張文婷，季文斌，呂振宇，程倩倩，于金慧，楊 燕

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004）

原發(fā)性肝癌中，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是最常見的一種組織學(xué)類型，占比75%～85%［1］，也是導(dǎo)致我國癌癥死亡的第二位原因［2］。HCC 的治療方式多種多樣，包括手術(shù)切除、射頻消融、經(jīng)皮肝動脈化療栓塞、經(jīng)皮無水乙醇注射、腫瘤放療、全身化療及靶向治療等［3］。此外一些新型治療手段，包括免疫檢查點抑制劑、腫瘤疫苗、溶瘤病毒、過繼性細胞療法等也是目前針對中晚期HCC 的治療和研究熱點［4］。盡管HCC 治療上取得了進步，但由于該病發(fā)病隱匿，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于晚期階段，患者整體預(yù)后仍然較差。因此探索HCC 的發(fā)病機制以及尋找新的HCC 生物標(biāo)志物尤為重要。

核 轉(zhuǎn) 錄 因 子Y（nuclear transcription factor Y，NFY）是一種普遍存在于真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子，由三種不同的亞基組成，分別是（nuclear transcription factor Y subunit A， NFYA）、NFYB 和NFYC［5］。其 中NFYA 是NFY 的 重 要 調(diào) 節(jié) 亞 基，NFYB 和NFYC 亞基形成的異二聚體對NFYA 亞基的調(diào)節(jié)作用非必需但有一定的協(xié)同作用［6］，這三個亞基在DNA 結(jié)合中都發(fā)揮重要作用。NFYA 可以與CCAAT 盒特異性結(jié)合，CCAAT 盒是基因啟動子中富集的DNA 元件，在多種腫瘤中過表達［7］，由此可以推測，NFYA 作為核轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)節(jié)CCAAT 盒參與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。這些年來NFYA 與腫瘤的相關(guān)性研究取得了一定進展，有研究者發(fā)現(xiàn)NFYA 在多種腫瘤中過表達如乳腺癌、肺癌和頭頸部鱗狀細胞癌等［8-10］；還有學(xué)者揭示NFYA 是前列腺癌細胞代謝的新型調(diào)節(jié)因子，其表達水平隨著前列腺癌的進展而不斷升高［11］。然而，NFYA 在HCC 中的作用研究尚不豐富。本研究旨在通過生物信息學(xué)分析及細胞組織學(xué)實驗揭示NFYA 在HCC 中的表達及臨床意義，包括與HCC患者預(yù)后、潛在致病機制及免疫細胞浸潤等的相關(guān)性，以期為HCC 的發(fā)病機制研究及生物標(biāo)志物探尋提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 獲取生物信息學(xué)分析資料

利 用TIMER（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）數(shù)據(jù)庫分析NFYA mRNA 在各種惡性腫瘤中 的 表 達 水 平，從TCGA（https：//www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）數(shù) 據(jù) 庫中下載HCC 的轉(zhuǎn)錄組和臨床數(shù)據(jù)。通過使用R 軟件（4.2.2 版）的“l(fā)imma”包比較正常肝組織和HCC組織中的NFYA mRNA 差異表達。用UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）和HPA（https：//www.proteinatlas.org/）數(shù)據(jù)庫分析NFYA 蛋白在HCC 及正常肝組織中的表達差別。

1.2 細胞培養(yǎng)

人正常肝細胞系LO2 購自南京凱基生物技術(shù)有 限 公 司（Nanjing，China），HCC 細 胞 系（Huh7、Hep3B、BEL-7404、SMMC-7721）購買于中國科學(xué)院細胞庫（Shanghai，China）。LO2、Huh7、Hep3B 細胞用DMEM 培養(yǎng)基（Gibco， CA， USA）添加10%胎 牛 血 清（Gibco， CA， USA）培 養(yǎng)，BEL-7404 和SMMC-7721 細 胞 用RPMI 1640 培 養(yǎng) 基（Gibco，CA， USA）添加10%胎牛血清（Gibco， CA， USA）培養(yǎng)，均放置于37 °C、5% CO2無菌恒溫培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 qRT-PCR

