李 瀟,李亞杰,劉 珊,雷安民

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

卵母細(xì)胞發(fā)生發(fā)育是多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的結(jié)果,一氧化氮(nitric oxide,NO)作為一種具有自由基性質(zhì)的多功能活性分子,參與了卵泡發(fā)生、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟、卵泡排卵、卵泡黃體化以及卵泡閉鎖等重要過程。研究證明,一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)在多物種生殖系統(tǒng)中表達(dá),NO經(jīng)過cGMP/PDE/Cdc25B/MPF通路觸發(fā)多數(shù)哺乳動物卵母細(xì)胞的生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)及第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ)停滯。因此,合理利用NO對卵母細(xì)胞減數(shù)分裂發(fā)育的激發(fā)性、抑制性提高卵母細(xì)胞質(zhì)量,是一項(xiàng)值得深入研究的課題。本文就NO與卵母細(xì)胞成熟進(jìn)程的關(guān)系進(jìn)行介紹,以期為研究臨床提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的NO相關(guān)培養(yǎng)方法及藥物提供參考。

1 NO的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)信號通路

20世紀(jì)70年代后期,Murad等研究發(fā)現(xiàn)硝酸甘油這一強(qiáng)力血管舒張劑通過釋放NO氣體分子引起血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)組織環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)水平升高,促使心血管舒張,實(shí)現(xiàn)降低血壓和疏通心臟冠狀血管的生物作用。1980年,Furchgott發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一種可引起血管平滑肌舒張的彌散性物質(zhì),并將其命名為內(nèi)皮源性舒張因子(endothelium-derived relaxing factor,EDRF);直到1986年,EDRF被確認(rèn)為一氧化氮(NO),科學(xué)界正式開始了NO在心血管系統(tǒng)方面的功能研究。Furchgott等也因?yàn)殛P(guān)于NO在血管舒張中的開創(chuàng)性研究工作分享了1998年諾貝爾生物與醫(yī)學(xué)獎。現(xiàn)在,硝酸甘油作為血管擴(kuò)張類藥物被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,近年來,人們對NO在組織細(xì)胞中的研究也擴(kuò)展到了免疫、代謝、神經(jīng)和生殖等研究領(lǐng)域。

2 動物機(jī)體內(nèi)NO的來源及產(chǎn)生通路

NO通過生物體內(nèi)多種細(xì)胞類型的酶和非酶途徑產(chǎn)生。酶途徑的NO由一氧化氮合酶(NOS)催化產(chǎn)生,由于胞外NO的半衰期非常短而且NOS是一氧化氮生成過程中的限速酶,同時(shí)NO沒有專門的貯存及調(diào)節(jié)釋放機(jī)制,因此某一組織中NOS的量能線性反應(yīng)出NO的濃度水平。哺乳動物中NOS包括神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitricoxidesynthase,nNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxidesynthase,eNOS)和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitricoxidesynthase,iNOS)3種類型。nNOS和eNOS合稱為組成型(或原生型或固有型)一氧化氮合酶(constitutive nitricoxidesynthase,cNOS)。cNOS的調(diào)控機(jī)制與Ca2+濃度密切相關(guān)。誘導(dǎo)型NOS(iNOS)代表鈣非依賴性異構(gòu)體,iNOS僅被脂多糖(LPS)、白細(xì)胞介素1(IL-1)和α腫瘤壞死因子(TNF-α)[6]等細(xì)胞因子激活。NO也可以獨(dú)立于NOS在低氧和/或酸性條件下自發(fā)發(fā)生亞硝酸鹽還原作用,或由黃嘌呤氧化酶和細(xì)胞色素氧化酶c等不同酶的作用介導(dǎo)而形成。通過其他非酶途徑產(chǎn)生的NO,例如皮膚組織、食物和腸道菌來源的NO衍生物亞硝酸鹽等經(jīng)體內(nèi)外因素作用后轉(zhuǎn)化為NO加入機(jī)體NO儲備池,可以起到與酶促反應(yīng)產(chǎn)生NO類似的調(diào)控作用[7]。

