謝昕言,王開勝,徐翠蓉,陳俊蓉,鄧夢玲,楊建發(fā),賀君君,鄒豐才,黃建新

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,云南昆明 650201;2.玉林師范學(xué)院,廣西玉林 537000;3.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)院,云南大理 671003)

十二指腸賈第蟲(Giardiaduodenalis)、芽囊原蟲(Blastocystissp.)和畢氏腸微孢子蟲(Enterocytozoonbieneusi)是能夠造成人和動物腹瀉的常見腸道寄生蟲,且能通過食物和水源進(jìn)行傳播。通過基因分型,十二指腸賈第蟲目前共被分作9種集聚體,集聚體A和集聚體B是人畜共患集聚體,而牛通常感染集聚體E[1];芽囊原蟲共發(fā)現(xiàn)了17種基因型,牛作為芽囊原蟲的宿主之一,可感染7種基因亞型的芽囊原蟲[2],其中ST1、ST3亞型為人畜共患基因亞型[3];通過ITS分型目前將發(fā)現(xiàn)的240種畢氏腸微孢子蟲基因型分為9個組(Group1～9),其中Group1內(nèi)大部分為人畜共患基因型,但目前研究證明具有物種特異性的Group2中的部分基因型(如BEB6,BEB4,J等)也具有人畜共患潛力[4]。

而在牛養(yǎng)殖業(yè)中,通常會產(chǎn)生大量的糞便以及生產(chǎn)廢物,導(dǎo)致污染周圍水體環(huán)境,如果這些污染物中存在十二指腸賈第蟲等能人畜共患腸道寄生蟲,則會對周邊的人或動物造成感染[5]。云南省在我國的牛肉供給中占有重要地位,但關(guān)于該地區(qū)的牛十二指腸賈第蟲、芽囊原蟲以及畢氏腸微孢子蟲感染及基因型分布報道較少。本研究擬對云南省2個地區(qū)的肉牛和奶牛規(guī)模養(yǎng)殖場內(nèi)牛腸道寄生蟲感染情況以及基因型的分布進(jìn)行調(diào)查,為云南省養(yǎng)牛業(yè)的人畜共患腸道寄生蟲防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 在云南省大理市和楚雄市的奶牛養(yǎng)殖場以及肉牛養(yǎng)殖場采集新鮮牛糞便樣品共140份,其中奶牛場共采集到69份,包括犢牛35份,成年牛34份;肉牛場共采集到71份牛糞便樣品,包括犢牛14份,成年牛57份。采集后將每份糞便樣品單獨置于一次性塑封袋中,標(biāo)記樣品信息并帶回實驗室置于4 ℃冰箱保存待檢。

1.1.2 主要試劑 牛糞便樣品DNA提取試劑盒,Omega Bio-tek公司產(chǎn)品;瓊脂糖粉、dd H2O、1×TAE緩沖液,天根生化科技有限公司產(chǎn)品;2× SanTaqPCR Mix 預(yù)混液、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000,寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-1,江蘇杰瑞爾電器有限公司產(chǎn)品;臺式微量離心機Microfuge?20,貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品; Applied Biosystems SimpliAmpTM熱循環(huán)儀,賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品;電泳儀WIX-EP600,韋克斯科技有限公司產(chǎn)品;凝膠成像儀Gelview 5000,廣州博鷺騰生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 將采集到的牛糞便樣品按照糞便樣品提取試劑盒使用說明提取所采集糞便樣品中的DNA,并將DNA保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 腸道原蟲的PCR擴增

1.2.2.1 十二指腸賈第蟲bg基因的PCR擴增 參考黃玫瑰[6]的十二指腸賈第蟲β-賈第素(bg)基因引物序列。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。第1輪使用外引物G7F(5′-AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC-3′)和G7R(5′-GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC-3′),反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共35個循環(huán);72 ℃再延伸10 min。第2輪PCR使用內(nèi)引物GF(5′-GAACGAACGAGATCGAGGTCCG-3′)和GR(5′-CTCGACGAGCTTCGTGTT-3′),退火溫度為60 ℃,其他反應(yīng)條件與第1輪相同。

