劉潔婷，張 蕾，趙 潔，謝 甜

（海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院，海南省人民醫(yī)院，呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570311）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）以干咳、進行性氣促為臨床表現(xiàn)，影像學(xué)表現(xiàn)為尋常型間質(zhì)性肺炎，其病因不明，發(fā)病機制十分復(fù)雜，除肺移植以外目前尚無特效藥物，［1］。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）在肺部纖維化和結(jié)構(gòu)重塑過程中發(fā)揮重要的作用［2］。顆粒體蛋白前體（progranulin， PGRN）是與炎癥、腫瘤等多種疾病和生長發(fā)育過程相關(guān)的多效生長因子，可競爭性結(jié)合TNF-α 阻斷其與受體結(jié)合，從而抑制由TNF-α 介 導(dǎo) 的 多 種 炎 癥 通 路［3］?，F(xiàn) 有 研 究 揭 示PGRN 可能是導(dǎo)致各種呼吸系統(tǒng)疾病的因素之一，且與多個器官或組織的纖維化相關(guān)。PGRN 在肺纖維化動物模型中的研究鮮有報道，本研究采用氣管內(nèi)滴注博來霉素建立小鼠肺纖維化模型，并觀察PGRN 在肺纖維化小鼠肺部的變化，探索PGRN 在肺纖維化過程中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

博來霉素購自海正輝瑞制藥有限公司，批準文號 ：國 藥 準 字 H20055883，執(zhí) 行 標 準 ：YBH15562005，每瓶含博來霉素1.5 萬單位（15 mg/瓶）。小鼠PGRN 抗體購自R＆D 公司。Masson染色和蘇木素伊紅（HE）染色所使用的試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 動物模型建立

從海南省實驗動物中心購買并寄養(yǎng)36 只6～8周 齡，體 重 約20～25 g 的SPF 級 雄 性C57BL/6 小鼠，采用隨機數(shù)字表法將所有動物隨機分為生理鹽水對照組（Sham 組）、博來霉素14 d 組（BLM14 d組）、博來霉素28 d 組（BLM28 d 組），每組12 只小鼠。各組動物分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度18～24 ℃，濕度50%～60%，光暗周期交替，動物均自由飲水、攝食。整體實驗均遵守美國國立衛(wèi)生研究院所制定的《實驗動物使用指南》。

小鼠稱量體重，使用1%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）經(jīng)腹腔內(nèi)注射充分麻醉后固定于操作臺，剃除小鼠頸部毛發(fā)，博來霉素組小鼠經(jīng)由頸部中部切開，鈍性分離各層肌肉和筋膜，并充分暴露氣管，注射器斜45°穿刺進入氣管軟骨環(huán)間隙，迅速向氣道內(nèi)注入溶解于生理鹽水的博來霉素溶液（5 mg/kg）0.1 mL。Sham 組操作過程同上，僅使用等量生理鹽水替代博來霉素。注射結(jié)束后直立并勻速地旋轉(zhuǎn)小鼠，全層縫合創(chuàng)面，再次消毒切口，小鼠清醒后繼續(xù)飼養(yǎng)。BLM 14 d 組、BLM 28 d 組小鼠分別于氣道內(nèi)給藥后第14 天、第28 天用戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉后放血處死，摘取完整右肺組織進行病理學(xué)檢查，摘取左肺組織凍存于-80°C 冰箱中備用。

1.3 組織學(xué)檢查

將10%甲醛緩慢注入新鮮肺組織至充盈漲大，將肺組織快速置于10%甲醛固定至24 h。石蠟包埋肺組織制成切片，分別按步驟進行HE 染色和Masson 染色。

1.4 PGRN 免疫組織化學(xué)染色

切片充分水化，以PBS 洗滌3 次，每次3 min，置于96～98℃的檸檬酸鹽緩沖液中分鐘以修復(fù)抗原，當切片充分冷卻后以PBS 洗滌切片3 次，在切片上滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，置于室溫下孵育10 min，再次以PBS 洗滌3 次，滴加封閉液，室溫下靜置封閉1 h。根據(jù)說明書將小鼠PGRN 抗體稀釋至1∶200 并滴加到組織切片上，置于濕盒在4 ℃冰箱過夜?？瞻讓φ詹僮魍?，僅用PBS 代替一抗。將濕盒中的切片取出置于室溫下復(fù)溫45 min 后再以PBS 洗 滌3 次，每 次3 min。滴 加 二 抗（羊 抗 兔IgG），室溫孵育30 min，PBS 洗滌切片3 min×3 次；按試劑盒說明書配制DAB 顯色液，向組織上滴加DAB 顯色液顯微鏡下觀察，當出現(xiàn)陽性棕色顆粒時，將組織置于自來水中，終止反應(yīng)。以蘇木素染細胞核，不同梯度酒精進行脫水，二甲苯透明后以中性樹膠封片。