NO在機(jī)體內(nèi)多組織臟器內(nèi)發(fā)揮重要的生物效應(yīng),現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)NO限速酶NOS在多種效應(yīng)細(xì)胞中存在,并由特定通路激發(fā)作用。iNOS來源的NO經(jīng)NF-κB-iNOS-NO通路,NF-κBp50和p65轉(zhuǎn)移到核,參與機(jī)體炎癥以及與細(xì)胞增殖、凋亡、衰老等細(xì)胞過程相關(guān)的多種基因轉(zhuǎn)錄[8]。在機(jī)體免疫系統(tǒng)中,NF-κB代表的轉(zhuǎn)錄因子家族成員調(diào)節(jié)iNOS基因:iNOS催化NO的產(chǎn)生,NO是在炎癥和免疫應(yīng)答中起作用的分子[9]。高濃度的NO具有普遍的免疫抑制作用,作為信號分子主要調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞的分化與效應(yīng)功能,其主要供應(yīng)途徑分別是:①T細(xì)胞內(nèi)eNOS、iNOS的表達(dá)產(chǎn)生內(nèi)源性NO;②來自于微環(huán)境中樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表達(dá)的外源性NO。此外,MAPK(ERK1/2,JNK1/2和p38)-iNOS-NO通路產(chǎn)生的NO也參與到炎癥反應(yīng)之中。eNOS來源的NO基于PI3K/AKT/eNOS/NO通路[10]、Ca2+/CaMKK或CaMKⅡ/AMPK/eNOS/NO通路、AMPK/AKT/eNOS/NO通路[11]等路徑作用于內(nèi)皮細(xì)胞影響腦缺血后適應(yīng)、血壓升降、血管生成、炎癥變化和內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度。

3 卵母細(xì)胞成熟過程

卵母細(xì)胞(oocyte)是雌性動物獨(dú)有的細(xì)胞,具有發(fā)育為完整生命個(gè)體的潛能。卵母細(xì)胞源于卵原細(xì)胞,其成熟過程可大體分為3個(gè)階段,分別為LH激增觸發(fā)減數(shù)分裂恢復(fù)引起生發(fā)泡破裂(GVBD)、經(jīng)過快速分裂發(fā)育階段停滯于第2次減數(shù)分裂中期(MⅡ)、受精作用誘導(dǎo)減數(shù)分裂完成,這期間需要多種激素和調(diào)節(jié)因子的共同參與。對人類女性而言,早在胚胎時(shí)期,女嬰一對卵巢中的卵原細(xì)胞就已陸續(xù)分裂分化并產(chǎn)生約兩百萬枚初級卵母細(xì)胞,它們繼續(xù)發(fā)育直到第1次減數(shù)分裂(meiosis Ⅰ)前期(prophase),并停滯于雙線期(diplotene)階段。在雙線期停滯期間,卵母細(xì)胞雖細(xì)胞核發(fā)育受阻,但仍在積累各種營養(yǎng)物質(zhì),儲存胚胎早期發(fā)育所需各類信息,使細(xì)胞體積不斷增大。雙線期阻滯持續(xù)時(shí)間一般較長,不同物種持續(xù)時(shí)間長短變化很大。人類卵母細(xì)胞的雙線期最短可持續(xù)約15年,即女性發(fā)育至青春期并出現(xiàn)月經(jīng);最長可持續(xù)40～50年,即女性進(jìn)入絕經(jīng)期。當(dāng)人類進(jìn)入青春期時(shí),約有40萬個(gè)初級卵母細(xì)胞被保留下來,并在排卵前促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)、促黃體生成素(LH)等生物因子的刺激下解除雙線期阻滯恢復(fù)減數(shù)分裂,進(jìn)入快速成熟期。第一次減數(shù)分裂恢復(fù)時(shí),卵母細(xì)胞細(xì)胞核膨大、核仁增大且合成活躍,稱為生發(fā)泡(germinal vesicle,GV),隨后生發(fā)泡有組織地解體破裂,這標(biāo)著卵母細(xì)胞成熟相關(guān)的減數(shù)分裂恢復(fù)。此時(shí),卵細(xì)胞由GV期(germinal vesicle)進(jìn)入生發(fā)泡破裂期(germinal vesicle breakdown,GVBD),初級卵母細(xì)胞中染色體濃縮、紡錘體形成,發(fā)育為次級卵母細(xì)胞并排出第1極體。此后,卵母細(xì)胞進(jìn)入第2次減數(shù)分裂且再次停滯于中期Ⅱ(MⅡ)。排卵后,處于MⅡ停滯期的次級卵母細(xì)胞進(jìn)入輸卵管,等待受精,若完成受精則重新恢復(fù)減數(shù)分裂,形成一個(gè)有功能活性的成熟卵細(xì)胞和2個(gè)或3個(gè)無功能的極體,受精產(chǎn)生的受精卵發(fā)育為早期胚胎直至形成新生命;若次級卵母細(xì)胞未受精則進(jìn)入多信號分子調(diào)控的衰老過程。