TRIzol 試 劑（Invitrogen，CA，USA）提 取 總RNA，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega，Wisconsin，USA）產(chǎn)生cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進行PCR，擴增使用RR820A SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa，Osaka，Japan），在7500 快速實時PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，MD，USA）上完成，擴增反應(yīng)條件見本課題團隊既往報道［12，13］。上述操作均按照說明書進行，NFYA引物序 列sense（5′-3′）： CAGACCCTCCAGGTAGTCCA， anti-sense（5′-3′）： CACCCTGGATCTGGATCTGT；GAPDH引 物 序 列sense（5′-3′）：CAGACCCTCCAGGTAGTCCA， anti -sense（5′-3′）：TGATGGTTTGACCTTGTCCA。 以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt 法進行相對定量。

1.4 臨床樣本收集

收集2022 年5 月～2022 年11 月期間就診于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的20 例新鮮HCC 腫瘤組織及對應(yīng)癌旁正常肝組織標(biāo)本，具體見既往研究［14］。所有HCC 患者術(shù)前均未接受抗腫瘤治療。本研究通過本院倫理委員會審批，并獲得了參加本研究的HCC 患者或其家屬的知情同意。

1.5 免疫組化染色實驗

兔抗人NFYA 抗體由Abcam 公司（Cambridge， MA， USA）提供，二抗和SP 試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司（Fuzhou， China）提供。標(biāo)本用10%福爾馬林溶液固定，然后進行脫水，包埋，切片，HE 染色后觀察，后經(jīng)免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry， IHC）染色方法檢測，所有操作程序均遵守試劑盒使用說明。使用PBS 代替一抗做陰性對照。NFYA 一抗?jié)舛葹?∶700，觀察HCC腫瘤組織和癌旁正常肝組織的染色情況，細胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒者視為陽性。

1.6 NFYA mRNA 表達與HCC 患者臨床病理特征相關(guān)性分析

按照NFYAmRNA 的表達水平將HCC 樣本分成高表達組和低表達組，通過R 軟件（4.2.2 版）的“l(fā)imma”和“ComplexHeatmap”包研究HCC 患者臨床病理特征和NFYA 表達水平的相關(guān)性。

1.7 NFYA mRNA 表達與HCC 患者預(yù)后相關(guān)性分析

把從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載的臨床數(shù)據(jù)進行整理，使用R 軟件（4.2.2 版）的“survival”包繪制總生存時間（overall survival， OS）和無進展生存時間（progress free survival， PFS）生存曲線。對TCGA 數(shù)據(jù)庫中的臨床數(shù)據(jù)進行單因素和多因素Cox 回歸預(yù)后分析。

1.8 NFYA 共表達基因的篩選及富集分析

基于TCGA 下載的數(shù)據(jù)使用R 軟件（4.2.2 版）的“pheatmap”包篩選出HCC 中與NFYA 相關(guān)程度高的一些基因，使用R 軟件（4.2.2 版）的“colorspace”、“stringi”、“ggplot2”、“citclize”、“RColor-Brewer”、“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”及“enrichplot”包對這些共表達基因進行GO 功能富集和KEGG 信號通路富集分析。

1.9 NFYA 與腫瘤微環(huán)境（TME）和免疫細胞浸潤相關(guān)性分析

使用“estimateScore”算法計算所有HCC 樣本的Stromal Score， Immune Score 和ESTIMATE Score 并用小提琴圖顯示結(jié)果。基于TCGA 數(shù)據(jù)庫分析NFYA 與多種腫瘤浸潤免疫細胞的相關(guān)性。此外，本研究還分析了NFYA 與多種免疫檢查點基因的相關(guān)性。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 25.0 做統(tǒng)計分析，定量數(shù)據(jù)用t檢驗分析，非正態(tài)分布變量用Wilcoxon 秩和檢驗分析。P＜0.05 被認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 NFYA mRNA 在HCC 中的表達

TIMER 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，NFYAmRNA 表達水平在多種惡性腫瘤中較正常組織高（P＜0.05，圖1A）。進一步分析顯示，NFYAmRNA 在HCC 組織中較正常肝組織表達顯著增高（P＜0.001，圖1B）。細胞學(xué)實驗結(jié)果進一步證實，相比較于正常肝細胞系LO2，NFYAmRNA 在其他多種HCC 細胞系（Huh7、Hep3B、BEL-7404 和SMMC-7721）中表達均顯著上調(diào)（均P＜0.05，圖1C）。

