王帥 鄭霞林 羅聰 何新華 王小云
關(guān)鍵詞:芒果花;動態(tài)頂空吸附;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS);揮發(fā)性成分
芒果,也作杧果(Mangifera indica L.),屬漆樹科,是四大熱帶水果之一,被譽為“熱帶果王”,經(jīng)濟價值高[1-2]。芒果是典型的蟲媒作物,授粉者缺乏是芒果結(jié)實率低的原因之一[3-4]。芒果主要花期常遇低溫陰雨,授粉昆蟲減少,導(dǎo)致無蟲授粉或授粉不良,致使其結(jié)實率下降。此外,芒果花期易受芒果扁喙葉蟬(Idioscopus incertus Baker)、芒果橫線尾夜蛾(Chlumetia transversa Walker)、芒果天蛾(Compsogene panopus Cramer)等食花害蟲為害[5]?;ǘ鋼]發(fā)物在吸引昆蟲授粉及為害方面有重要作用[6-7]。
花朵揮發(fā)物組成復(fù)雜,同種植物不同品種間花朵揮發(fā)物的種類和含量有一定差異。如經(jīng)鑒定和分析,酥梨、雪花梨和鴨梨的花朵揮發(fā)成分分別為51、42 和41 種,且3 個品種中共有的20 種成分的相對含量也不同[8]。藍莓品種Elliott 的花朵釋放的順-3-乙酸己烯酯顯著高于Duke 和Bluecrop 兩個品種[9]。此外,不同品種間不同含量組分的差異也影響昆蟲的選擇行為。研究表明,蜜蜂辨別花朵的能力與花朵揮發(fā)物化合物的濃度、數(shù)量以及相似性有關(guān)[10]。如草莓品種Sonata 的花香揮發(fā)物總量高于Honeoye 和Darselect,且野外條件下蜜蜂對Sonata 的訪問率高于Honeoye 和Darselect[11]。豆花薊馬(Megalurothrips sjostedti)對不同品種豇豆花揮發(fā)物的偏好差異顯著,雌蟲對Ken Kunde 1 吸引,對Katumani 80 趨避,對Ex-Luanda 無明顯偏好;而雄蟲對Machakos 66表現(xiàn)趨避[12]。田間試驗發(fā)現(xiàn)丁香羅勒花序上引誘的綠盲蝽(Apolygus lucorum)數(shù)量顯著高于其他6 個羅勒品種[13]。由此可知,研究同種植物不同品種花朵揮發(fā)物的成分和含量差異對解析訪花昆蟲和花期害蟲的行為選擇偏好性有重要參考意義。
已報道的芒果花組分研究多利用溶劑浸提法分析其藥理作用,不利于分析芒果花的揮發(fā)性組分。芒果花的水煎液組分主要有甾體、三萜、酚類和黃酮類化合物[14]。芒果花的二氯甲烷浸提液中共鑒定出揮發(fā)性化合物28 種,其中含量最多的6 種為順式-羅勒烯、α-蒎烯、β-石竹烯、反式-羅勒烯、α-律草烯、β-蒎烯[15]。TOLKE 等[16]在芒果花蒸餾精油中鑒定出21 種化合物,含量最高的5種依次為萜品油烯、古蕓烯、芹子烯、α-蒎烯、3-蒈烯。然而,不同品種芒果花朵揮發(fā)物的比較分析較為缺乏。JESUS 等[17]用動態(tài)頂空吸附法對Carabao 芒果花揮發(fā)物進行抽提,用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定出芒果花在盛花期釋放約138種揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì),檢測結(jié)果顯示主要揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)是烴類、醇類、酯類,分別占總揮發(fā)性物質(zhì)的31.9%、16.7%、10.1%,萜品油烯是最豐富的單一成分,酰胺、醚、酮、醛和羧酸是次要成分。