李倩楠,馬 園,郝陸瑤,張艷妮,郭志凱,丁玉林,杜 山,王 瑞

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室/國家級動物醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心,內(nèi)蒙古呼和浩特 010010)

棕色綠僵菌(Metarhiziumbrunneum)作為重要的生防菌之一,不僅可用于農(nóng)林害蟲的防治,還對家畜外寄生蟲的生物防治有著良好的效果[1],具有巨大的生防潛力和開發(fā)前景[2]。作為一種來源于自然界的昆蟲病原真菌,棕色綠僵菌具有不污染環(huán)境、無殘留,對人畜無害等優(yōu)點,被認為是一種環(huán)境友好型殺蟲劑。昆蟲病原真菌在侵染靶昆蟲時,分生孢子附著于昆蟲體壁,萌發(fā)為芽管或者形成附著孢[3],分泌蛋白酶和幾丁質(zhì)酶等對昆蟲體壁具有降解作用的物質(zhì)[4-8];當芽管穿透昆蟲體壁進入血腔后,在寄主體內(nèi)可以形成蟲菌體,同時進行增殖,最終形成大量的蟲菌體導(dǎo)致寄主的死亡[9-10]。由于從侵染蟲體到誘導(dǎo)其發(fā)病需要較長的時間,導(dǎo)致其生物防治時間長、見效慢,因而未能在臨床得到大規(guī)模應(yīng)用。

高效氯氰菊酯是一種擬除蟲菊酯類藥物,常用于農(nóng)業(yè)殺蟲,主要防治農(nóng)作物上發(fā)生的鱗翅目害蟲,具有強毒性。因其具有較好的環(huán)境相容性、生物活性及對人畜安全性較好而被廣泛使用,但長期使用不可避免的產(chǎn)生了一系列問題,如在污染環(huán)境的同時進入水源后具有較高生物毒性,同時也對某些益蟲產(chǎn)生一定傷害,且長期反復(fù)使用還會使害蟲產(chǎn)生大面積抗藥性。近年來不同環(huán)境中頻繁檢出擬除蟲菊酯,這也給水生生態(tài)系統(tǒng)造成重大風險。2017年歐洲暴發(fā)的氟蟲氰“毒雞蛋”事件引起了人們廣泛關(guān)注。孫玲等[11]對葉菜進行了33種農(nóng)藥殘留評估分析,結(jié)果檢出22種農(nóng)藥殘留,其中包括氯蟲苯甲酰胺、聯(lián)苯菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯等擬除蟲菊酯類?；瘜W(xué)殺蟲劑的廣泛使用導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生,而以昆蟲病原真菌為活性成分的生物農(nóng)藥已經(jīng)成為一種很有前景的替代策略。研究顯示,使用化學(xué)藥物與微生物制劑聯(lián)合使用,可有效地提高病原菌的致死速度,如低劑量聯(lián)苯菊酯對金龜子綠僵菌具有協(xié)同增效作用[12]。昆蟲病原真菌與化學(xué)殺蟲劑的聯(lián)合使用可以彌補真菌殺蟲劑作用效果相對較慢、致死率較低的缺點。鑒于此,在實驗室前期研究基礎(chǔ)上以單一棕色綠僵菌組和棕色綠僵菌與高效氯氰菊酯復(fù)配制劑組進行殺蠅蛆毒性試驗,驗證高效氯氰菊酯是否對殺蠅蛆效率有增效作用,旨在為提高棕色綠僵菌對害蟲的致死速度提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 棕色綠僵菌(Metarhiziumbrunneum),由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)研究室提供,保存于-80 ℃低溫冰箱備用。

待試蠅蛆幼蟲采自內(nèi)蒙古四子王旗健康羊只新鮮糞便。

1.1.2 試劑與溶液 高效氯氰菊酯原藥,青島潤農(nóng)化工有限公司,丙酮、吐溫-80、孢子洗脫液、生理鹽水,天津市科盟化工工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 超凈工作臺(CW-CT-27-D),蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品;全自動高壓鍋(XFH-30CA),上海天美儀拓實驗室設(shè)備有限公司產(chǎn)品;生化培養(yǎng)箱(SP-02),上海赫田科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;分析天平(AY120),島津企業(yè)管理(中國)有限公司產(chǎn)品;雙目體式顯微鏡(PXS-100),上海光學(xué)儀器六廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 高效氯氰菊酯對蠅蛆的毒力測定 將高效氯氰菊酯原藥用丙酮溶解后,用0.5%吐溫-80把原藥稀釋為0.1～12.8 mg/L的溶液(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg/L),然后采用浸漬法測定其對蠅蛆的100%致死濃度(LC100)及50%致死濃度(LC50)。試驗時,將蠅蛆3日齡幼蟲和蠅蛆6日齡幼蟲,在不同濃度藥液中浸漬5 s,然后放入培養(yǎng)皿中觀察,2 h后檢查供試蠅蛆的死亡數(shù)量。每濃度處理試蟲10只,并重復(fù)3次,并設(shè)置對照組。

