劉 平,張 毅,劉俐君,董春霞,盧 美,侯 建,石代鈺,徐全剛,孫向東,王幼明*

(1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032;2.遵義醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,貴州遵義 563000;3.四川達(dá)州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,四川達(dá)州 635000;4.重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401123)

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌引起的牛、羊、豬、鹿、犬等哺乳動(dòng)物和人類(lèi)共患的一種傳染病[1],在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。全球范圍內(nèi)每年新增約50萬(wàn)人間病例[2],2021年我國(guó)人間感染病例達(dá)到6.9萬(wàn)例[3]。布魯氏菌病造成畜牧生產(chǎn)損失的同時(shí),嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。動(dòng)物布魯氏菌病防控是布魯氏菌病防控的關(guān)鍵,該病早期很難通過(guò)臨床癥狀進(jìn)行診斷,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)就顯得尤為重要[4]?；⒓t平板凝集試驗(yàn)(rose bengal plate test,RBT)是目前基層動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)對(duì)風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)的主要手段[5]。前期調(diào)研中發(fā)現(xiàn),基層很多實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員對(duì)不同廠(chǎng)家生產(chǎn)RBT試劑檢測(cè)結(jié)果的可靠性和一致性存疑。本研究對(duì)目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的不同廠(chǎng)家RBT試劑盒進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)其檢測(cè)效果,以期為基層動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)選擇適合的RBT試劑提供方法,為疫病流行狀況估計(jì)和疫病凈化效果等的評(píng)估分析工作提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒 競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(complement-enzyme linked immunosorbent assay,cELISA)是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的布魯氏菌病確診試驗(yàn),敏感性和特異性分別為0.95≤Se≤1和0.96≤Sp≤1[6]。參考前期研究[7],本研究選取cELISA檢測(cè)結(jié)果作為相對(duì)金標(biāo)準(zhǔn)。布魯氏菌cELISA抗體檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20221104),武漢某生物股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 參考血清 布魯氏菌抗體陽(yáng)性(批號(hào):010032001)和陰性參考血清(批號(hào):010021901),青島立見(jiàn)生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.3 臨床血清樣品 2022-2023年間,收集背景信息清楚的臨床羊血清樣品200份,均來(lái)自布魯氏菌病未免疫羊場(chǎng)。用cELISA方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),最終選擇60份布魯氏菌抗體陽(yáng)性血清和50份布魯氏菌抗體陰性血清用于5種試劑盒的比較試驗(yàn)。

1.1.4 虎紅平板凝集試驗(yàn)試劑盒 選取地方動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)在用的5個(gè)不同廠(chǎng)家的RBT試劑盒,分別命名為A、B、C、D、E。

1.2 方法

1.2.1 競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 取包被板將稀釋好的待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清分別加入到板孔中,50 μL/孔,其中陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清各加2孔;再立即加入稀釋好的單克隆抗體溶液50 μL,室溫反應(yīng)45 min;棄去孔中的溶液,每孔加入稀釋好的洗滌液300 μL,靜置1 min后,棄去洗滌液;洗滌5次后在吸水紙上拍干;加入酶標(biāo)記物100 μL,室溫反應(yīng)45 min,棄去孔中的溶液,洗滌5次;每孔加入底物顯色液100 μL,避光顯色10 min;每孔加入終止液50 μL,10 min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)定每孔OD 450 nm值。結(jié)果判斷參照說(shuō)明書(shū)建議標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 虎紅平板凝集試驗(yàn) 利用5種試劑盒分別對(duì)110份臨床血清和標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(各廠(chǎng)家試劑盒操作步驟基本一致)。試驗(yàn)前,將血清和抗原在室溫下放置30～60 min;將玻璃板上標(biāo)記被檢血清號(hào),同時(shí)設(shè)置陰性血清、陽(yáng)性血清對(duì)照;然后加相應(yīng)被檢血清0.03 mL;在被檢血清的旁邊加入虎紅平板凝集抗原0.03 mL;用滅菌的牙簽攪動(dòng)血清和抗原,使之充分混合,在5 min內(nèi)觀(guān)察結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果按照表1格式整理。

表1 檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

1.2.3 評(píng)價(jià)指標(biāo) 評(píng)價(jià)指標(biāo)包括敏感性、特異性、符合率和Kappa值。使用表1數(shù)據(jù),計(jì)算方法如下。

敏感性Se=a/(a+c);

特異性Sp=d/(b+d);

符合率=(a+d)/n;

Kappa值=[n(a+d)-(r1c1+r2c2)]/[n2-(r1c1+r2c2)][8]。

其中,符合率是指兩種檢測(cè)方法結(jié)果相一致的總和占所有檢測(cè)樣品的百分比。Kappa值用于描述兩種檢測(cè)結(jié)果的一致性。一般認(rèn)為,Kappa值≥0.75為一致性極好,0.4～0.75為中、高度一致,≤0.4認(rèn)為一致性差[9]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 原始數(shù)據(jù)用Excel整理,使用Epitool在線(xiàn)工具計(jì)算各試劑盒的符合率、敏感性和特異性及95%置信區(qū)間。用SPSS 25.0軟件計(jì)算Kappa值,對(duì)配對(duì)二分類(lèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行McNemar卡方檢驗(yàn)[10-11],比較兩樣本差異。其中,P<0.05表示有顯著性差異,P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 敏感性和特異性