圖1 NFYA mRNA 在HCC 中的表達Fig 1 NFYA mRNA expression in HCC

2.2 NFYA 蛋白在HCC 組織中的表達

通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析可見，相較與正常肝組織，NFYA 蛋白在HCC 組織中表達水平增高（P＜0.05，圖2A），代表性IHC 圖片見圖2B。研究者HCC 組織隊列IHC 染色進一步證實，NFYA 蛋白在腫瘤組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，且主要定位于細胞核，兩對代表性IHC 染色圖片見圖2C。

圖2 TNFYA 蛋白在HCC 組織中的表達*Fig 2 NFYA protein expression in HCC tissues

2.3 NFYA mRNA 表達與HCC 患者臨床病理特征相關(guān)性

基于TCGA 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析，HCC 患者不同的臨床病理特征在NFYA 高低表達組的分布情況見圖3A 所示，其中NFYA 表達與HCC 組織學(xué)分級、病理學(xué)分期、T 分期顯著相關(guān)（均P＜0.05，圖3B-D），而與年齡、性別、M 分期、N 分期無明顯相關(guān)性（均P＞0.05）。

圖3 TCGA 數(shù)據(jù)庫中NFYA mRNA 表達與HCC 患者臨床病理特征相關(guān)性Fig 3 Relationship between NFYA mRNA expression and clinicopathological characteristics of HCC patients based on the TCGA database

2.4 NFYA mRNA表達與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

基于TCGA 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進行生存分析，結(jié)果表明NFYA 高低表達組間的總生存期（overall survival， OS）有顯著性差異，NFYA 高表達組OS 差于低表達組（P=0.04，圖4A）。在無進展生存期（progression free survival， PFS）分析上也得到了類似的結(jié)果（P=0.02，圖4B）。單因素Cox 分析結(jié)果提示，病理學(xué)分期和NFYA 表達水平與HCC 預(yù)后相關(guān)；多因素Cox 分析進一步證實，該兩個因素是HCC 預(yù)后不良的獨立危險因素（表1）

表1 HCC 患者預(yù)后的單因素和多因素Cox 回歸分析Tab 1 Univariate and multifactorial Cox regression analysis of HCC patients’prognosis

圖4 TCGA 數(shù)據(jù)庫中NFYA mRNA 表達與HCC 患者預(yù)后的關(guān)系Fig 4 Relationship between NFYA mRNA expression and HCC patients prognosis based on the TCGA database

2.5 GO 富集分析及KEGG 信號通路分析

在HCC 組織中篩選出與NFYA 共表達的差異基因，見圖5A。這些基因在GO 分析中顯示主要與核裂解、有絲分裂細胞周期、蛋白結(jié)合等生物過程（圖5B）有關(guān)。在KEGG 富集分析中，它們主要與細胞周期、DNA 復(fù)制等信號通路（圖5C）相關(guān)。

圖5 基于NFYA 共表達差異基因的GO 功能分析和KEGG 信號通路分析Fig 5 GO function and KEGG signal pathway analyses based on differently co-expressed genes

2.6 NFYA 表達與HCC 免疫特征關(guān)系的分析

從腫瘤微環(huán)境分析看，低NFYA 表達組的基質(zhì)細胞評分、免疫細胞評分和總評分均較高表達組高（均P＜0.05，圖6A）。免疫細胞浸潤分析結(jié)果顯示，NFYA 和B 細胞、T 細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞的浸潤呈負相關(guān)，但與Th2 細胞、Tcm、Tem等少數(shù)免疫細胞的浸潤呈正相關(guān)（圖6B）。進一步分析NFYA 和多種免疫檢查點基因（比如CD80、CD86、CD48 等）表達的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NFYA 表達與這些免疫檢查點基因表達均呈正相關(guān)（圖6C）。

圖6 NFYA 表達與HCC 免疫特征的關(guān)系Fig 6 Relationship between NFYA mRNA expression and immune features of HCC

3 討論

本研究通過多個公共數(shù)據(jù)庫分析顯示，NFYA在HCC 中比正常肝組織的表達水平高，而qRT-PCR 和IHC 也 證 實 了NFYA 在HCC 中 的 高表達。既往有研究表明NFY 在HCC 中過表達［15］，這一發(fā)現(xiàn)與本研究在HCC 中的研究結(jié)果相吻合。此外，臨床病理特征的分析顯示，NFYA 的表達水平與HCC 患者的組織學(xué)分級、病理學(xué)分期和T 分期有顯著關(guān)系?；赥CGA 數(shù)據(jù)庫的生存分析發(fā)現(xiàn)HCC 患者NFYA 高表達和不良預(yù)后有關(guān)。這些結(jié)果說明NFYA 可能與HCC 患者惡性表型有關(guān)，可能是HCC 不良預(yù)后的一個標(biāo)志物，為HCC 患者個體化診療提供新的靶點。