在卵母細(xì)胞成熟過程中,大多數(shù)初級卵母細(xì)胞尚未成熟就已退化。以家豬為例,其卵巢中存有卵原細(xì)胞110 000枚,但一生僅排卵400～2 000枚,一個(gè)發(fā)情周的排卵數(shù)為12～24枚,經(jīng)外激素刺激可增加排卵數(shù)達(dá)30～40枚。如何利用這些珍貴的卵母細(xì)胞并合理激發(fā)其生殖潛能成為了近年來的熱門議題。在人類輔助生殖方面,冷凍卵母細(xì)胞和胚胎技術(shù)可為錯(cuò)過最佳生育年齡或者患有腫瘤[12]疾病的女性提供生育機(jī)會。在家畜育種方面,卵母細(xì)胞及胚胎冷凍技術(shù)可與超數(shù)排卵、人工授精、胚胎移植等繁殖技術(shù)結(jié)合進(jìn)而提高優(yōu)良母畜的繁殖能力[13]。由于凍卵技術(shù)相對于精子冷凍技術(shù)不甚成熟,且卵母細(xì)胞冷凍及復(fù)蘇過程中影響因素較多。因此,卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)及長期保存方面需要探尋更為可靠有效的新途徑。

4 NO調(diào)節(jié)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟

4.1 NO調(diào)節(jié)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯和GVBD

在哺乳動物卵母細(xì)胞中,細(xì)胞內(nèi)的減數(shù)分裂停滯及物質(zhì)變化由多種生物因子調(diào)控,其中高水平的cAMP起著主導(dǎo)作用。在體外培養(yǎng)條件下,從有腔卵泡內(nèi)分離的卵母細(xì)胞中cAMP水平的穩(wěn)定下降與減數(shù)分裂恢復(fù)同時(shí)發(fā)生,并且這種卵母細(xì)胞的自發(fā)成熟可以通過cAMP類似物或cAMP磷酸二酯酶(PDE)抑制劑來阻止[14]。近年來大量研究表明,卵母細(xì)胞停滯在前期Ⅰ所需的高水平cAMP分別通過G蛋白偶聯(lián)受體(GPRs)通路和顆粒細(xì)胞間隙連接分別在卵母細(xì)胞中自主合成和胞間擴(kuò)散來維持。在有腔卵泡中,卵泡微環(huán)境中的顆粒細(xì)胞產(chǎn)生高水平的cAMP,并通過間隙連接擴(kuò)散到卵母細(xì)胞中。對于卵泡中的卵母細(xì)胞而言,細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白激活型受體GPR3/GPR12受生殖激素的影響提高激活型G蛋白(Gs)活性,Gs活化腺苷酸環(huán)化酶(AC)催化ATP產(chǎn)生高水平的cAMP。cAMP在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生效應(yīng)的方式是它能夠?qū)AMP依賴性蛋白激酶(PKA)激活,PKA在A激酶錨定蛋白(AKAP)的調(diào)節(jié)下定位于下游促成熟因子(MPF)的抑制蛋白(如Wee1/Myt1)的激酶附近并提高其活性,使催化亞基周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK1)磷酸化,將MPF維持在穩(wěn)定的非活性狀態(tài),導(dǎo)致雙線期減數(shù)分裂停滯。MPF是存在于卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的重要調(diào)節(jié)因子,由催化亞基周期蛋白依賴性蛋白激酶Cdk1(cdc2)和調(diào)節(jié)亞基細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1組成。MPF處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí),Wee1/Myt1使Cdk1的Thr14和Tyr15磷酸化,Cdk1與Cyclin B1結(jié)合為一無活性復(fù)合物,即前體MPF,維持卵母細(xì)胞雙線期和減數(shù)分裂中期停滯。此外,PKA(以及其他未知因素)會使雙特異性磷酸酶cdc25磷酸化且與胞質(zhì)內(nèi)蛋白螯合,從而阻止其發(fā)揮空間定位調(diào)節(jié)和使Cdk1的Thr14與Tyr15去磷酸化從而激活MPF的功能。其中,cdc25有3種亞型(A、B和C),它們都在小鼠卵母細(xì)胞中表達(dá),但cdc25B對于減數(shù)分裂的恢復(fù)是不可或缺的,對于卵母細(xì)胞停滯于第1次減數(shù)分裂不能恢復(fù)的cdc25B基因敲除小鼠而言,可通過注射cdc25B mRNA來逆轉(zhuǎn)該情況[15]。上述維持減數(shù)分裂的GPR3-Gs蛋白依賴性機(jī)制僅在有腔卵泡環(huán)境下進(jìn)行,在GPR3基因敲除小鼠中,腔前卵泡中的卵母細(xì)胞在前期Ⅰ階段仍然停滯,但在卵泡腔形成時(shí)自發(fā)恢復(fù)減數(shù)分裂。