1.2.2 棕色綠僵菌與高效氯氰菊酯的相容性測定

1.2.2.1 高效氯氰菊酯對棕色綠僵菌菌絲生長情況影響 將1.2.1中高效氯氰菊酯毒力測定結(jié)果中3日齡蠅蛆100%致死的濃度(LC100)為劑量,按配方配制PDA固體培養(yǎng)基,121 ℃高壓滅菌20 min,等其溫度降至50 ℃左右時加入上述劑量高效氯氰菊酯,混勻后將配制好的培養(yǎng)基倒入平板中,冷卻封口,然后4 ℃保存?zhèn)溆?。以不含高效氯氰菊酯的PDA培養(yǎng)基為對照組,在培養(yǎng)基中央接種5 μL棕色綠僵菌,在25 ℃條件下恒溫培養(yǎng),測定其21 d菌絲生長直徑。

1.2.2.2 高效氯氰菊酯對棕色綠僵菌孢子萌發(fā)率影響 用含0.05%吐溫-80的孢子洗脫液,將孢子粉配成濃度為1×107個孢子/mL的孢子懸液,按體積比1∶1加入等量既定濃度配制好的高效氯氰菊酯,將混合液滴入PDA固體培養(yǎng)基中于(25±1)℃相對濕度(95±1)%的智能恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)24 h和48 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況,芽管長度超過孢子直徑長度一半記為已萌發(fā),每個重復(fù)統(tǒng)計200個以上孢子。以加不含農(nóng)藥的孢子懸液做為對照。分別統(tǒng)計孢子萌發(fā)率。

1.2.2.3 高效氯氰菊酯對棕色綠僵菌產(chǎn)孢情況影響 將1.2.1中高效氯氰菊酯毒力測定結(jié)果中3日齡蠅蛆100%致死的濃度(LC100)為劑量,按配方配制PDA固體培養(yǎng)基,121 ℃高壓滅菌20 min,等其溫度降至50 ℃左右時加入上述劑量高效氯氰菊酯,混勻后將配制好的培養(yǎng)基倒入平板中,冷卻封口,然后4 ℃保存?zhèn)溆?。以不含高效氯氰菊酯的PDA培養(yǎng)基為對照組,在培養(yǎng)基中央接種5 μL棕色綠僵菌,在25 ℃條件下恒溫培養(yǎng),分別在第7、14、21、28天用0.5%孢子洗脫液沖洗培養(yǎng)皿,收集棕色綠僵菌的分生孢子,然后以血細胞計數(shù)板計數(shù)孢子產(chǎn)量,統(tǒng)計4個時間點的產(chǎn)孢情況。

1.2.3 棕色綠僵菌對蠅蛆毒力測定 以蠅蛆幼蟲為試驗對象,分別設(shè)置5種濃度的棕色綠僵菌分生孢子懸液處理組(1×104、1×105、1×106、1×107、1×108個/mL)和對照組(生理鹽水)。把蠅蛆幼蟲放入不同濃度的分生孢子懸液和生理鹽水中停留10 s,然后放入無菌培養(yǎng)皿中,組內(nèi)10個重復(fù),每個濃度3次重復(fù),在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,每天按時觀察幼蟲活力,統(tǒng)計死亡率。

1.2.4 棕色綠僵菌與高效氯氰菊酯復(fù)配制劑制備及對蠅蛆毒力測定 通過高效氯氰菊酯蠅蛆毒力測定結(jié)果,以及高效氯氰菊酯與棕色綠僵菌相容性情況綜合分析,以高效氯氰菊酯對3日齡蠅蛆的致死中濃度(LC50)1.42 mg/L添加高效氯氰菊酯,與棕色綠僵菌孢子懸液混合制得棕色綠僵菌-高效氯氰菊酯聯(lián)合制劑。殺蠅蛆毒性測定操作同1.2.3。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 運用Microsoft Excel 2013軟件整理試驗數(shù)據(jù),以“平均值±標準差”表示;采用SPSS 21.0軟件進行顯著性檢驗,P>0.05表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著。蠅蛆死亡率在組間作2檢驗分析,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 高效氯氰菊酯對蠅蛆毒力的測定結(jié)果

通過高效氯氰菊酯對不同日齡蠅蛆毒力試驗發(fā)現(xiàn),高效氯氰菊酯對3日齡和3日齡蠅蛆的LC50分別為1.42 mg/L、3.43 mg/L,LC100分別為3.06 mg/L、7.26 mg/L。與6日齡蠅蛆相比,3日齡蠅蛆對高效氯氰菊酯更為敏感(表1)。