結(jié)果顯示(表2),不同廠(chǎng)家的RBT試劑盒敏感性存在較大差異,其中B廠(chǎng)家的敏感性最低,為70%(95%CI,56.79%～81.15%),E廠(chǎng)家最高,為91.67%(95%CI,81.61%～97.24%)。各廠(chǎng)家試劑盒特異性差異較小,在94%～100%之間。其中A和D廠(chǎng)家的特異性為100%(95%CI,92.89%～100%)。

表2 5種試劑盒的敏感性和特異性

2.2 符合率和Kappa值

從符合率來(lái)看(表3),5種試劑盒的符合率均在80%以上,其中C、D、E廠(chǎng)家的符合率超過(guò)90%,Kappa值在0.8以上,說(shuō)明上述3種試劑盒與cELISA結(jié)果一致性較高。其中,C、E廠(chǎng)家的結(jié)果與cELISA結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表3 5種試劑盒的符合率、Kappa值和McNemar卡方檢驗(yàn)情況

3 討論

與既往研究不同[12-14],本研究著重對(duì)市面上常用的同一方法的5種試劑盒開(kāi)展評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,不同廠(chǎng)家的敏感性差異較大,E廠(chǎng)家試劑的敏感性最高,為91.67%。A、D廠(chǎng)家試劑特異性最高,均為100%。從符合率結(jié)果來(lái)看,C、D、E廠(chǎng)家試劑的符合率接近,Kappa值均在0.8以上,只有C、E廠(chǎng)家與cElisa的結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在評(píng)估布病流行狀態(tài)時(shí),我國(guó)多采用RBT初篩,再使用試管凝集或cELISA確診的垂直策略,將陽(yáng)性動(dòng)物在總體中的占比作為當(dāng)?shù)夭疾×餍新蔥15-16],但即使是垂直策略,檢測(cè)的敏感性和特異性仍不足1,對(duì)于估計(jì)疫病真實(shí)流行率有較大影響。尤其在真實(shí)流行率較低時(shí),其檢測(cè)得到的表觀(guān)流行率和真實(shí)流行率差異較大。因此,各地區(qū)在使用RBT方法開(kāi)展檢測(cè)工作之前,有必要使用本研究篩選的方法,對(duì)所用試劑盒開(kāi)展評(píng)估,了解其試驗(yàn)特性。

隨著《畜間布病防控五年行動(dòng)方案(2022-2026年)》和《全國(guó)畜間人獸共患病防治規(guī)劃(2022-2030年)》等文件和政策的落實(shí),各地大力推動(dòng)牛、羊布魯氏菌病的凈化、無(wú)疫小區(qū)和無(wú)疫區(qū)的建設(shè)。對(duì)于開(kāi)展凈化的養(yǎng)殖場(chǎng),布魯氏菌病流行率必然有從高到低的過(guò)程。在凈化階段,即使使用同一種試劑,即敏感性和特異性保持不變,但因流行率逐漸降低,其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值也會(huì)逐漸降低,陰性預(yù)測(cè)值逐漸升高,導(dǎo)致誤殺率升高。因此,在凈化初期,場(chǎng)內(nèi)流行率較高時(shí),可只選擇敏感性較高的RBT試劑進(jìn)行初篩,發(fā)現(xiàn)更多陽(yáng)性動(dòng)物,迅速降低流行率;在凈化后期,場(chǎng)內(nèi)流行率很低,可采用特異性較高的試劑或可提升特異性的垂直策略開(kāi)展檢測(cè),提高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值,降低誤殺率;或在淘汰貴重/珍稀動(dòng)物時(shí),應(yīng)采用特異性較高的方法,防止誤判,減少損失。

開(kāi)展布魯氏菌病凈化時(shí),按照本研究建立的方法,明確檢測(cè)試劑的敏感性和特異性,還可粗略估計(jì)凈化周期。假設(shè)養(yǎng)殖場(chǎng)凈化初期,布魯氏菌感染率為15%,選用的RBT試劑敏感性和特異性分別為85%和95%,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性動(dòng)物及時(shí)淘汰,則在檢測(cè)3次后,雖表觀(guān)流行率為5.35%,但真實(shí)流行率為0.44%,即可轉(zhuǎn)段進(jìn)入控制階段。

本研究有局限性,一是每種試劑只做了一個(gè)批次,不能評(píng)價(jià)同一公司同種試劑不同批次間的穩(wěn)定性;二是選用的cELISA檢測(cè)試劑敏感性和特異性不足100%,盡管不影響主要結(jié)論,但會(huì)有測(cè)量偏倚。