★ 溫沁楠 張銳 魏朵朵 王毓婕 孫勇兵（.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心 南昌 330006）

納米藥物一般是將藥物溶解、包裹在高分子材料中或是吸附在載體表面形成的載藥納米粒，其粒徑在10～1 000 nm。將藥物制成納米制劑可以有效解決其溶解度、滲透性、穩(wěn)定性差等問(wèn)題，并且可以實(shí)現(xiàn)藥物靶向、緩釋、提高生物利用度等目的［1-2］。目前有超過(guò)51 種納米藥物獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)［3］，但是同期的申請(qǐng)量卻多達(dá)359 項(xiàng)［4］。僅有1/7 的申請(qǐng)獲得批準(zhǔn)，主要原因之一是早期評(píng)價(jià)納米藥物體外和體內(nèi)性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試方案存在不足，可能導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的治療結(jié)果，從而增加了臨床試驗(yàn)失敗的風(fēng)險(xiǎn)，這些問(wèn)題阻礙了納米藥物的開(kāi)發(fā)［5-6］。

在所有納米藥物體外研究實(shí)驗(yàn)中，包封率是關(guān)鍵性評(píng)價(jià)指標(biāo)，為納米藥物制劑成型工藝提供了關(guān)鍵信息。因此必須精確量化，合格的包封率是納米藥物能作為藥物傳遞系統(tǒng)的先決條件。國(guó)家藥監(jiān)局新藥審評(píng)中心2021 年8 月27 日發(fā)布的《納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》特別強(qiáng)調(diào)了應(yīng)根據(jù)納米藥物的特點(diǎn)對(duì)包封率進(jìn)行方法的適用性研究和驗(yàn)證。該研究的難點(diǎn)在于游離藥物和載藥納米粒的分離，既要保證分離完全，又要保證包封藥物不泄漏，這是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。而目前尚無(wú)規(guī)范的藥典方法或監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)，以不同的分離方法測(cè)定包封率所得到的結(jié)果不一致，由此引發(fā)了人們對(duì)包封率準(zhǔn)確度的質(zhì)疑［7］。本文通過(guò)綜述目前包封率測(cè)定的主要方法、方法學(xué)驗(yàn)證中存在的缺陷、導(dǎo)致準(zhǔn)確度問(wèn)題的因素以及應(yīng)對(duì)策略，為選擇最佳的包封率測(cè)定方法提供參考。

1 包封率的計(jì)算方法

目前包封率的測(cè)定策略主要是通過(guò)間接法測(cè)定，即采用某種分離手段將游離藥物和載藥納米粒分離，再測(cè)定游離藥物的含量，最后通過(guò)質(zhì)量平衡計(jì)算納米藥物的包封率［包封率=（W總藥量-W游離藥量）/W總藥量×100%］。但是由于載藥納米粒的多分散性，無(wú)法獲得（標(biāo)定）不含游離藥物相應(yīng)的定量用載藥納米粒對(duì)照品，因此僅能以游離藥物為指標(biāo)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。但需要特別注意的是，使用該策略的前提是載藥納米粒在分離過(guò)程中不發(fā)生藥物的泄漏。

2 游離藥物的分離方法

2.1 離心

離心法是基于粒子重量的差異，在離心力的作用下不同重量粒子沉降速度不同而使密度小的部分浮在上，密度大的部分沉降在下，以此分離游離藥物與載藥納米粒的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單，分離過(guò)程中納米藥物不被稀釋，藥物溶出的可能性較低。一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)離心后，溶解在介質(zhì)中的游離藥物往往存在于上清部分，而納米粒子則沉淀在下。但也存在藥物溶解度極小，游離藥物沉降在下，被包封的納米粒子處于上清的情況［8-9］，后者不再適用于高速離心法。故應(yīng)根據(jù)藥物的性質(zhì)選擇合適的離心力（或是離心轉(zhuǎn)速）。

2.2 透析

透析法與反透析法均是利用透析袋對(duì)分子量的選擇性，將游離藥物與載藥納米粒分離。載藥納米粒由于粒徑較大被阻礙，而游離藥物會(huì)在濃度梯度差的作用下，由濃度高處向濃度低處擴(kuò)散，達(dá)到平衡后即可測(cè)得游離藥物含量，但達(dá)到分離平衡的時(shí)間在所有分離方法中最長(zhǎng)，最可能出現(xiàn)伴隨在分離過(guò)程中載藥納米粒內(nèi)藥物溶出的問(wèn)題。