GO 富集分析發(fā)現(xiàn)NFYA 及其共表達差異基因主要富集在核裂解、有絲分裂細胞周期、蛋白結(jié)合等生物過程。最新的一項研究揭示了NFYA 參與肝細胞有絲分裂的過程［16］，這與分析結(jié)果一致。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，NFYA 共表達差異基因主要富集在DNA 復(fù)制、細胞周期等信號通路。有研究表 明NFY 三 聚 體 可 以 激 活 多 種 增 殖 基 因［17］，如EZH2、Cyclin D1、c-Myc 等。過度增殖是惡性腫瘤的特點，因此不難推測NFYA 可能通過促進HCC細胞的異常增殖促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。至于NFYA 如何促進HCC 的異常增殖，從KEGG 富集分析結(jié)果來看，可能與調(diào)節(jié)HCC 細胞周期和遺傳物質(zhì)合成有關(guān)。

免疫治療是近幾年發(fā)展迅速的一種HCC 治療方法，為HCC 患者帶來了新的治療選擇［18］。本研究在發(fā)現(xiàn)NFYA 可影響HCC 患者預(yù)后的基礎(chǔ)上，進一步探索了NFYA 與免疫微環(huán)境和免疫細胞浸潤的相關(guān)性。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細胞、免疫細胞、基質(zhì)細胞、炎癥細胞以及多種細胞因子組成的［19］，腫瘤微環(huán)境中越多的免疫細胞和基質(zhì)細胞浸潤說明腫瘤實質(zhì)細胞占比越少。本研究分析結(jié)果表明，NFYA 低表達組的基質(zhì)細胞評分、免疫細胞評分及總評分顯著高于高表達組，也就是說NFYA 低表達組中的基質(zhì)細胞和免疫細胞浸潤多，而腫瘤細胞浸潤少。研究還發(fā)現(xiàn)NFYA 表達和B 細胞、T 細胞、DC 細胞、中性粒細胞等免疫細胞浸潤水平是負相關(guān)的，尤其是與DC 細胞關(guān)系最為緊密。DC 細胞、T 細胞、B 細胞、中性粒細胞等可以通過特異性或非特異性的方式識別和殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤的生長、遷 移 和 侵 襲，從 而 改 善HCC 患 者 的 預(yù) 后［20，21］。而NFYA 表達水平越高，這些免疫細胞浸潤減少預(yù)后也就越差，這與本研究得到的NFYA 高表達與HCC 患者預(yù)后不良相關(guān)的結(jié)論是相符的。另外，本研究還分析了NFYA 表達水平與免疫檢查點基因之間的關(guān)系，結(jié)果顯示NFYA 和多種免疫檢查點基因的表達存在相關(guān)性，這提示NFYA 可能有助于HCC 免疫干預(yù)靶點的選擇。但NFYA 在免疫調(diào)控中如何起作用，以及其是否能成為免疫治療新的生物標(biāo)志物還需要更多的研究。

綜上所述，本研究使用公共數(shù)據(jù)庫和研究者隊列從mRNA 和蛋白層面共同支持NFYA 在HCC 中高表達的結(jié)論，并且NFYA 表達與HCC 患者預(yù)后和免疫微環(huán)境密切相關(guān)，具有成為HCC 患者預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點的潛力。但本研究具有一定局限性，首先本文臨床數(shù)據(jù)主體來源于公共數(shù)據(jù)庫，其次對NFYA 在HCC 中的具體作用機制尚未深入探究，但NYFA 在HCC 中的作用和潛在價值應(yīng)引起研究者們的更多關(guān)注。

作者貢獻度說明：

張文婷：主要實驗執(zhí)行、數(shù)據(jù)分析和論文撰寫；季文斌、呂振宇、程倩倩和于金慧：協(xié)助實驗執(zhí)行、數(shù)據(jù)整理和分析；楊燕：研究設(shè)計構(gòu)思、文章修改審閱、項目經(jīng)費資助。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。