1.2.2.2 芽囊原蟲SSUrRNA基因的PCR擴增 根據(jù)Scicluna S M等[7]的文獻(xiàn)中給出的芽囊原蟲小亞基核糖體RNA(SSUrRNA)基因引物序列,使用RD5(5′-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′)和BhRDr(5′-GAGCTTTTTAACTGCAACAACG-3′)引物對芽囊原蟲SSUrRNA基因進(jìn)行PCR擴增和檢測,反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 45 s,57 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。

1.2.2.3 畢氏腸微孢子蟲ITS基因的PCR擴增 參照Buckholt M A等[8]的畢氏腸微孢子蟲的ITS基因擴增程序合成引物。套式PCR第1輪使用的外引物為NEBF1(5′-GGTCATAGGGATGAAGAG-3′)和NEBR1(5′-TTCGAGTTCTTTCGCGCTC-3′),反應(yīng)程序為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共35個循環(huán);72 ℃再延伸10 min。第2輪使用的內(nèi)引物為NEBF2(5′-GCTCTGAATATCTATGGCT-3′)和NEBR2(5′-ATCGCCGACGGATCCAAGTG-3′),延伸時間為40 s,其他反應(yīng)條件與第1輪相同。

1.2.3 PCR產(chǎn)物測序及序列分析 將符合預(yù)期大小的陽性PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序,測序結(jié)果進(jìn)行拼接,并于NCBI進(jìn)行Blast在線比對分析;通過MEGA7軟件中的領(lǐng)接法將NCBI數(shù)據(jù)庫中的參考序列與本研究獲得的基因序列進(jìn)行比較,構(gòu)建遺傳發(fā)育進(jìn)化樹,并利用Bootstrap的方法進(jìn)行1 000次重復(fù)驗證。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 使用分析軟件SPSS20對不同年齡階段以及不同品種的牛檢出的十二指腸賈第蟲、芽囊原蟲和畢氏腸微孢子蟲陽性率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 感染情況

2.1.1 十二指腸賈第蟲檢測結(jié)果 對140份牛糞便樣品進(jìn)行十二指腸賈第蟲bg基因套式PCR擴增,結(jié)果顯示(表1),奶牛場牛糞糞樣中共11份樣品PCR擴增后出現(xiàn)530 bp的條帶,部分電泳結(jié)果如圖1所示。所有陽性樣品均成功測序,陽性率為7.86%,所有陽性樣品序列在Blast上進(jìn)行同源性比對后相似率均在98%以上。從年齡上看,犢牛共有9份陽性樣品,成年牛共有2份陽性樣品。其中10份樣品鑒定為集聚體E,其中犢牛8份,成年牛2份;1份犢牛糞樣鑒定為集聚體A。肉牛場牛糞糞樣中均未檢出十二指腸賈第蟲。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;P.陽性對照;N.陰性對照;1.陽性樣品

表1 規(guī)?；雠＜S便樣品十二指腸賈第蟲檢測結(jié)果

統(tǒng)計學(xué)分析顯示,本研究調(diào)查地區(qū)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場中不同年齡階段的十二指腸賈第蟲陽性率差異均極顯著(P<0.01)。