目前關(guān)于芒果花組分分析多用浸提鑒定,對于揮發(fā)性組分的鑒定報道很少,針對不同芒果品種間花朵揮發(fā)物的成分及含量差異的研究更鮮有報道。因此,本研究以廣西大學(xué)標本園的7 個芒果品種為試驗材料,采用動態(tài)頂空吸附法抽取芒果花揮發(fā)物,采用GC-MS 技術(shù)進行檢測,通過核對標準譜庫(NIST 17.0)標準化合物的質(zhì)譜圖進行檢索比對并分析鑒定,用峰面積歸一法計算各成分的相對百分含量,比較不同芒果花揮發(fā)性成分的種類和含量差異,研究結(jié)果可對解析芒果花吸引訪花昆蟲、花期害蟲的化學(xué)物質(zhì)提供數(shù)據(jù)參考。
1 材料與方法
1.1 材料
供試植株:供試芒果品種包括桂熱82 號、臺農(nóng)1 號、四季蜜芒、金煌芒、紅芒6 號、紅象牙、凱特芒,均種植于廣西大學(xué)標本園( 22°50′N,108°17′E)。
主要儀器和設(shè)備: 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890B-5975C,安捷倫科技有限公司,美國)、色譜柱(HP-5MS,J&W Scientific,F(xiàn)olsom,美國)、大氣采樣儀QC-1S 型(北京市勞動保護科學(xué)研究所,北京,中國),無味聚乙烯塑料袋(Reynolds,美國)、吸附管(內(nèi)徑5 mm)填充200 mg 吸附劑(Porapak Q 吸附劑,80~100 目,美國Supelco 公司)。
1.2 方法
1.2.1 芒果花揮發(fā)物的收集 花朵揮發(fā)物的采集均在芒果花盛花期(采集時間見表1),開花期間不噴灑任何農(nóng)藥。芒果花揮發(fā)物的收集采用動態(tài)頂空吸附法,使用無味聚乙烯塑料袋套住芒果花(活體抽取,芒果花自然釋放狀態(tài),采集結(jié)束后不會對芒果的生長造成影響),袋子兩端留進氣口和出氣口。從大氣采樣儀產(chǎn)生的空氣,通過活性炭和填裝了Porapak Q 吸附劑的吸附管,從進氣口進入采集袋內(nèi),出氣口裝有與進氣口同等型號的吸附劑吸附植物揮發(fā)物。所有連接管均使用特氟龍軟管,進氣口、出氣口流量均為300 mL/min。采集時間為上午8:00—12:00,共收集4 h。每個芒果品種采集3 株植株,每株植株選取數(shù)量大小相似的3 個花簇,共計9 個重復(fù)。
采集結(jié)束后,用2 mL 的色譜純正己烷洗脫吸附管,將同一植株的3 根吸附管洗脫液合并到1個進樣瓶中濃縮至1 mL,洗脫樣品保存于–20 ℃冰箱,備用,檢測前用氮氣吹濃縮至100 μL。
1.2.2 GC-MS 分析 GC-MS 檢測條件:安捷倫氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,色譜柱為HP-5MS 毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣為氦氣,純度>99.99%,進樣量為1 μL,恒流不分流模式。GC工作條件:進樣器250 ℃,檢測器300 ℃,流速為1 mL/min;柱箱升溫程序:起始溫度40 ℃,保持1 min,5 ℃/min 升溫至90 ℃,保持1 min,3 ℃/min 升溫至120 ℃,保持1 min,10 ℃/min升溫至200 ℃保持1 min 結(jié)束;MS 工作條件:EI離子源,電子能量70 eV,質(zhì)子掃描范圍為50~550 amu,四級桿溫度為150 ℃,離子源溫度為230 ℃,電子倍增器電壓為1200 V。各成分通過核對標準譜庫(NIST 17.0)標準化合物的質(zhì)譜圖進行檢索比對并分析后進行定性。采取峰面積歸一法進行定量。
1.3 數(shù)據(jù)處理
