李小鳳,謝芝勛,阮志華,李 孟,李 丹,張民秀,謝志勤,羅思思,韋 悠,謝麗基,曾婷婷,張艷芳,黃嬌玲,王 盛

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室/農業(yè)農村部中國(廣西)-東盟跨境動物疫病防控重點實驗室,廣西南寧 530001)

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)屬于正黏病毒科A型流感病毒屬,有季節(jié)性流行特點,根據病毒粒子囊膜表面血凝素蛋白(HA)和神經氨酸酶(NA)抗原差異,可分為16個HA亞型和9個NA亞型,兩兩組合成多種亞型病毒。H9N2亞型AIV屬于低致病性病毒,具有宿主廣泛、分離率高、危害持久等特點,是我國養(yǎng)禽業(yè)中流行最廣泛的禽流感病毒[1-2]。H9N2亞型AIV在流行傳播過程中,發(fā)生變異現象普遍[3-4],同時與H7N9、H10N8或H5N1人禽共患亞型流感病毒發(fā)生基因重組,衍生了新的基因型,促進了AIV重組病毒大流行的產生,威脅世界公共衛(wèi)生安全[5-6]。

疫苗免疫接種是防控禽流感的一種重要手段,但疫苗的有效性受到病毒基因變異和亞型不同限制。滅活苗在防控禽流感中使用最多,但不足之處一是滅活病毒可能不徹底,具有病毒毒性;二是滅活苗依賴雞胚生產,產量會因疫情嚴重期間雞胚不足受到限制,同時疫苗生產周期長,產生大量廢雞胚污染環(huán)境。因此,研制新型、安全高效的禽流感候選疫苗至關重要。M1蛋白位于病毒粒子內部,含量最為豐富,連接病毒囊膜,對保持病毒粒子的完整性具有重要作用,在不同亞型中保守性強[7],參與病毒生命周期重要的活動[8]。研究發(fā)現,M1蛋白參與禽流感病毒復制和轉錄[9],傳送運輸宿主細胞核和胞漿中的物質[10],在復制后期參與病毒核糖核蛋白的運輸過程等[11]。M1蛋白在不同亞型AIV中高度保守,在通用疫苗研究中是個理想的廣譜靶蛋白。本試驗通過pET-32a-M1,誘導M1重組蛋白表達,為免疫小鼠提供抗原,通過測定中和抗體和小鼠脾細胞培養(yǎng)上清多細胞因子,探討其免疫效果,為禽流感疫苗研發(fā)提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和小鼠 H9N2亞型禽流感病毒液(A/chicken/Guangxi/CWM/2019(H9N2)),廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所生物技術室保存;Balb/c小鼠購自廣東動物中心,并飼養(yǎng)在獨立送風的籠具中。

1.1.2 主要試劑 Gene JET RNA Purification Kit,美國英杰生命技術公司產品;完全弗氏佐劑,Sigma公司產品,載體pMD-18T和pET-32a、連接酶T4 DNA、限制性內切酶NotⅠ與BamH Ⅰ,感受態(tài)細胞DH5α與BL21,寶生物工程(大連)有限公司產品;10孔蛋白電泳預制膠(15%)、DAB顯色液,北京索萊寶科技公司產品;His標記小鼠源單克隆抗體、HRP標記山羊抗鼠IgG(H+L),武漢三鷹技術公司產品;His標簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白),北京康為世紀公司產品。

1.1.3 主要儀器 微量核酸測定儀(NanoDrop2000),賽默飛世爾公司產品;凝膠成像分析儀(Gel DocTMXR+),美國Bio-Rad公司產品;潔凈工作臺(SG404),北京東聯哈爾儀器公司產品;振蕩培養(yǎng)箱(MQT-60R),上海旻泉儀器公司產品;倒置熒光顯微鏡(ECLIPSETi2-U),日本Nikon公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成和編碼區(qū)序列擴增 參考本實驗室A/chicken/Guangxi/CWM/2019(H9N2)毒株已測得的M1基因編碼區(qū)序列,通過Prime 5.0軟件設計特異性引物,并添加酶切位點,用于PCR擴增。上游引物序列(5′-3′):CCGGAATTCATGAGCCTGCTGACCGAAGT(下劃線為EcoR Ⅰ酶切位點);下游引物序列(5′-3′)ATAAGAATGCGGCCGCTTATTTAAAGCGC-TGCAGC(下劃線為NotⅠ酶切位點),引物由廣州睿博公司合成。