研究表明,一氧化氮合酶eNOS、iNOS在雌性哺乳動物胚胎各個(gè)時(shí)期的卵巢表面上皮細(xì)胞、卵原細(xì)胞、卵母細(xì)胞、固縮壞死的卵原細(xì)胞和卵母細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞都有表達(dá),根據(jù)NOS的分布和NO作用廣泛的特性,推測NO作為新型的胞間/內(nèi)信使和一種不典型的遞質(zhì)參與了卵泡發(fā)育、黃體化、卵泡閉鎖、排卵等過程,包括作用卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟[16-17]。同時(shí),由于維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯的GPR3-Gs蛋白依賴性機(jī)制運(yùn)行所需的限制性條件在臨床研究中不便達(dá)成,為滿足對早期腔前卵泡和離體卵母細(xì)胞的科研培養(yǎng)要求,在培養(yǎng)液中添加一氧化氮或一氧化氮供體將有利于維持卵母細(xì)胞雙線期停滯并減少其提前衰老所帶來的損失。NO是改變卵母細(xì)胞生理的主要信號分子之一[18],一氧化氮合酶(NOS)途徑是卵周顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞產(chǎn)生大量NO的主要途徑,作為NO合成的主要限速酶,細(xì)胞中NOS濃度及分布可線性反映NO濃度分布情況。研究發(fā)現(xiàn),在哺乳動物原始卵泡發(fā)育至有腔卵泡的過程中,eNOS和iNOS多數(shù)在顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞膜層、卵母細(xì)胞和附近血管中存在,卵母細(xì)胞通過NOS介導(dǎo)途徑產(chǎn)生的NO,足以維持哺乳動物個(gè)體從出生到排卵前卵泡微環(huán)境內(nèi)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯[19]。在雙線期阻滯階段,卵泡微環(huán)境中經(jīng)由酶途徑產(chǎn)生的NO利用其高脂溶性通過間隙連接由顆粒細(xì)胞向卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移,或由卵母細(xì)胞通過NOS催化底物產(chǎn)生,維持卵母細(xì)胞內(nèi)的高水平NO。在小鼠卵泡中,顆粒細(xì)胞內(nèi)利鈉肽前體C型(NPPC)與之利鈉肽受體2(NPR2)相結(jié)合,刺激環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)合成并通過旁分泌方式進(jìn)入到卵母細(xì)胞之中;同時(shí),NO與胞內(nèi)鐵離子一起激活作為胞內(nèi)受體的顆粒狀鳥苷酸環(huán)化酶(GC)催化GTP產(chǎn)生cGMP。胞內(nèi)cGMP作為第二信使結(jié)合并抑制cAMP滅活激酶磷酸二酯酶3A (PDE3A)活性,減緩胞內(nèi)cAMP降解并保持其高濃度水平,提高GPR3-Gs蛋白依賴性機(jī)制下游效應(yīng)蛋白PKA活性,促進(jìn)細(xì)胞周期因子25B(Cdc25B)磷酸化而抑制其活性,最終實(shí)現(xiàn)促成素因子(MPF)長期穩(wěn)定。