經(jīng)GC-MS 分析得到的總離子流圖,對各峰經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索和NIST 17 標準質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫比對,并用峰面積歸一化法計算各成分的相對百分含量。采用One-Way ANOVA 單因素方差分析7 個品種芒果花揮發(fā)物成分之間的差異顯著性,并用多重比較(Tukey HSD)不同植物揮發(fā)物同一成分相對含量的差異。用SPSS 26.0 軟件斯皮爾曼檢驗對7 個品種芒果花揮發(fā)性成分的相對含量進行相關(guān)性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同品種芒果花揮發(fā)物總離子流圖
經(jīng)HP-5MS 安捷倫色譜柱分離、MS 檢測,得到芒果花揮發(fā)物總離子流圖,7 個品種芒果花揮發(fā)物總離子流圖有明顯區(qū)別(圖1)。各成分經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索和NIST 17.0 標準質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫比對,7 個品種種芒果花揮發(fā)物樣品中共檢出115 種揮發(fā)性組分?;衔锓N類最多的是四季蜜芒,有82 種,最少的為桂熱82 號,有46 種。紅芒6 號、金煌芒、紅象牙、臺農(nóng)1 號和凱特芒則分別有60、59、49、49 和49 種。
2.2 不同品種芒果花揮發(fā)物成分差異分析
2.2.1 芒果花揮發(fā)物不同成分種類的比較 由表2、表3 可知,7 個品種芒果花檢測出的115 種揮發(fā)性化合物中,包含了萜烯類44 種、烷烴類30種、酯類16 種、醇類16 種、酮類5 種、醛類3種、酚類1 種。相對含量范圍: 萜烯類為46.15%~89.41%、醇類為2.01%~23.58%、酯類為3.34%~14.67%和烷烴類為2.27%~13.75%。其中,α-蒎烯、3-蒈烯、β-蒎烯、β-月桂烯、莰烯、1-石竹烯、α-萜品烯、萜品油烯、β-羅勒烯、大牛兒烯D、芳香醇、2-丙基-1-戊醇、苯甲酸乙酯等較為普遍。不同品種的芒果花揮發(fā)物組分存在一定差異。
桂熱82 號花揮發(fā)物檢測出萜烯類22 種、烷烴類11 種、酯類7 種、醇類4 種、酮類1 種、醛類1 種。以上各類物質(zhì)含量依次分別為71.36%、6.03%、5.68%、15.77%、0.05%、0.03%。桂熱82 號花揮發(fā)物相對含量最高的物質(zhì)是α-蒎烯(57.81%),其次是芳香醇、苯甲酸乙酯,這3種物質(zhì)占總揮發(fā)物成分的78.30%。
臺農(nóng)1 號花揮發(fā)物檢測出萜烯類25 種、烷烴類11 種、酯類4 種、醇類5 種、酮類3 種、酚類1 種,以上各類物質(zhì)含量依次分別為89.41%、3.71%、6.65%、2.01%、0.77%、0.01%。臺農(nóng)1號花揮發(fā)物相對含量最高的是萜品油烯為51.44%,其次為3-蒈烯、大牛兒烯D、α-蒎烯和苯甲酸乙酯,這5 物質(zhì)占總揮發(fā)物成分的78.36%。
四季蜜芒花揮發(fā)物檢測出揮萜烯類33 種、烷烴類19 種、酯類12 種、醇類11 種、酮類4 種、醛類2 種、酚類1 種,以上各類物質(zhì)含量依次分別為46.15%、13.75%、14.67%、23.58%、1.04%、0.16%、0.26%。四季蜜芒花揮發(fā)物相對含量較高的為萜品油烯、芳香醇和苯甲酸乙酯,這3 種物質(zhì)占總揮發(fā)物成分的61.60%。