1.5 Western Blot 檢測肺組織PGRN 蛋白的表達

內(nèi)參選用GAPDH。裂解液對肺組織進行處理，用細胞質(zhì)/核蛋白提取試劑盒提取總蛋白，定量采用二啉甲酸（Bicinchoninicacid，BCA）法，再進行上樣電泳，經(jīng)一抗4 ℃孵育一夜后，轉(zhuǎn)入聚偏氟乙烯膜，再經(jīng)TRIS-HCL 緩沖鹽溶液洗滌后加入二抗，37 ℃下孵育1 h，充分漂洗，目的條帶采用電化學(xué)發(fā)光法顯色，掃描儀掃描，灰度值分析使用IMAGE J軟件。蛋白表達水平的計算方法是各樣本中PGRN 條帶的灰度值/GAPDH 灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料 以 均 數(shù)±標 準 差（±s）表 示，采 用t檢 驗 對BLM14 d 組與Sham 組、BLM28 d 組與Sham 組兩組間小鼠肺組織PGRN 蛋白的表達水平分別比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

小鼠造模過程中存在自然死亡， Sham 組死亡1只、BLM14 d 組死亡2 只、BLM28 d 組死亡4 只。第28 天時博來霉素組小鼠呼吸頻率明顯增快，全身毛發(fā)晦暗無光澤，體重減輕。

2.2 小鼠肺組織HE 染色

Sham 組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，肺泡內(nèi)及間質(zhì)可見少許炎性細胞浸潤，BLM14 d 組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)破壞，肺泡間隔增厚，肺泡及間質(zhì)均有較多炎性細胞浸潤，BLM28 d 組小鼠肺組織病變更重明顯，肺泡結(jié)構(gòu)嚴重破壞，肺泡間隔明顯增厚，肺泡及肺間質(zhì)大量炎性細胞浸潤，見圖1A。Masson染色后觀察發(fā)現(xiàn)，BLM14 d 組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔增厚明顯，部分間質(zhì)纖維化。BLM28 d 組小鼠肺泡腔被膠原纖維填充，肺泡間隔消失，膠原纖維連結(jié)成片，見圖1B。

圖1 小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較（×100）Fig 1 Comparison of pathological morphology of mice lung tissue（×100）

2.3 通過免疫組織化學(xué)染色法光鏡觀察

PGRN 在BLM14 d 組小鼠肺泡巨噬細胞和肺泡上皮細胞中表達較Sham 組升高，而BLM28 d 組小鼠肺泡巨噬細胞和肺泡上皮細胞中表達較BLM14 d 組升高更為明顯。見圖1C。

2.4 Western blot 結(jié)果

BLM28 d 組小鼠肺組織中PGRN 蛋白表達水平（0.60±0.18）較Sham 組（0.17±0.02）升高（t=7.924，P＜0.001），BLM14 d 組小鼠肺組織中PGRN蛋白表達水平（0.22±0.06）較Sham 組（0.17±0.02）升高（t=2.614，P=0.017），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 小鼠肺組織PGRN 蛋白比較Fig 2 Comparison of PGRN protein of mice lung tissue

3 討論

IPF 是以進行性肺纖維化為特點的慢性肺退行性疾病，診斷后的總生存期3～5 年［4］。目前抗肺纖維化的靶向治療以尼達尼布和吡非尼酮為主，僅能從一定程度上延緩肺纖維化，能接受肺移植手術(shù)并成功的患者只是極少數(shù)，亟待探尋IPF 的新型生物標志物和治療新靶點。PGRN 是一種多效生長因子，廣泛表達于多種組織細胞中并參與調(diào)節(jié)生長、遷移和轉(zhuǎn)化，能競爭結(jié)合TNFR 的胞外區(qū)域，阻斷TNF-α 介導(dǎo)的NF-κB 等多種信號通路［3］，已成為多種腫瘤、神經(jīng)退行性變及炎癥性疾病的生物標志物及治療靶點，同時在損傷修復(fù)過程中起著至關(guān)重要的作用［5］。