哺乳動物生殖系統(tǒng)受到月經(jīng)周期或發(fā)情期的調(diào)節(jié),卵泡接受到的黃體生成素(LH)水平激增,LH刺激表皮生長因子(EGF)蛋白誘導(dǎo)的多種信號通路中斷,導(dǎo)致間隙連接和類固醇生成通路破壞,使得卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)細(xì)胞間通訊中斷;NO、cGMP和cAMP等在內(nèi)的多種信號分子向卵母細(xì)胞的傳輸中斷。NO水平下降主要通過減少對cAMP降解酶PDE3A活性抑制的方式參與到胞內(nèi)cAMP水平降低以恢復(fù)減數(shù)分裂的過程中。在LH/hCG誘導(dǎo)減數(shù)分裂從雙線期停滯和生發(fā)泡破裂恢復(fù)的復(fù)雜過程中,涉及3種類型的NOS,特別是iNOS的在顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)受抑制明顯。由于iNOS等途徑產(chǎn)生的NO水平下降導(dǎo)致卵母細(xì)胞產(chǎn)出cGMP減少,同時(shí)LH可去磷酸化NPPC使得NPR2失活導(dǎo)致顆粒細(xì)胞中cGMP產(chǎn)出減少,卵母細(xì)胞中cGMP水平降低解除了對PDE3A活性的抑制而促進(jìn)其對cAMP的降解。由于維持減數(shù)分裂停滯的關(guān)鍵因子cAMP水平下降,則PKA失活并與AKAPs亞基結(jié)合使其空間定位改變遠(yuǎn)離作用位點(diǎn),解除對cdc25活性的抑制。cdc25B磷酸酶去磷酸化而活性增加,有效促使MPF亞基CDK1的Thr14和Tyr15去磷酸化,激活CDK1,成熟促進(jìn)因子(MPF)雙亞基結(jié)合狀態(tài)破壞導(dǎo)致MPF去穩(wěn)定化,并在Cdc25B的微調(diào)控制作用的影響下移入細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)生發(fā)泡破裂(GVBD),哺乳動物卵母細(xì)胞退出雙線期停滯狀態(tài)進(jìn)入減數(shù)分裂期[19-20]。上述研究表明,細(xì)胞內(nèi)NO水平的降低可能誘導(dǎo)卵泡卵母細(xì)胞從雙線期停滯恢復(fù)減數(shù)分裂。在LH/hCG激增或卵母細(xì)胞從其卵泡微環(huán)境中脫離的體外培養(yǎng)條件下,NOS活性降低,卵母細(xì)胞內(nèi)NO水平降低,經(jīng)由cGMP/PDE/Cdc25B/MPF途徑介導(dǎo)的依賴于PKA失活的cdc25B的正確核遷移對于核MPF的激活和隨后的GVBD發(fā)生至關(guān)重要。

體外培養(yǎng)條件下,NO對卵母細(xì)胞的調(diào)節(jié)具有雙相性且取決于它的濃度。Anim等研究發(fā)現(xiàn),較低濃度下(0.01 mmol/L)的一氧化氮供體如硝普鈉(SNP)可誘導(dǎo)LH誘導(dǎo)的縫隙連接破壞、卵丘細(xì)胞擴(kuò)張以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性,實(shí)現(xiàn)減數(shù)分裂恢復(fù);而較高濃度(0.5 mmol/L)卻抑制體外培養(yǎng)的牛卵母細(xì)胞從雙線期停滯恢復(fù)減數(shù)分裂[21]。在科研領(lǐng)域,NO供體成功已運(yùn)用于防止小鼠、大鼠、豬、犬、牛等動物卵母細(xì)胞從雙線期停滯期提早恢復(fù)減數(shù)分裂。雖然一氧化氮在卵泡卵母細(xì)胞二倍體停滯減數(shù)分裂恢復(fù)中的作用仍有爭議,但NO在細(xì)胞中的雙相作用已有大量報(bào)道,基于一氧化氮供體和iNOS抑制劑誘導(dǎo)減數(shù)分裂恢復(fù)的研究,我們提出iNOS途徑介導(dǎo)的NO水平降低可能在哺乳動物排卵前卵母細(xì)胞減數(shù)分裂退出雙線期停滯中起重要作用的結(jié)論。關(guān)于臨床上NO雙相性的運(yùn)用,因目前仍未歸整出準(zhǔn)確的NO添加濃度與生物效應(yīng)間的函數(shù)關(guān)系,而且此結(jié)果可能受到卵母細(xì)胞所處的時(shí)間、環(huán)境、周期以及所屬物種等多種因素影響,需要更多的研究來闡明NO調(diào)節(jié)哺乳動物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂細(xì)胞周期的分子機(jī)制,實(shí)現(xiàn)NO在卵母細(xì)胞培養(yǎng)中的生產(chǎn)運(yùn)用價(jià)值。