表1 高效氯氰菊酯對蠅蛆毒力的測定結(jié)果

2.2 棕色綠僵菌與高效氯氰菊酯的相容性測定

2.2.1 高效氯氰菊酯對棕色綠僵菌菌絲生長情況的影響結(jié)果 在高效氯氰菊酯對棕色綠僵菌菌絲生長是否產(chǎn)生影響的試驗中,對添加高效氯氰菊酯和未添加高效氯氰菊酯作用下的PDA固體培養(yǎng)基上菌絲生長情況進行了比較,結(jié)果見表2。結(jié)果顯示菌絲生長情況差異不大,在第21天時,高效氯氰菊酯組和對照組菌絲體直徑均可達到8 cm以上。對生長到第21天的高效氯氰菊酯組和對照組進行統(tǒng)計學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)高效氯氰菊酯組菌絲體生長直徑與對照組相比差異不顯著(圖1,P>0.5)。

圖1 第21天高效氯氰菊酯組和對照組菌絲體生長直徑統(tǒng)計結(jié)果

表2 菌絲體生長直徑

2.2.2 高效氯氰菊酯對棕色綠僵菌孢子萌發(fā)率影響結(jié)果 高效氯氰菊酯對棕色綠僵菌孢子萌發(fā)率影響試驗中,對添加高效氯氰菊酯和無高效氯氰菊酯作用下的孢子萌發(fā)率進行了比較,結(jié)果見表3。結(jié)果顯示在第3天孢子萌發(fā)率均可達90%以上。

表3 孢子萌發(fā)測定結(jié)果

2.2.3 高效氯氰菊酯對棕色綠僵菌產(chǎn)孢量影響結(jié)果 在高效氯氰菊酯對棕色綠僵菌產(chǎn)孢量影響試驗中,對孢子產(chǎn)量進行了比較,結(jié)果見表4。由表4中數(shù)據(jù)可知,從時間和產(chǎn)孢量兩個因素看,兩組產(chǎn)孢量均相差較小。對第28天高效氯氰菊酯組以及對照組累計孢子產(chǎn)量進行統(tǒng)計學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)高效氯氰菊酯組的孢子產(chǎn)量與對照組差異不顯著(P>0.5)。

表4 孢子產(chǎn)量測定結(jié)果(1×107個/mL)

綜上所述,對高效氯氰菊酯組和對照組在菌絲體生長情況、孢子萌發(fā)率和孢子產(chǎn)量等方面進行比較,所得結(jié)果顯示均差異不顯著(P>0.5),表明棕色綠僵菌與高效氯氰菊酯有較好相容性。

2.2.4 棕色綠僵菌對蠅蛆毒力測定結(jié)果 棕色綠僵菌侵染蠅蛆幼蟲時,多先于頭部、尾部侵染產(chǎn)生菌絲,逐步向體中部蔓延,最后擴展至蠅蛆整個體部,表面完全被白色菌絲包裹,隨后菌絲由白色變?yōu)榫G色,蠅蛆表面被綠色顆粒狀孢子包圍,部分蠅蛆被嚴重感染后,由于棕色綠僵菌的作用未能化蛹,尾部發(fā)生潰爛,并形成“僵蟲”,導(dǎo)致死亡。

棕色綠僵菌對蠅蛆的殺滅作用結(jié)果見表5。在作用60 h時,即有蠅蛆開始死亡,死亡率與時間的增長成正比。分生孢子濃度越高,蠅蛆死亡所需時間越短,死亡率增長越快,累計死亡率也越高。當棕色綠僵菌分生孢子懸液的濃度達到1×106個/mL時,蠅蛆累計死亡率能夠達到86.7%,說明此時的濃度對蠅蛆具有良好的殺滅效果。對蠅蛆死亡率在組間作2檢驗分析可知,當分生孢子懸液濃度為1×107、1×108個/mL時,蠅蛆的累計死亡率與1×106個/mL相比差異不顯著(P>0.05),濃度增高但殺蟲效率沒有增高。濃度為1×104個/mL、1×105個/mL時殺蟲效率較低,需要較長時間才能殺滅蠅蛆。因此確定棕色綠僵菌殺滅蠅蛆的分生孢子濃度為1×106個/mL時殺蟲效果的性價比最高。