纖維化是多種組織器官慢性疾病或損傷后的共同病理特征［6］。皮膚、肝、心臟、肺等多種器官均可因各種病變和損傷后進行性纖維化和組織重塑，進而導(dǎo)致器官損傷、功能衰竭甚至死亡［7］。已有多項研究發(fā)現(xiàn)PGRN 可能參與組織、器官纖維化的過程。Yang 等［8］觀 察 到PGRN 可 通 過 上 調(diào) 轉(zhuǎn) 化 生 長因子-β I 型受體，增強轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad3 信號通路，促進博萊霉素誘導(dǎo)的皮膚硬化。另一項研究卻與之相反，該研究發(fā)現(xiàn)PGRN 過表達降低了α-平滑肌肌動蛋白、血清反應(yīng)因子和結(jié)締組織生長因子表達水平，從而減輕創(chuàng)面修復(fù)時皮膚的纖維化［9］。重組PGRN 干預(yù)后可減輕兔缺血再灌注2 周后約10%的心肌纖維化［10］，進一步對PGRN 敲除小鼠建構(gòu)急性心肌梗死模型，發(fā)現(xiàn)PGRN 缺乏降低了心肌梗死后的存活率，增加了心肌的纖維化［11］。Yoo等［12］發(fā)現(xiàn)PGRN 可通過抑制NF-κB 的磷酸化、抑制巨噬細胞活化、減少膠原沉積進而減輕四氯化碳導(dǎo)致的肝臟損傷、炎癥和纖維化。小兒戈謝病患者血清PGRN 水平與肝僵硬度升高相關(guān)，有望成為肝纖維化的無創(chuàng)檢測手段［13］。

目前PGRN 在呼吸系統(tǒng)疾病中的基礎(chǔ)研究多圍繞急性肺損傷、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病進行。如Chen 等［14］發(fā)現(xiàn)PGRN 可能通過促進Treg分化和激活白細胞介素-10 在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中發(fā)揮保護作用。PGRN 還可以通過抑制HMGB1 調(diào)節(jié)自噬改善屋塵螨誘導(dǎo)的慢性哮喘的氣道 重 塑［15］。 血 清PGRN 水 平 與COPD 患 者FEV1% pred 呈負相關(guān)，與中性粒細胞與淋巴細胞比率、C 反應(yīng)蛋白呈正相關(guān)［16］。當前PGRN 在間質(zhì)性肺疾病或肺纖維化中的研究多以探索其生物學(xué)標志物價值為主。有研究發(fā)現(xiàn)影像學(xué)表現(xiàn)為尋常型間質(zhì)性肺炎特征的患者血清PGRN 正常，而影像學(xué)表現(xiàn)為非尋常型間質(zhì)性肺炎的患者PGRN 明顯升高［17］，因此認為PGRN 可用于鑒別IPF 與非IPF類型的間質(zhì)性肺疾病。在前期研究中發(fā)現(xiàn)IPF 患者在急性加重時血清中的PGRN 水平明顯高于穩(wěn)定期IPF 患者［18］。MDA5 陽性皮肌炎合并快速進展性間質(zhì)性肺疾病的PGRN 水平明顯升高［19］，PGRN 有望成為其生物學(xué)標志物。

在PGRN 與間質(zhì)性肺疾病的基礎(chǔ)研究方面，王夢祝等［20］發(fā)現(xiàn)PGRN 在矽肺小鼠模型肺組織中高表達，并促進肺成纖維細胞增殖和分化。目前PGRN 在博來霉素建立的肺纖維化模型小鼠中的研究鮮見報道，本研究對PGRN 在肺纖維化小鼠肺組織中的表達做了初步的觀察研究，成功地通過氣道內(nèi)灌注博來霉素建立了小鼠肺纖維化模型。通過免疫組織化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn)，無論是第14 天還是28天，PGRN 在博來霉素氣道灌注后的小鼠肺組織中的表達都高于Sham 組，且其分布以肺泡巨噬細胞和上皮細胞為主。Western Blot 法檢測發(fā)現(xiàn)PGRN在博來霉素氣道灌注小鼠肺組織中的蛋白表達水平無論是第14 天還是28 天均明顯高于Sham 組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，初步提示PGRN 參與肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的可能。本研究僅為觀察性研究，尚存在諸多不足之處，例如無法明確PGRN 在肺纖維化的作用到底是上游啟動因素還是其他炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的下游改變。接下來還需要通過敲除或敲低小鼠PGRN 基因后并給予外源性PGRN 處理，觀察小鼠氣道灌注博來霉素后肺部炎癥及纖維化的變化，從而明確PGRN 在肺纖維化中起到保護性抗炎抗纖維化作用還是增加炎癥及纖維化程度。此外還需要在體外細胞試驗中進一步證實并從分子通路水平探討其作用機制，以期對IPF 的發(fā)病機制和靶向治療提供更多的理論依據(jù)。

作者貢獻度說明：

劉潔婷：動物模型的建立、統(tǒng)計學(xué)分析和論文撰寫，張蕾：病理學(xué)檢測，趙潔：蛋白印跡法檢測，謝甜：課題設(shè)計、實驗指導(dǎo)和論文修改。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。