀根的DNA分子鑒定 使用艾科瑞生物有限公司SteadyPure植物基因組DNA提取試劑盒（CTAB法）提取毛狀根DNA，并以此為模板，設(shè)計(jì)特異性引物（見表1），分別通過PCR擴(kuò)增以下基因的片段：柱花草的看家基因PTB、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒rolB基因、pCXSN-EGFP質(zhì)粒上的Hyg和EGFP基因，以驗(yàn)證是否為轉(zhuǎn)基因毛狀根。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因毛狀根繼代培養(yǎng) 將轉(zhuǎn)基因毛狀根從誘導(dǎo)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基（1/2 MS+2%蔗糖+0.35%植物凝膠Phytagel）中，25℃黑暗條件下培養(yǎng)。待毛狀根穩(wěn)定增殖后去除子葉，每7 d更換一次培養(yǎng)基。選擇生長(zhǎng)良好的毛狀根，在無菌條件下，用手術(shù)刀切割下長(zhǎng)約5～7 cm的根尖部分，將其置于新配制的繼代培養(yǎng)基中在相同條件下繼代培養(yǎng)。

1.2.7 毛狀根的原生質(zhì)體制備 毛狀根繼代培養(yǎng)20 d后，使用滅菌手術(shù)刀切取1 g幼嫩的毛狀根轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，加入0.8 mol·L-1甘露醇溶液，細(xì)胞質(zhì)壁分離1 h后取出；再使用刀片將毛狀根切成約1 mm的切片（如圖2L），隨后移入培養(yǎng)皿中并加入5 mL酶解液（纖維素酶+離析酶+0.6 mol·L-1 甘露醇+10 mmol·L-1 CaCl2+10 mmol·L-1 MgCl2+10 mmol·L-1 MES+1% BSA）使毛狀根充分浸沒，25℃黑暗條件下以75 r·min-1振蕩酶解7～9 h。酶解液配制時(shí)將各組分混合后需在55℃水浴10 min，再冷卻至室溫，隨后使用0.22 μm濾膜過濾。酶解結(jié)束后，向酶解液中加入5 mL W5溶液（154 mmol·L-1 NaCl+125 mmol·L-1 CaCl2+5 mmol·L-1 KCl+10 mmol·L-1 MES，pH=5.7）以終止酶解。輕搖培養(yǎng)皿釋放原生質(zhì)體，重復(fù)3次通過300目不銹鋼細(xì)胞過濾器后，收集原生質(zhì)體至50 mL離心管，400 g離心3 min，吸取上清，加入500 μLW5溶液重懸原生質(zhì)體。吸取10 μL至血球計(jì)數(shù)板，并在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。通過熒光顯微鏡觀察EGFP熒光信號(hào)，以評(píng)估其活性。計(jì)算公式如下：

1.2.8 毛狀根原生質(zhì)體最佳酶解條件篩選 本試驗(yàn)以纖維素酶濃度R-10、離析酶R-10濃度及酶解時(shí)間設(shè)計(jì)了3因素3水平L9（34）正交實(shí)驗(yàn)（如表2），纖維素酶R-10與離析酶R-10濃度均設(shè)置為1.5%，2%或者2.5%，酶解時(shí)間分別設(shè)置為7 h，8 h或者9 h。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 27.0和Microsoft office 2022軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同潮霉素B濃度及發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對(duì)毛狀根誘導(dǎo)的影響

在毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別添加0，4，8，12 mg·L-1的潮霉素B為篩選壓，隨著潮霉素B濃度的提高，4種菌株所誘導(dǎo)的毛狀根誘導(dǎo)率均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖3A）。在不同篩選壓下，菌株C58C1均未能誘導(dǎo)產(chǎn)生陽性的轉(zhuǎn)基因毛狀根，其余3個(gè)菌株誘導(dǎo)的毛狀根陽性率隨潮霉素B濃度的提高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（圖3B）。在8 mg·L-1和12 mg·L-1的潮霉素B濃度下，菌株K599和MSU440誘導(dǎo)的毛狀根陽性率均達(dá)到100%。其中，菌株K599在8 mg·L-1潮霉素B濃度下的毛狀根誘導(dǎo)率最高（23.33%），且均為陽性（圖3和圖4）。因此，在供試的4個(gè)發(fā)根農(nóng)桿菌菌株中，K599是誘導(dǎo)光果柱花草產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因毛狀根的最佳菌株。