表5 棕色綠僵菌對蠅蛆的殺滅作用結(jié)果

2.2.5 高效氯氰菊酯與棕色綠僵菌聯(lián)合對蠅蛆毒力測定 高效氯氰菊酯與棕色綠僵菌聯(lián)合對家蠅幼蟲的毒力測定結(jié)果見表6,通過結(jié)果分析可知1.42 mg/L高效氯氰菊酯與棕色綠僵菌聯(lián)合使用確實可以增加棕色綠僵菌對蠅蛆的致死率,其中孢子濃度為1×108個/mL、1×107個/mL對蠅蛆的累計死亡率分別從90.0%、86.7%提高到100%;孢子濃度為1×106個/mL、1×105個/mL、1×104個/mL的累計死亡率分別從86.7%、50%、36.7%提高到93.3%、70%、63.3%。添加了高效氯氰菊酯的各孢子濃度殺蟲效果均有所提高。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)(圖2),添加了高效氯氰菊酯后比未添加高效氯氰菊酯組累計死亡率均有顯著提高,特別是低濃度組(1×105個/mL、1×104個/mL)添加高效氯氰菊酯后致死率提高較多,與單獨使用棕色綠僵菌時差異極顯著(P<0.01)。

相鄰字母之間差異顯著(P<0.05),字母相間差異極顯著(P<0.01)

表6 高效氯氰菊酯與棕色綠僵菌的聯(lián)合對蠅蛆的毒力測定結(jié)果

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),棕色綠僵菌在與高效氯氰菊酯聯(lián)合應(yīng)用時,對蠅蛆整體的防治效果更佳。通過測量棕色綠僵菌的菌絲生長情況、孢子萌發(fā)率和孢子產(chǎn)量等指標,發(fā)現(xiàn)即使在較高濃度高效氯氰菊酯的作用下,也不會對棕色綠僵菌產(chǎn)生不良影響,說明兩者相容性良好,可以一起使用。這為棕色綠僵菌與高效氯氰菊酯聯(lián)合使用提供了理論支持。聯(lián)合應(yīng)用進行生物防治可以避免單純依靠生物防治導(dǎo)致時間長、見效慢的問題。這一實踐為今后研究棕色綠僵菌的生防制劑打下了基礎(chǔ),同時也為家畜寄生蟲病的防治提供了新的選擇和方向。

試驗結(jié)果表明,與單獨使用棕色綠僵菌相比,棕色綠僵菌與高效氯氰菊酯聯(lián)合使用對3日齡蠅蛆的毒性有顯著增強,特別是添加低劑量的高效氯氰菊酯后,棕色綠僵菌對蠅蛆的致死作用更加明顯。這可能是因為低劑量的高效氯氰菊酯降低了蠅蛆對外界刺激的敏感度,從而促進了分生孢子對昆蟲體的附著。再者,高效氯氰菊酯導(dǎo)致蠅蛆的防御性結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,進而導(dǎo)致棕色綠僵菌分生孢子更容易侵入蟲體,從而提高了致死效率。觀察致死過程時,我們發(fā)現(xiàn)棕色綠僵菌感染蠅蛆可能是先從外部感染再向內(nèi)部蔓延,最后再從內(nèi)部向外擴散的過程。棕色綠僵菌最初侵染的部位常為頭部和尾部,有可能是由于這些部位比其他部位更加脆弱。對于蠅蛆幼蟲來說,低劑量的高效氯氰菊酯可以抑制幼蟲的發(fā)育,使其發(fā)育時間延長,這也會給孢子侵入幼蟲留下足夠的時間,進而提高昆蟲病原真菌的致死效率。其他研究,如球孢白僵菌和低劑量化學(xué)殺蟲劑聯(lián)用防治小菜蛾[13]、聯(lián)苯菊酯和金龜子綠僵菌的配合使用[14],以及白僵菌和氟鈴脲聯(lián)合使用對甜菜夜蛾幼蟲的毒力效果[15],這些研究表明低劑量的化學(xué)藥物與昆蟲病原真菌聯(lián)用可以降低化學(xué)藥物的使用量,并可提高生物防治效果。在此過程中發(fā)現(xiàn),由于昆蟲病原菌的存在,僅需使用低劑量甚至微量的化學(xué)藥物便可達到防控目的。這樣既減少了化學(xué)藥物用量,又能夠優(yōu)于單獨使用病原真菌或化學(xué)藥物的防控效果。此外,加入真菌還可以在一定程度上避免長期反復(fù)使用化學(xué)藥物導(dǎo)致產(chǎn)生耐藥性等若干問題。高效氯氰菊酯不會對棕色綠僵菌的萌發(fā)和生長產(chǎn)生影響,但能夠致死蠅蛆。這一研究結(jié)果解決了生物防治見效慢的問題,為今后研究棕色綠僵菌的生物防治制劑提供了新思路。在使用化學(xué)藥物與昆蟲病原真菌混合時,必須注意調(diào)整化學(xué)藥物的用量,以免對環(huán)境中的天敵產(chǎn)生影響[16]。因此,要盡可能地控制化學(xué)藥物的使用濃度。