4.2 NO參與的第2次減數(shù)分裂中期停滯(MⅡ停滯)

在多數(shù)哺乳動物發(fā)育過程中,繼GVBD之后,進(jìn)入核內(nèi)的MPF激活mos,mos是負(fù)責(zé)有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑的上游蛋白,MAPK使許多轉(zhuǎn)錄因子活化完成翻譯,卵母細(xì)胞快速通過MⅠ期,作短暫停留或不停留,在排卵前或排卵時(shí)進(jìn)入以第1極體排出為基本形態(tài)學(xué)特征的MⅡ階段,經(jīng)排卵進(jìn)入輸卵管并運(yùn)行至輸卵管壺腹部等待受精。家畜經(jīng)超速排卵處理后,從輸卵管中沖取的卵母細(xì)胞多處于該階段。若錯(cuò)過受精窗口期,卵母細(xì)胞則經(jīng)由細(xì)胞衰老介導(dǎo)的MⅡ停滯自發(fā)退出而走向凋亡。在哺乳動物(嚙齒動物、豬和牛)中,MPF的作用因發(fā)育周期變化而改變,其中MPF活性在GVBD時(shí)增加,在MⅠ完成時(shí)下降,在MⅡ再次達(dá)到高活性水平,并繼續(xù)升高直至受精[22]。其中MⅠ完成期間,MPF活性的下降不是由于CDK1的再磷酸化,而是由于細(xì)胞周期蛋白B1的降解,引起細(xì)胞周期蛋白B1降解的多泛素化是由一種稱為后期促進(jìn)復(fù)合物/環(huán)體(APC/C)的多亞基E3連接酶復(fù)合物控制的[23]。在MⅠ-MⅡ轉(zhuǎn)換期間和MⅡ阻滯時(shí),卵母細(xì)胞通過抑制APC活性的mos-MAPK-p90rsk-Emi途徑重新建立MPF活性,防止細(xì)胞周期蛋白B1降解并穩(wěn)定MPF,并在細(xì)胞抑制因子(CSF)的作用下導(dǎo)致MⅡ阻滯。

在排卵前后,哺乳動物下丘腦、垂體前部及后部均存在cNOS,推測NO可能通過調(diào)節(jié)GnRH的分泌來調(diào)節(jié)LH的分泌,也可能通過這一機(jī)制來影響卵巢類固醇的生成并刺激前列腺素的表達(dá)以促進(jìn)卵泡破裂。由于LH激增抑制iNOS表達(dá),COCs間隙連接中斷,隨之而來的NO下降導(dǎo)致卵泡內(nèi)cGMP水平降低,這允許了MAP2K1和MAPK的順序激活。MOS/MEK/MAPK信號通路通過蛋白激酶磷酸化的級聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,對維持卵母細(xì)胞的MⅡ期阻滯至關(guān)重要[24]。誘導(dǎo)原癌基因c-MOS的產(chǎn)物MOS誘導(dǎo)MEK磷酸化并提高其活性,進(jìn)一步激活MAPK,MAPK與早期有絲分裂抑制劑2(Emi2)發(fā)生磷酸化作用抑制后期促進(jìn)復(fù)合物/環(huán)體(APC/C)活性,APC/C活性降低可維持MPF穩(wěn)定?；蛞蚵涯讣?xì)胞衰老,MAPK活性耗竭會降低cAMP和Emi2水平,通過降低細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(Cdk1)的特異性磷酸化和誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白B1的降解來破壞MPF的穩(wěn)定性,不穩(wěn)定的MPF驅(qū)動哺乳動物卵母細(xì)胞自發(fā)退出MⅡ停滯。但關(guān)于MAPK3/1的耗竭原因以及下游調(diào)控機(jī)制與MPF的相互作用尚不明確,需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