金煌芒花揮發(fā)物檢測出萜烯類27 種、烷烴類16 種、酯類6 種、醇類7 種、醛類2 種,以上各類物質(zhì)含量依次分別為84.98%、2.27%、8.78%、7.55%、0.04%。金煌芒花揮發(fā)物相對含量較高的成分有3-蒈烯、萜品油烯、苯甲酸乙酯和芳香醇。這4 種物質(zhì)占總揮發(fā)物成分的78.53%。
紅芒6 號花揮發(fā)物檢測出萜烯類26 種、烷烴類14 種、酯類7 種、醇類9 種、酮類2 種、醛類1 種,酚類1 種,以上各類物質(zhì)含量依次分別為82.03%、6.44%、5.39%、4.84%、0.11%、0.01%、0.16%。紅芒6 號花揮發(fā)物相對含量最高的是3-蒈烯(55.57%),其次為D-檸檬烯、α-萜品烯、β-月桂烯、α-松油醇、萜品油烯和苯甲酸乙酯,這7種物質(zhì)占總揮發(fā)物成分的78.01%。
紅象牙花揮發(fā)物檢測出萜烯類26 種、烷烴類14 種、酯類4 種、醇類4 種、醛類1 種,以上各類物質(zhì)含量依次分別為88.12%、3.67%、4.29%、5.41%、0.23%。紅象牙花揮發(fā)物相對含量較高的物質(zhì)有萜品油烯、α-蒎烯、3-蒈烯、D-檸檬烯、1-石竹烯,這5 種物質(zhì)占總揮發(fā)物成分的78.41%。
凱特芒花揮發(fā)物檢測出萜烯類27 種、烷烴類13 種、酯類6 種、醇類3 種,以上各類物質(zhì)含量依次分別為89.13%、7.46%、3.34%、3.09%。凱特芒花揮發(fā)物含量最高的物質(zhì)為3- 蒈烯(65.61%),其次為D-檸檬烯和α-蒎烯,這3 種物質(zhì)占總揮發(fā)物成分的73.06%。
2.2.2 不同品種芒果花揮發(fā)物共有成分的比較7 個品種芒果花揮發(fā)物中含有14 種共有成分,分別為α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、3-蒈烯、α-萜品烯、D-檸檬烯、β-羅勒烯、萜品油烯、1-石竹烯、大牛兒烯D、鄰-異丙基苯、苯甲酸乙酯和2-丙基-1-戊醇,14 種共有成分總相對含量分別占桂熱82 號、臺農(nóng)1 號、四季蜜芒、金煌芒、紅芒6 號、紅象牙和凱特芒總成分相對含量的74.53%、85.31%、50.96%、85.38%、81.28%、88.04%和87.06%,且各成分在各個品種中的相對含量存在差別。3-蒈烯在7 個品種芒果花揮發(fā)物中含量較高,尤其在凱特芒和紅芒中的含量分別高達65.61%和55.57%,與其他5 個芒果品種的相對含量差異顯著;α-蒎烯在桂熱82 號中的相對含量高達57.81%,顯著區(qū)別于其他6 個品種;萜品油烯在7 個品種芒果花揮發(fā)物中的相對含量較為豐富,臺農(nóng)1 號的最高可達51.44%,其次是紅象牙(38.81%),顯著高于其他5 個品種;苯甲酸乙酯相對含量為1.57%~11.38%(表2,圖1)。由共有成分種類表明7 個品種芒果花揮發(fā)物具有一定的相似性,而由共有成分含量的差異表明這7 個品種芒果花揮發(fā)物具有一定的差異。
2.2.3 芒果花揮發(fā)物不同品種特異性成分比較不同品種芒果花揮發(fā)物含有的特異性成分有33種,其中四季蜜芒有24 種,臺農(nóng)1 號4 種,金煌芒2 種、桂熱82 號、紅芒6 號和凱特芒都是1 種,紅象牙未檢測出特異性成分,特異性成分的存在表明不同品種芒果花揮發(fā)物間具有一定的差異。四季蜜芒的特異性成分主要為對薄荷-1,3,8-三烯、(3E)-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯、依蘭烯、對二甲苯、1-異丙烯基-3-甲基苯、鄰苯二甲醚、2-羥乙基對羥基苯甲酸、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、水楊酸乙酯,臺農(nóng)1 號為1-乙基-4-異丙基苯、α-蓽澄茄油烯、環(huán)己烷、對傘花-8-醇,金煌芒為異香樹烯、苯基三甲基硅烷,桂熱82 號為松香芹酮,紅芒6 號為2,6-二甲基-1,5,7-辛二烯-3-醇,凱特芒為1,5,8-p-薄荷烯。