1.2.2 病毒RNA抽提與M1基因編碼區(qū)擴增 參照Gene JET RNA Purification Kit抽提試劑盒說明書提取A/chicken/Guangxi/CWM/2019(H9N2)病毒RNA,后用TaKaRa反轉錄試劑反轉成cDNA。

以合成的cDNA為模板,擴增M1基因,總反應體系為50 μL:2×TransTaq-T PCR Super Mix 25 μL,上、下游引物各1 μL(引物濃度10 μmol/L),cDNA模板4 μL,無核酸酶水補足50 μL。反應程序:95 ℃預變性3 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共34個循環(huán);72 ℃終延伸5 min。PCR反應產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。切膠回收目的條帶后連接到pMD18-T載體,轉化至DH5α感受態(tài)細胞,雙酶切鑒定陽性菌落,并送給華大公司測序,比對完全準確的質粒命名為T-M1,置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 表達載體的構建 參照EcoR Ⅰ和NotⅠ內切酶酶切方法,將pET-32a載體和T-M1質粒進行雙酶切,50 μL酶切體系,37 ℃反應4 h,酶切產物經1%瓊脂糖凝膠分離,回收目的片段,載體與目的片段按照1∶3的比例,16 ℃連接過夜,最后將連接產物轉入BL21感受態(tài)細胞,涂板過夜培養(yǎng),選取單菌落進行雙酶切及測序驗證,正確質粒命名為pET-32a-M1。

1.2.4 目的蛋白誘導表達與可溶性分析 將測序正確的陽性菌落進行擴大培養(yǎng),按1%比例接種于50 mL LB肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)至OD值在0.6～0.8時,加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L,37 ℃繼續(xù)誘導培養(yǎng)6 h。4 000 r/min離心5 min,收集菌體,PBS洗滌沉淀2次,加入適量RIPA細菌裂解液與PMSF,重懸菌體,混勻后置于冰上裂解30 min,超聲破碎至清亮,取混合液(總蛋白),離心后取上清液(可溶性蛋白)和沉淀(不溶性蛋白)進行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色,清水脫色后分析蛋白存在形式。

1.2.5 重組蛋白Western blot鑒定 蛋白混合液進行SDS-PAGE分離后,通過轉膜儀,按照“三明治”狀的方法將蛋白轉印至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉4 h后,加入His標記的小鼠單克隆抗體(1∶5 000),于4 ℃孵育過夜,棄去一抗,PBST洗膜4次,加入HRP標記山羊抗鼠二抗(1∶2 000),室溫孵育1 h,PBST洗膜4次,加入DAB增強型試劑避光顯色1～5 min,通過Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照。

1.2.6 M1重組蛋白免疫小鼠及ELISA檢測血清IgG抗體水平 先將M1蛋白與完全弗氏佐劑混勻,充分乳化。取6～8周齡小鼠10只平均分成2組,一組腹腔注射M1蛋白,1.0 mL/只(濃度為100 μg/mL),另一組注射等體積PBS和完全弗氏佐劑混合液。間隔14 d,第2次免疫,14 d后眶靜脈叢采血分離血清,血清37 ℃靜置1 h后,再4 ℃靜置過夜,4 ℃、3 000 r/min離心10 min,收集小鼠血清,分裝后標記,置-20 ℃保存。ELISA方法如下:

(1)純化后的M1蛋白用ELISA包被液稀釋到10 μg/mL,按照100 μL/孔分到96孔ELISA板,4 ℃放置過夜

(2)用PBST洗板,200 μL/孔,洗3遍,并拍干。用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉,100 μL/孔,37℃孵育1 h。

(3)洗板同上,用PBST稀釋小鼠血清,從1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶7 000、1∶8 000、1∶9 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶30 000、1∶40 000、1∶50 000、1∶60 000、1∶70 000、1∶80 000、1∶90 000到1∶100 000。每個濃度重復3個孔,100 μL/孔,同時用陰性小鼠血清設置對照,空白對照用PBST孵育,37 ℃孵育1 h。