2.1.2 芽囊原蟲檢測結(jié)果 芽囊原蟲的PCR檢測結(jié)果(表2)顯示,有36份樣品擴增出600 bp的陽性條帶,部分電泳結(jié)果如圖2所示。將陽性樣品進(jìn)行測序后所有樣品均成功測序,經(jīng)Blast同源性比對后均在98%以上,陽性率為25.71%。奶牛場共檢出20份為陽性,其中犢牛8份,成年牛12份;肉牛場共檢出16份為陽性(犢牛4份,成年牛12份)。將陽性樣品序列在NCBI中Blast比對后,共6份鑒定為ST5,其中奶牛場犢牛2例,成年牛2例,肉牛場成年牛2例; 28例鑒定為ST10,其中奶牛場犢牛5例,成年牛10例,肉牛場犢牛2例,成年牛11例; 3例鑒定為ST14,其中奶牛場犢牛1例,肉牛場犢牛2例。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),云南部分地區(qū)規(guī)?；ｐB(yǎng)殖場中不同年齡階段牛以及不同養(yǎng)殖場的芽囊原蟲陽性率差異均不顯著(P>0.05)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;P.陽性對照;N.陰性對照;1.陽性樣品

表2 規(guī)模化牛場牛糞便樣品芽囊原蟲檢測結(jié)果

2.1.3 畢氏腸微孢子蟲檢測結(jié)果 通過PCR擴增共有12份樣品在畢氏腸微孢子蟲ITS基因擴增出392 bp陽性條帶,部分電泳結(jié)果見圖3。畢氏腸微孢子蟲檢測結(jié)果如表3所示,所有陽性樣品均成功測序,經(jīng)Blast同源性比對后均在97%以上,陽性率為8.57%,其中奶牛場共檢出11份陽性(犢牛10份,成年牛1份),肉牛場共1份成年牛牛糞檢出陽性。將陽性樣品測序后經(jīng)Blast比對后共11例鑒定為BEB4型,其中奶牛場犢牛10例,成年牛1例;1例肉牛場成年牛鑒定為J型。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),云南部分地區(qū)規(guī)?；ｐB(yǎng)殖場中不同年齡階段與不同養(yǎng)殖場牛的畢氏腸微孢子蟲陽性率差異均極顯著(P<0.01)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;P.陽性對照;N.陰性對照;1、2.樣品

表3 規(guī)?；雠＜S便樣品畢氏腸微孢子蟲檢測結(jié)果

2.2 進(jìn)化樹的構(gòu)建

2.2.1 十二指腸賈第蟲測序結(jié)果 基于十二指腸賈第蟲bg基因構(gòu)建進(jìn)化樹,由進(jìn)化樹(圖4)可見:集聚體E陽性樣品與意大利流行蟲種(KR075939)位于同一分支上,說明與本研究中的十二指腸賈第蟲親緣關(guān)系較近;集聚體A陽性樣品與MZ822159位于同一分支上,說明二者親緣關(guān)系較近。

●.本研究中所獲得的序列●.The sequence obtained in this study

2.2.2 芽囊原蟲測序結(jié)果 基于芽囊原蟲SSUrRNA構(gòu)建進(jìn)化樹,進(jìn)化關(guān)系(圖5)顯示,鑒定為ST5基因型陽性的樣品與伊朗流行蟲種(MN315647)、德國流行蟲種(MK801383)以及菲律賓流行蟲種(KP233725)位于同一分支,有較為相近的親緣關(guān)系,鑒定為ST14基因型的樣品與孟加拉國流行蟲種(MN338087)、伊拉克流行蟲種(LT594969)處于同一分支,關(guān)系較為接近;鑒定為ST10基因型樣品與馬來西亞流行蟲種(MG831489)位于同一分支上,關(guān)系較為接近。

●.本研究中所獲得的序列●.The sequence obtained in this study

2.2.3 畢氏腸微孢子蟲測序結(jié)果 基于畢氏腸微孢子蟲ITS基因構(gòu)建進(jìn)化樹,由進(jìn)化樹(圖6)可知,檢測為BEB4基因型的樣品與中國流行蟲種(MH732750 、OK393647)的親緣關(guān)系較為接近,檢測為J基因型的樣品與中國流行蟲種(AF135837、OK393646、MN704931)親緣關(guān)系較為接近。