不同的菌株對(duì)光果柱花草毛狀根的誘導(dǎo)也產(chǎn)生了不同的影響。如圖3B所示，菌株C58C1在添加各濃度潮霉素B的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中都無法成功誘導(dǎo)出轉(zhuǎn)基因毛狀根。潮霉素B濃度為8 mg·L-1時(shí)，K599菌株誘導(dǎo)毛狀根誘導(dǎo)率×陽性率=23.33%，顯著高于MSU440的16.67%以及ArQua1的6.67%。這表明發(fā)根農(nóng)桿菌K599是誘導(dǎo)光果柱花草產(chǎn)生毛狀根的最佳菌株。

2.2 轉(zhuǎn)基因毛狀根的DNA分子鑒定

在綠色熒光蛋白激發(fā)光源下，陽性轉(zhuǎn)基因毛狀根呈現(xiàn)出綠色熒光，而非陽性毛狀根不能發(fā)出綠色熒光（圖5）。提取陽性毛狀根的DNA（T1～T4）作為模板，通過PCR檢測(cè)PTB，rolB，Hyg和EGFP基因。以野生型柱花草根系DNA（WT）和ddH2O（d）作為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)入pCXSN-EGFP質(zhì)粒的K599農(nóng)桿菌液（P）為陽性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，在WT和T1～T4樣品中檢測(cè)到柱花草內(nèi)參基因PTB的條帶，表明樣品的可靠性。在T1～T4樣品中擴(kuò)增出rolB，Hyg和EGFP基因的條帶，說明這些基因已成功整合到光果柱花草毛狀根基因組中，為轉(zhuǎn)基因毛狀根（圖6）。

2.3 毛狀根原生質(zhì)體制備最佳酶解條件的摸索

根據(jù)表2進(jìn)行了不同纖維素酶和離析酶濃度及酶解時(shí)間為因素的正交試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同試驗(yàn)組合均可以分離出有活力原生質(zhì)體，但各組合分離毛狀根原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力存在顯著差異（表3）。根據(jù)極差（R值）結(jié)果，酶解時(shí)間（R=0.858）對(duì)毛狀根原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響最大，而纖維素酶（R=0.439）和離析酶（R=0.428）的濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響較小且相近。纖維素酶和離析酶的最佳濃度均為2.5%；隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量呈先增大后減小的趨勢(shì)，酶解時(shí)間在8 h時(shí)達(dá)到最佳產(chǎn)量（表3）。酶解時(shí)間（R=27.193）對(duì)毛狀根原生質(zhì)體活力的影響最大，離析酶（R=9.122）的濃度也對(duì)原生質(zhì)體活力有較大影響，而纖維素酶（R=3.266）對(duì)原生質(zhì)體活力的影響最小，最佳濃度為2.5%。隨著離析酶濃度和酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體活力呈先增大后減小的趨勢(shì)，分別在2%和8 h時(shí)達(dá)到最佳活力（表3）。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果和原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的均值乘積（k1×l1），光果柱花草原生質(zhì)體制備的最佳酶解條件是正交試驗(yàn)組合7［纖維素酶濃度2.5%（水平3），離析酶濃度2%（水平2），酶解時(shí)間8 h（水平2）］。此時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量為2.745×105個(gè)·g-1，原生質(zhì)體活力為91.02%（表3和圖7）。

3 討論

發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因體系操作簡(jiǎn)單，高效快捷，因此已在多種植物被用于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因毛狀根［11］。發(fā)根農(nóng)桿菌種類、外植體類型、發(fā)根農(nóng)桿菌菌液濃度以及培養(yǎng)環(huán)境等因素都會(huì)對(duì)毛狀根的誘導(dǎo)產(chǎn)生影響。在選擇菌株時(shí)，需要考慮植物物種的差異，并進(jìn)行菌株篩選試驗(yàn)以確保最佳效果［12］。因此，本研究比較了4個(gè)發(fā)根農(nóng)桿菌菌株誘導(dǎo)光果柱花草產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因毛狀根的效果，發(fā)現(xiàn)在添加8 mg·L-1潮霉素B的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，菌株K599是誘導(dǎo)毛狀根的最佳菌株（圖3）。而此前本課題組已建立的細(xì)莖柱花草毛狀根體系中［9］，菌株K599不能誘導(dǎo)細(xì)莖柱花草產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因毛狀根。這表明對(duì)于柱花草屬兩個(gè)不同種，能誘導(dǎo)它們產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因毛狀根的菌株存在差異，這可能與不同菌株的侵染性、生長(zhǎng)速度及Ri質(zhì)粒的多樣性有關(guān)［12］。