(4)將板洗3遍,用PBST稀釋二抗(羊抗鼠IgG)到1∶4 000,100 μL/孔,37 ℃孵育1 h。

(5)將板洗3遍,加入100 μL/孔顯色液,室溫避光放置10 min,加入50 μL/孔終止液。

(6)酶標儀測定OD 450 nm值,陽性血清OD值(P)/陰性學清OD值(N)>2的最大稀釋度為小鼠血清IgG抗體效價。

1.2.7 小鼠脾細胞培養(yǎng)上清多細胞因子Luminex檢測方法

(1)將小鼠處死,泡在75%乙醇中5 min,剪開小鼠腹部,用鑷子取出脾臟。

(2)脾臟置于100 μm細胞篩中,加入2 mL DMEM培養(yǎng)液,10 mL注射器頭充分研磨脾臟。

(3)加入3 mL DMEM清洗注射器和細胞篩,并把所有濾出液轉移到15 mL離心管中。

(4)1 500 r/min離心5 min棄上清液,用DMEM洗脾細胞1次。

(5)離心5 min,棄上清液,加入5 mL紅細胞裂解液重懸細胞,室溫放置5 min,加入培養(yǎng)液終止裂解,離心棄上清液。

(6)取5 mL培養(yǎng)液重懸脾細胞,測定細胞密度,鋪到6孔板。2 mL/孔,HA蛋白作刺激物(10 μg/mL),每組設立不加刺激物的對照孔。將細胞放置37 ℃、體積分數為5%的CO2培養(yǎng),72 h后收取細胞上清液送至上海萊茲生物公司檢測細胞因子。

1.2.8 數據處理與統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism8軟件制圖,兩組數據進行Studentt差異性分析,P<0.05判斷為差異顯著,用*標注,P<0.01判斷為差異極顯著,用**標注。

2 結果

2.1 M1基因編碼區(qū)序列PCR擴增及產物鑒定

以病毒RNA為模板進行RT-PCR擴增,產物經瓊脂糖凝膠電泳,結果顯示,M1基因PCR擴增得到大小約為759 bp的條帶,與預期大小相符(圖1)。序列分析顯示,與GenBank報道的A/chicken/Guangxi/CWM/2019(H9N2)核苷酸序列同源性為100%。

M.DNA 標準DL 2 000;1～3.M1基因擴增產物

2.2 重組質粒雙酶切鑒定

重組表達質粒經雙酶切得到2個條帶,分析條帶大小顯示,與目的基因片段(759 bp)和載體片段(5 900 bp)大小相符(圖2),說明M1基因目的片段成功插入到pET-32a載體。測序結果顯示,目的片段成功插入到pET-32a載體,表明pET-32a-M1重組質粒構建成功。

M.DNA 標準DL 8 000;1～2.pET-32a-M1雙酶切產物

2.3 重組蛋白的誘導表達與表達形式分析

pET-32a-M1重組質粒經IPTG誘導,SDS-PAGE電泳分析重組蛋白,結果顯示,M1重組蛋白在大腸埃希氏菌內表達較好,主要在上清液,為可溶性蛋白,融合蛋白約為49 ku(包括標簽蛋白)(圖3)。

M.蛋白分子質量標準;1.pET-32a空載體;2.總蛋白;3.可溶性蛋白;4.不溶性蛋白

2.4 重組蛋白的Western blot鑒定

Western blot結果顯示,M1重組蛋白與His標簽單克隆抗體反應良好,在49 ku處有一特異條帶,而空載體在此處沒有出現相應條帶(圖4),表明M1重組蛋白反應原性好。