●.本研究中所獲得的序列●.The sequence obtained in this study

3 討論

3.1 牛腸道3種原蟲的檢測結(jié)果分析

本研究調(diào)查的規(guī)?；鍪改c賈第蟲總感染率為7.86%(11/140),其中犢牛的陽性率為16.33%,(8/49),高于成年牛的陽性率3.30%(3/91),且根據(jù)卡方檢驗可知,不同年齡之間十二指腸賈第蟲陽性率差異極顯著(P<0.01);Meng X Z等[9]對中國地區(qū)的牛十二指腸流行情況進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)中國牛群存在普遍的十二指腸賈第蟲的感染,且不同季節(jié)、不同地區(qū)的感染率有顯著差異;Trout J M等[10]發(fā)現(xiàn)犢牛的十二指腸賈第蟲感染率要高于成年牛。本研究的結(jié)果與前人的研究相符,說明牛十二指腸賈第蟲的感染可能與牛的年齡有關(guān),這可能是由于犢牛尚在發(fā)育階段,抵抗力較成年牛較弱,因此更容易被感染。而本研究中肉牛場尚未檢測出十二指腸賈第蟲陽性樣品,仍需更多研究對該地區(qū)肉牛場進(jìn)行十二指腸賈第蟲檢測。

本研究中的牛芽囊原蟲的總感染率為25.71%(36/140),其中犢牛的芽囊原蟲陽性率為22.45%(7/49),成年牛陽性率為27.47%(3/91),雖然成年牛的陽性率略高于犢牛陽性率,但卡方檢驗結(jié)果顯示不同年齡之間芽囊原蟲陽性率并不顯著(P>0.05),說明本研究中的牛芽囊原蟲陽性率與牛的年齡無關(guān);奶牛場的芽囊原蟲陽性率為28.99%(20/69),肉牛場的芽囊原蟲陽性率為24.22%(16/71),卡方檢驗結(jié)果顯示不同養(yǎng)殖場之間芽囊原蟲的陽性率也不顯著(P>0.05),說明兩者之間并無關(guān)系,研究結(jié)果與普麗花等[11]和王莎莎[12]的研究結(jié)果一致,這可能說明芽囊原蟲對任意年齡以及品種的牛均易感。

本研究調(diào)查云南省兩個地區(qū)牛場畢氏腸微孢子蟲的總感染率為8.57%(12/140),調(diào)查結(jié)果低于世界范圍的畢氏腸微孢子蟲陽性率5.00%[13]。從不同年齡段來看,犢牛的畢氏腸微孢子蟲陽性率為20.41%(10/49),高于成年牛陽性率(2.20%,2/91),經(jīng)卡方檢驗可知,不同年齡段牛的畢氏腸微孢子蟲感染率差異極顯著(P<0.01),這可能說明所調(diào)查地區(qū)牛畢氏腸微孢子蟲的流行與牛的年齡有關(guān),且年齡越小越容易被感染,這可能與犢牛的抵抗力較弱有關(guān)。從不同類型養(yǎng)殖場來看,奶牛場的畢氏腸微孢子蟲陽性率為15.94%(11/69),高于肉牛場陽性率(1.41%,1/71),且經(jīng)過卡方檢驗可知該地區(qū)不同類型養(yǎng)殖場的陽性率差異極顯著(P<0.01),這可能說明奶牛相較于肉牛更容易感染畢氏腸微孢子蟲,也可能說明所調(diào)查的奶牛養(yǎng)殖場周圍環(huán)境或水源存在污染。