篩選壓是保證毛狀根陽性率的關(guān)鍵因素，其中潮霉素B相較于其他抗生素類和除草劑類篩選劑具有篩選時(shí)間短和假陽性率低等優(yōu)點(diǎn)［13］。本研究在毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同濃度的潮霉素B作為篩選壓，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在潮霉素B濃度為8 mg·L-1和12 mg·L-1的條件下，菌株K599和MSU440誘導(dǎo)的毛狀根陽性率均達(dá)到100%，但是12 mg·L-1潮霉素B會(huì)導(dǎo)致毛狀根誘導(dǎo)率顯著降低（圖3）。因此，培養(yǎng)基中添加8 mg·L-1潮霉素B是誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因毛狀根的最佳篩選壓。豆科植物中大豆［14］、紫花苜蓿［15］已建立了以潮霉素B作為篩選壓的毛狀根轉(zhuǎn)基因體系。在大豆中，20 mg·L-1潮霉素B是子葉為外植體誘導(dǎo)毛狀根體系的最佳篩選壓；而在紫花苜蓿中，使用5～8 mg·L-1潮霉素B篩選以葉片為外植體誘導(dǎo)的毛狀根。這種篩選壓濃度差異可能與不同植物物種以及外植體類型對(duì)潮霉素B的耐受度不同有關(guān)。

原生質(zhì)體是指細(xì)胞壁被酶或機(jī)械去除的植物細(xì)胞，是一種可用于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和合成生物學(xué)研究的多功能系統(tǒng)［16-17］。此外，原生質(zhì)體還可以用于候選基因的功能研究，如亞細(xì)胞定位、體內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用驗(yàn)證、代謝產(chǎn)物分析、CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的瞬時(shí)表達(dá)等［18-22］。原生質(zhì)體制備受多種因素的影響，如酶的濃度、滲透壓、酶解時(shí)間以及離心速率等［23］。根據(jù)本研究結(jié)果，酶解時(shí)間是影響光果柱花草轉(zhuǎn)基因毛狀根制備原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的最重要因素，這可能與其原生質(zhì)體大小相關(guān)。本課題組之前已建立圭亞那柱花草利用子葉制備原生質(zhì)體的體系，其最佳酶解時(shí)間為16 h，獲得的原生質(zhì)體大小約為20 μm［10］。而本研究利用光果柱花草轉(zhuǎn)基因毛狀根制備原生質(zhì)體的最佳酶解時(shí)間為8 h（表3），原生質(zhì)體小于10 μm（圖7）。相對(duì)于圭亞那柱花草子葉原生質(zhì)體，光果柱花草毛狀根原生質(zhì)體更小，需降低酶解時(shí)間，以防止由于酶解時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致原生質(zhì)體的結(jié)構(gòu)被破壞。此外，利用圭亞那柱花草子葉制備原生質(zhì)體的最佳纖維素酶濃度為1.5%，離析酶濃度為1.25%［10］。而本研究利用光果柱花草毛狀根制備原生質(zhì)體的最佳條件為2.5%纖維素酶和2%離析酶（表3），這可能是由于毛狀根中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)更為致密，需要更高的酶濃度。與利用非轉(zhuǎn)基因柱花草子葉制備原生質(zhì)體的產(chǎn)量（4.56×106個(gè)·g-1）及活力（92.27%）［10］相比，利用轉(zhuǎn)基因毛狀根制備原生質(zhì)體的產(chǎn)量（2.745×105個(gè)·g-1）及活力（91.02%）（表3）相對(duì)較低。但是，本研究基于轉(zhuǎn)基因毛狀根制備的原生質(zhì)體100%為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，利用該體系分析候選基因功能更具優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié)論

本研究建立了一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的光果柱花草轉(zhuǎn)基因毛狀根體系，在最優(yōu)菌株K599誘導(dǎo)和最佳篩選壓8 mg·L-1潮霉素B條件下，誘導(dǎo)率為23.33%，陽性率達(dá)100%。同時(shí)，本研究還建立了一種利用轉(zhuǎn)基因毛狀根制備原生質(zhì)體的體系，在2.5%纖維素酶、2%離析酶及8 h酶解時(shí)間的條件下，可以獲得最高的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）

收稿日期：2024-01-13；修回日期：2024-03-21

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 323CXTD387;No. 322RC771）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No. 32371769）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（No. 1630032022023）資助

作者簡(jiǎn)介：

孫昊（1999-），男，漢族，河南安陽人，碩士研究生，主要從事熱帶牧草轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，E-mail：sunh0713@163.cm；*通信作者 Author forcorrespondence，E-mail：liupandao@foxmail.com；luoljd@126.com