M.蛋白分子質量標準;1.pET-32a空質粒;2.pET-32a-M1質粒

2.5 小鼠血清IgG抗體水平

通過ELISA測定結果顯示,免疫小鼠血清產生一定量的IgG抗體,抗體效價為1∶30 000。結果說明,M1重組蛋白免疫小鼠產生特異性的IgG結合抗體(圖5)。

圖5 M1免疫小鼠血清IgG抗體水平

圖6 M1重組蛋白免疫小鼠脾細胞上清多細胞因子結果

2.6 小鼠脾細胞培養(yǎng)上清多細胞因子結果

采用Luminex方法檢測小鼠脾細胞上清液IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-12p70、IL-18、GM-CMF、TNF-α、IFN-γ細胞因子,以M1重組蛋白刺激后,以添加蛋白刺激和無蛋白刺激細胞因子分泌量差值作圖,結果顯示,M1免疫小鼠后脾細胞上清液中細胞因子IL-2(108.17 pg/mL)、IL-4(11.05 pg/mL)、IL-6(6 617.96 pg/mL)與對照組的(9.91、3.08、4011.25 pg/mL)相比極顯著升高(P<0.01)。與對照組相比,M1免疫組脾細胞培養(yǎng)上清液的IL-1β、IL-18和IFN-γ分泌量極顯著降低(P<0.01),IL-5、IL-12p70和GM-CMF分泌量顯著降低(P<0.05),IL-13、TNF-α分泌量差異不顯著(P>0.05)。說明免疫后與T細胞相關的免疫因子升高,降低促炎因子的分泌,為保護機體免受病毒攻擊做準備。

3 討論

禽流感病毒在全世界流行,威脅養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。H9N2亞型流感病毒宿主廣泛,流行率高,在傳播過程中與其他亞型流感病毒重組產生新的亞型病毒。M1蛋白是A型流感病毒的基質蛋白,在A型流感病毒各個亞型中具有高度保守的特點。

與傳統(tǒng)的季節(jié)性流感疫苗相比,重組抗原蛋白作為新一代流感疫苗的免疫原具有幾個優(yōu)點。目前的季節(jié)性流感疫苗通常是用雞蛋生產[12],這種生產方法需要很長的準備時間,并且人流感疫苗方面,對雞蛋過敏的患者無法接受這種類型的疫苗[13]。此外,在流感大流行期間,雞蛋供應可能非常有限[14]。重組抗原蛋白是通過基因工程技術獲得,把抗原位點多的基因克隆到載體上,轉至細菌或細胞中,誘導表達,得到大量的單一的抗原,這種技術成熟,同時獲得的抗原對人和動物安全性高。本試驗通過原核表達H9亞型M1蛋白,重組蛋白以可溶性蛋白形式存在,為純化創(chuàng)造有利條件。

亞單位疫苗免疫宿主后誘導機體產生體液和細胞免疫應答,一次接種可獲得更長時間的免疫保護力。本試驗中,M1重組蛋白免疫接種小鼠2次,14 d后,血清中產生特異性IgG抗體,抗體效價達1∶30 000,說明M1重組蛋白作為基因工程亞單位疫苗在小鼠體內產生良好的免疫應答。T細胞介導的細胞免疫是現在疫苗研究中的一個熱點,也是通用流感疫苗一個研究方向[15-18]。流感疫苗產生T細胞免疫反應,可以產生廣譜的保護效果。M1重組蛋白免疫接種小鼠后,分離小鼠脾細胞,添加M1重組蛋白刺激,結果發(fā)現小鼠脾細胞上清液中IL-2、L-4、IL-6含量與對照組的作比較,極顯著增加(P<0.01),這研究結果與孫偉洋[19]的H5亞型禽流感減毒冷疫苗免疫小鼠結果相似。IL-1β、IL-18和IFN-γ分泌量極顯著降低(P<0.01),IL-1β和IL-18同屬于IL-1家族,是一種促炎因子,機體感染病毒早期,IL-1β和IL-18通過促進CD8+T細胞的活性和誘導抗體分泌,發(fā)揮保護作用,但如果過量產生則會破壞良性結果[20]。IFN-γ主要功能是抗病毒,但是過度產生也導致不良后果,研究發(fā)現IFN-γ在H1N1亞型病毒感染所致的的急性肺損傷中起重要作用[21]。IL-5、IL-12p70和GM-CMF分泌量顯著降低(P<0.05),IL-13、TNF-α分泌量降低差異不顯著(P>0.05)。TNF-α也是一種典型的促炎細胞因子,有研究表明,在H5N1亞型AIV感染期間,TNF-α會加重流感的損傷嚴重程度[22]。炎癥因子在病毒感染時一方面可以產生保護作用,另一方面積累過多可能導致宿主炎癥損傷和急性死亡,這說明M1重組蛋白免疫接種小鼠后,宿主通過減少炎癥因子積累,降低宿主感染病毒受到的損傷,側面保護宿主。M1蛋白作為免疫原有良好的免疫效果。