3.2 腸道3種原蟲基因分型情況以及對人感染風(fēng)險分析

本研究共在云南省2個地區(qū)養(yǎng)殖場的牛糞中檢測出集聚體A和集聚體E 2種十二指腸賈第蟲基因型,其中以集聚體E為主,且占總陽性數(shù)的90.91%(10/11),集聚體A占總陽性數(shù)的9.09%(1/11)。十二指腸賈第蟲又包括9種集聚體,其中集聚體A、B為人獸共患型集聚體,對人及多種哺乳動物易感,集聚體E是牛、羊家畜中最常感染的集聚體[14]。我國牛賈第蟲感染以集聚體A和E的感染為主,其中E為優(yōu)勢感染基因型。本研究的感染情況檢測結(jié)果與前人的研究結(jié)果相符。集聚體A作為人畜共患型集聚體能夠感染絕大部分脊椎動物包括人類,被認(rèn)為是最重要的人畜共患集聚體[15],感染十二指腸賈第蟲集聚體A的患者通常會出現(xiàn)間歇性腹瀉的癥狀,嚴(yán)重者可能因腹瀉引起脫水[16];而近期也有研究稱在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了集聚體E型,這可能說明之前被認(rèn)為具有宿主專一性的十二指腸賈第蟲集聚體型也存在人畜共患的可能性[17]。

本研究中共檢測出3種芽囊原蟲SSUrRNA基因型(ST5、ST10、ST14),其中優(yōu)勢基因型為ST10,與付寅等[18]的研究結(jié)果相符合。目前共發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲的17種基因型,不同的基因型在不同類型的宿主中有明顯的分布差異[19]。牛和人都是芽囊原蟲的宿主之一, 兩者可共同感染ST1、ST3亞型,人感染后會出現(xiàn)如嘔吐、腹瀉等消化道癥狀,嚴(yán)重者甚至?xí)l(fā)燒[20]。雖然本次研究中所鑒定出的基因型目前并未發(fā)現(xiàn)能夠感染人類,但已經(jīng)有報道指出?？蓴y帶芽囊原蟲的人畜共患基因型,例如Chen H等[21]在中國黑龍江省人與家畜芽囊原蟲的流行病學(xué)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)牛與人之間存在共患亞型;Abdo S M等[22]在埃及北都對牛、羊等家畜以及人類感染的芽囊原蟲基因亞型進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)這些不同基因型的芽囊原蟲間具有密切的進(jìn)化關(guān)系,這可能說明牛、羊等家畜感染的芽囊原蟲也具有人獸共患潛力,因此防控牛芽囊原蟲具有公共衛(wèi)生意義。

本研究調(diào)查共檢測出2種畢氏腸微孢子蟲ITS基因型(BEB4、J),其中BEB4型僅在奶牛場被檢測出,J型僅在肉牛場中被檢測出。畢氏腸微孢子蟲目前全球共發(fā)現(xiàn)260多種基因型,牛是畢氏腸微孢子蟲包括I、J、BEB4、BEB6等Group2基因型的主要宿主[23],目前已在牛上發(fā)現(xiàn)超過40種基因型,且存在J型、I型和BEB21型等人畜共患基因亞型的感染,而人在感染畢氏腸微孢子蟲后會出現(xiàn)腹瀉的癥狀[24]。據(jù)調(diào)查,牦牛、肉牛、奶牛均可感染基因型BEB4和J,且這兩種基因型也已經(jīng)有感染人類的相關(guān)報道[25-26],可能對畜牧業(yè)工作人員以及相關(guān)肉質(zhì)產(chǎn)品的消費者的健康造成危害,因此該地區(qū)應(yīng)當(dāng)重視對牛畢氏腸微孢子蟲的防控。

綜上所述,本研究中受調(diào)查地區(qū)的牛場中存在十二指腸賈第蟲、芽囊原蟲和畢氏腸微孢子蟲的流行,陽性率分別為7.86%,25.71%和8.57%,且檢測到了十二指腸賈第蟲和畢氏腸微孢子蟲的人畜共患基因型,因此應(yīng)當(dāng)加強調(diào)查地區(qū)牛場腸道寄生原蟲的重視,并采取有效防控措施,保障地區(qū)的公共衛(wèi)生安全。