2.3 不同品種芒果花揮發(fā)物成分類別及相對含量
以7 個品種芒果花揮發(fā)物共有色譜峰的峰面積作相關(guān)性分析,并進行相似度評價(圖2),結(jié)果表明,7 個品種芒果花揮發(fā)物間存在一定差異,相似度最近的是四季蜜芒和金煌芒,相似度達到0.862;臺農(nóng)1 號與金煌芒、臺農(nóng)1 號與四季蜜芒、紅芒6 號與凱特芒也有較高的相似度,均達到0.800 以上,四季蜜芒與紅象牙相似度最低,僅為0.255。
3 討論
本研究采用動態(tài)頂空吸附法和GC-MS 法從7個不同芒果品種中共鑒定出115 種化合物,然而不同品種芒果花揮發(fā)性化合物的數(shù)量有所不同。JESUS 等[17]從Carabao 芒果花揮發(fā)物中鑒定出138 種揮發(fā)性成分,PANDIT 等[15]從芒果花二氯甲烷浸提液中共鑒定出28 種揮發(fā)性化合物,TOLKE 等[16]在芒果花蒸餾精油中鑒定出21 種化合物。本研究結(jié)果與已有芒果花揮發(fā)物鑒定的報道有一定差異,可能與不同品種、不同生長環(huán)境及不同揮發(fā)物提取方法有關(guān)。本研究中不同品種的環(huán)境條件相似,提取方法接近,因此,不同品種花朵揮發(fā)物組分的比較分析具有較好的參考價值。相對含量較高的芒果花和果實之間的共有和差異性的揮發(fā)物組分可能是花、果的生長發(fā)育相關(guān)的特征揮發(fā)物。例如,LIU 等[18]在5 種芒果果實揮發(fā)物中鑒定的共有成分為α-蒎烯、β-月桂烯、3-蒈烯、D-檸檬烯、萜品油烯,與本研究的芒果花共有揮發(fā)物成分相同;而LIU 等[18]在果實中鑒定的共有成分為1-己醇、對傘花烴、γ-松油烯、反式-2-己烯醛,而本研究中在芒果花揮發(fā)物中則未檢測到,可能以上物質(zhì)是果實的特征香味物質(zhì)。
花朵揮發(fā)物是影響昆蟲訪花的主要因素之一,少部分化合物可能對昆蟲的行為選擇和定位起決定性作用[19-22]。研究表明,萜烯類和芳香族類是吸引授粉者的主要揮發(fā)性化合物類別[6, 8]。本研究中,7 個品種芒果花揮發(fā)物中萜烯類相對含量較高的共有成分,如α-蒎烯、3-蒈烯、萜品油烯、β-蒎烯、β-羅勒烯、β-月桂烯、D-檸檬烯以及芳香族類的芳香醇在其他花朵中也有報道,或是吸引授粉昆蟲的優(yōu)勢組分。如茶花和茶梢的揮發(fā)物中水楊酸甲酯和芳香醇對門氏食蚜蠅(Sphaerophoria menthastri)有顯著的吸引作用[23];羅勒烯對四條小食蚜蠅(Paragus quadrifasciatus)具有明顯的引誘作用[24];疏花火燒蘭(Epipactisveratrifolia)釋放的α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯等物質(zhì),能夠吸引黑帶食蚜蠅(Episyrphus balteatus)前來產(chǎn)卵,從而有助于其傳粉[25];蜜蜂、食蚜蠅等傳粉昆蟲在釋放檸檬烯較高的甜葉菊(Steviarebaudiana)上訪問最多[26]。因此,芒果花揮發(fā)物的α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、羅勒烯、D-檸檬烯、芳香醇、水楊酸甲酯等物質(zhì)可能作為蠅類引誘劑的優(yōu)勢候選組分。