MAPK激活的確切時(shí)間在各種哺乳動物中仍存在爭議。雖然人們普遍認(rèn)為MAPK途徑對卵母細(xì)胞成熟至關(guān)重要,但MAPK激活和GVBD的時(shí)間順序仍不清楚。在山羊中,MAPK在GV階段以非活性形式存在,并在GVBD之后被激活;而在牛和馬卵母細(xì)胞中,MAPK在GVBD之前被激活[25]。在嚙齒動物中,MAPK激活發(fā)生在GVBD之后[26],并在涉及MAPK抑制劑和mos基因敲除小鼠模型試驗(yàn)中表明,在沒有MAPK途徑參與的情況下卵母細(xì)胞可以恢復(fù)減數(shù)分裂和第1極體的排出,但這些卵母細(xì)胞在MⅡ期停滯的能力受損。有報(bào)告稱,MAPK3/1活性在豬和牛卵母細(xì)胞的MⅠ和MⅡ阻滯過程中達(dá)到最大值[27],Tongetal等也報(bào)告了豬卵母細(xì)胞在MⅡ停滯時(shí)表達(dá)高水平MAPK3/1活性。因此,至少在農(nóng)場動物中,認(rèn)為MAPK激活可能不是恢復(fù)雙線期停滯減數(shù)分裂所必需的,而是MⅡ阻滯所必需的,這說明MAPK3/1通過Emi2磷酸化途徑在維持MPF穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。

除MOS/MEK/MAPK信號通路影響的卵母細(xì)胞MⅡ停滯及恢復(fù)途徑外,NO參與的cGMP/PDE/Cdc25B/MPF途徑也與MⅡ停滯的恢復(fù)相關(guān)。豬卵母細(xì)胞在恢復(fù)減數(shù)分裂期間eNOS表達(dá)增加的研究證明,卵泡卵母細(xì)胞能夠產(chǎn)生足以調(diào)節(jié)自身生理效應(yīng)的NO[28]。因此,雖然來自顆粒細(xì)胞的NO、cGMP和cAMP的供給因卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)間隙連接破壞而中斷,但是卵母細(xì)胞仍能產(chǎn)生足夠的NO通過cGMP/cAMP/PKA/Cdc25B介導(dǎo)的途徑調(diào)節(jié)Cdk1的特異性磷酸化及其活性,導(dǎo)致MPF積聚,阻止MPF去穩(wěn)定化而維持MⅡ停滯;此外,經(jīng)由MAPK(ERK1/2,JNK1/2和p38)-iNOS-NO通路產(chǎn)生的NO也參與到卵母細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中。排卵后卵母細(xì)胞進(jìn)一步衰老導(dǎo)致NOS的表達(dá)下降,使得卵母細(xì)胞中的NO水平不足以維持調(diào)節(jié)Cdk1特異性磷酸化及其活性的能力,導(dǎo)致穩(wěn)定的MPF亞基游離分散,卵母細(xì)胞從減數(shù)分裂MⅡ停滯中恢復(fù)。

近年的研究也報(bào)道了NO在卵母細(xì)胞MⅡ期減數(shù)分裂細(xì)胞周期調(diào)節(jié)過程中的雙相作用,表明NO可能在不同濃度基礎(chǔ)上發(fā)揮保護(hù)作用或誘導(dǎo)卵泡凋亡的作用。NO供體如S-亞硝基、N-乙酰青霉胺(SNAP)以濃度依賴性方式防止小鼠和大鼠老年卵母細(xì)胞從MⅡ停滯中退出恢復(fù)減數(shù)分裂。低濃度NO誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)并在有腔卵泡的顆粒細(xì)胞中經(jīng)Fas-FasL系統(tǒng)介導(dǎo)刺激細(xì)胞凋亡[29];高濃度則維持牛、小鼠和大鼠卵母細(xì)胞的MⅡ期停滯?，F(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)室已使用NO供體防止小鼠和大鼠卵母細(xì)胞中MⅡ阻滯自發(fā)退出,延緩卵母細(xì)胞衰老,維持卵子質(zhì)量和發(fā)育潛力,預(yù)防染色體異常[30]。其他報(bào)告顯示,將剛排卵的卵母細(xì)胞暴露于NO供體條件下可防止透明帶溶解時(shí)間縮短,降低自發(fā)性皮質(zhì)顆粒丟失和紡錘體異常率[33]。體外實(shí)驗(yàn)研究表明,NO在大鼠[31]、牛[32]和人[33]模型中抑制顆粒/黃體細(xì)胞中雌二醇/孕酮的產(chǎn)生,而NOS抑制劑增強(qiáng)顆粒/黃體細(xì)胞的類固醇合成。同時(shí),NO可能是一種抗氧化劑,能夠減少卵母細(xì)胞中的活性氧(ROS)和過氧脂質(zhì)自由基含量,NO的人工增加有助于恢復(fù)生物學(xué)上可利用的NO與導(dǎo)致衰老的自由基的過量產(chǎn)生之間的平衡。上述研究結(jié)果支持了一定濃度的NO具有維持卵細(xì)胞的質(zhì)量、受精能力和延緩衰老的觀點(diǎn)。因此,從細(xì)胞外來源補(bǔ)充一氧化氮將有利于防止排卵后卵子衰老介導(dǎo)的M-Ⅱ停滯的自發(fā)退出以及卵子質(zhì)量的惡化。