本研究中7 個品種芒果花揮發(fā)物共有色譜峰峰面積相似度差異范圍較大(0.255~0.862),或可為不同芒果品種親緣關(guān)系的鑒定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[27]。此外,花揮發(fā)物由多種復(fù)雜的揮發(fā)性化合物共同組成,一般一個或幾個重要成分占很大比例[28]。3-蒈烯是花、果重要的揮發(fā)性成分之一,研究表明3-蒈烯是蜜蜂識別油菜花的氣味物質(zhì)之一[29],是傳粉信號物質(zhì)。本研究中,3-蒈烯在凱特芒、紅芒6 號中的相對含量分別高達65.61% 和55.57%,但在桂熱82 號和四季蜜芒中分別為1.96%和2.21%,這可能與芒果品種間的遺傳差異較大有關(guān)[18]。昆蟲對不同品種花的選擇具有偏好性,不同品種芒果花主要揮發(fā)物含量的差異與訪花昆蟲的行為反應(yīng)的關(guān)系有待進一步探究。
植物主要通過特異性物質(zhì)或者是各物質(zhì)的特定比例組成變化來實現(xiàn)其揮發(fā)物的特異性[30-31]。本研究的7 個品種芒果花揮發(fā)物的特異性成分和共有成分分別為33 種和14 種,芒果花共有香味物質(zhì)組成比例不同,這種特異性成分及特定比例構(gòu)成了特有的化學(xué)指紋圖譜。訪花昆蟲的嗅覺系統(tǒng)特別敏感,能夠精確識別花朵品種特定的氣味組分[8]。如KLATT 等[11]研究發(fā)現(xiàn),在3 個草莓品種中, 蜜蜂對揮發(fā)物總含量最高的草莓品種Sonata 的訪問率最高;WRIGHT 等[10]發(fā)現(xiàn)花的不同濃度、氣味質(zhì)量、化合物數(shù)量以及相似性均會影響蜜蜂對花香的鑒別,進而影響其訪花行為。因此,不同品種芒果揮發(fā)物含量成分的差異對昆蟲訪花行為的影響有待進一步確定。
已有多個國家或地區(qū)研究表明雙翅目大頭金蠅是芒果的主要授粉類群,如中國、澳大利亞、以色列、菲律賓、孟加拉國等[3, 32-36]?;ǘ鋼]發(fā)物在引導(dǎo)傳粉者到花的過程中起著重要的作用,很多植物花朵能夠散發(fā)出高度復(fù)雜、物種特有的揮發(fā)性物質(zhì),花朵大量排放物質(zhì)的時間往往與最大傳粉者的活動時間相吻合。芒果作為典型的蟲媒植物離不開昆蟲授粉,大頭金蠅的活動時間具有明顯的日節(jié)律,與芒果花粉擴散高峰期同步,主要集中在上午[3, 37-38]。因此,后續(xù)有必要進一步分析芒果花揮發(fā)性物質(zhì)吸引大頭金蠅傳粉的化學(xué)機制,或篩選獲得較好的授粉昆蟲引誘劑。同時,需要考慮其他為害芒果花和葉的害蟲,如花薊馬、芒果扁喙葉蟬、芒果壯鋏普癭蚊等;四季蜜芒花果同期,在篩選傳粉昆蟲引誘劑時也要考慮避免加重芒果果實害蟲的為害,如橘小實蠅、芒果果肉象甲等[5, 39-40]。研究表明,月桂烯、苯甲醛、β-石竹烯對花薊馬具有引誘作用,α-蒎烯、莰烯對花薊馬具有趨避作用[41]。3-莰烯、乙酸乙酯、α-石竹烯、α-蒎烯對芒果壯鋏普癭蚊均具有引誘作用[39]。β-石竹烯對橘小實蠅雌蟲具有引誘作用,辛酸乙酯對橘小實蠅雌雄成蟲均具有引誘作用[42-43]。不同芒果品種揮發(fā)物的組分含量不同,對害蟲的吸引作用也不同,本研究結(jié)果可為探究不同品種芒果花揮發(fā)物對害蟲的行為反應(yīng)提供參考。目前芒果花期病蟲害防治多使用化學(xué)農(nóng)藥,可能會大量殺傷果園中主要的傳粉昆蟲,可以通過綜合分析傳粉昆蟲和花期害蟲的偏好性開發(fā)有針對性的引誘劑或趨避劑。因此,本研究結(jié)果對后續(xù)授粉昆蟲和食花害蟲引誘劑/趨避劑的開發(fā)具有重要的參考意義。