5 結(jié)論

在現(xiàn)代生物研究和臨床醫(yī)療中,我們重點(diǎn)關(guān)注卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能和卵母細(xì)胞抗衰老以獲得更長的等待受精時(shí)間等問題。參考iNOS在哺乳動物排卵前后的強(qiáng)烈表達(dá)的研究結(jié)果以及小鼠注射iNOS抑制劑,如氨基胍(aminoguanidine,AG),并敲除eNOS基因后,其卵母細(xì)胞均不能正常發(fā)育的試驗(yàn)結(jié)果,認(rèn)為試驗(yàn)中可運(yùn)用iNOS抑制劑如氨基胍(AG)降低酶途徑產(chǎn)生的NO水平,誘導(dǎo)從卵巢卵泡中直接抽取的卵母細(xì)胞從雙線期停滯中恢復(fù),及時(shí)達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)或輔助生殖所要求狀態(tài)。在卵母細(xì)胞抗衰老問題的研究方面,有報(bào)道稱NO可能是一種抗氧化劑,能夠減少卵母細(xì)胞中的活性氧(ROS)和過氧脂質(zhì)自由基含量,并通過抑制顆粒細(xì)胞凋亡阻止卵泡閉鎖。因此,在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí),人工增加NO有助于恢復(fù)細(xì)胞在生物學(xué)上可利用的NO與導(dǎo)致衰老的自由基的過量產(chǎn)生之間的平衡。NO參與防止排卵后衰老介導(dǎo)的MⅡ停滯自發(fā)退出的一個(gè)可能機(jī)制是通過激活鳥苷酸環(huán)化酶(GC),使得cGMP的產(chǎn)生增加;另一方面,細(xì)胞內(nèi)NO水平的高低與細(xì)胞內(nèi)cGMP、cAMP、cdc25B水平的變化相關(guān)聯(lián)。因此,充分利用NO在卵母細(xì)胞成熟過程中雙相作用,維持MPF穩(wěn)定以阻止排卵后衰老介導(dǎo)的MⅡ阻滯的自發(fā)退出;在體外培養(yǎng)條件下,細(xì)胞外來源人工補(bǔ)充NO或利用NO供體將有利于防止排卵后卵母細(xì)胞衰老介導(dǎo)的MⅡ停滯的自發(fā)退出和卵母細(xì)胞質(zhì)量的惡化。

卵母細(xì)胞從雙線期停滯階段恢復(fù)減數(shù)分裂直到MⅡ停滯階段的發(fā)育過程是關(guān)乎其細(xì)胞質(zhì)量的重要階段,經(jīng)由NOS通路產(chǎn)生的NO作為重要信號分子參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂發(fā)育成熟的過程。盡管NO在減數(shù)分裂細(xì)胞周期中的調(diào)節(jié)作用在不同物種中仍存在爭議,但基于現(xiàn)有研究,合理運(yùn)用NO的雙相作用調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育,作為延長卵母細(xì)胞壽命、增加其等待受精時(shí)間的可行辦法已有一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。但是在不同物種及細(xì)胞狀態(tài)下的NO、NO供體或NOS抑制劑的參考用量及用法尚未明確,還需要更多的試驗(yàn)證據(jù)加以總結(jié),進(jìn)一步闡明NO在卵母細(xì)胞發(fā)生過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制,深入研究NO濃度、NO供體以及NOS抑制劑等在生產(chǎn)實(shí)踐中的運(yùn)用條件將有助于深刻理解卵母細(xì)胞成熟這一重要的生理過程,可為調(diào)控動物生殖和治療生殖疾病提供理論基礎(chǔ),也為人類的生殖健康維護(hù)和生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用提供重要的參考。