2.3 超濾

超濾法又分為超濾離心法、加壓超濾法、中空纖維超濾法等［7］。與透析法相似，也是利用超濾膜的分子截留量大小將游離藥物與載藥納米粒分開(kāi)，使游離藥物透過(guò)超濾膜，但其借助外力加快了分離的過(guò)程。游離藥物由于粒徑較小、分子量小，可以透過(guò)超濾膜，而載藥納米粒則被截留在超濾膜上。此方法兼具離心法的優(yōu)點(diǎn)，借助超濾膜的截留分子量的特性，相比于離心法分離的速度更快，也更容易判斷分離的終點(diǎn)。

但需要注意的是，如果游離藥物會(huì)發(fā)生締合、結(jié)晶導(dǎo)致流體尺寸的變化，則需要根據(jù)藥物的性質(zhì)合理使用濾膜。如陳倩倩［10］利用游離的白藜蘆醇絕大部分是以微晶形式存在，通過(guò)微孔濾膜過(guò)濾截留游離的微晶，而使載藥乳脂體通過(guò)濾膜。實(shí)驗(yàn)表明，極小部分溶解于水中的白藜蘆醇對(duì)包封率測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響。

2.4 分子排阻

分子排阻法（size exclusion chromatography，SEC）是利用被分離物質(zhì)流體力學(xué)尺寸差異而將游離藥物與載藥納米粒分離的方法［11］。一般來(lái)說(shuō)納米粒的粒徑大于游離藥物，當(dāng)粒子粒徑大于凝膠孔徑時(shí)，便無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能順著凝膠顆粒外部縫隙流出，而游離藥物分子量小，被吸附進(jìn)凝膠內(nèi)部，在洗脫劑的作用才下逐漸被洗脫，所以在凝膠柱上納米粒先被洗脫流出，小分子藥物后出。但是由于分離的過(guò)程引入了色譜流動(dòng)相和固定相兩個(gè)影響因素，SEC 的應(yīng)用也需要較長(zhǎng)的洗脫時(shí)間和較大的洗脫體積，這導(dǎo)致樣品被稀釋并伴有藥物的泄漏［12-14］。實(shí)際使用過(guò)程中除了凝膠柱層析法外，為達(dá)到快速分離目的，還有微柱離心法可供選擇。微柱離心法可加快分離的速度，可以同時(shí)并行處理多個(gè)樣品，但需注意離心作用可能導(dǎo)致柱床斷裂［15］。

2.5 非對(duì)稱場(chǎng)流分析法

非對(duì)稱場(chǎng)流分 析（asymmetric flow field flow fractionation，AF4）也是根據(jù)納米粒的流體力學(xué)尺寸進(jìn)行細(xì)分的一種技術(shù)，場(chǎng)流分離的分離通道中無(wú)固定相填料，不同尺寸的樣品在載液的層流作用下，分布在液流拋物線剖面不同高度的位置上，因此不同尺寸分析物具有不同的保留時(shí)間。同時(shí)垂直于半透膜的方向會(huì)產(chǎn)生交叉流，大粒子擴(kuò)散作用弱，趨向于靠近積累壁，因而更晚被洗脫。相比于SEC，此方法不存在因填料孔徑而導(dǎo)致的排阻極限的限制，幾乎可以分離和表征橫跨整個(gè)膠體尺寸范圍的復(fù)雜樣品。但是和SEC 的情況相似，此法也存在分析時(shí)間較長(zhǎng)的問(wèn)題，耗時(shí)常在1 h 以上，而長(zhǎng)時(shí)間的稀釋過(guò)程易導(dǎo)致納米制劑的藥物泄漏，特別是油水分配系數(shù)較低的藥物更會(huì)發(fā)生這種情況［16］。膜材如選擇不當(dāng)還可能導(dǎo)致游離藥物從半透膜滲漏。

2.6 其他

除以上方法外，通過(guò)分離介質(zhì)、游離藥物和載藥納米粒三者間相互作用的差異，也有一些特異性的分離方法被運(yùn)用于測(cè)定納米藥物的包封率。井水泉［17］運(yùn)用D101 大孔樹(shù)脂能特異性吸附游離藥物而不吸附載藥脂質(zhì)體的特性，上樣后用少量蒸餾水將脂質(zhì)體洗脫下來(lái)，而游離藥物留在樹(shù)脂柱上，使二者分離。劉敏等［18］基于納米粒的包裹不改變紫杉醇的紫外吸收特性，運(yùn)用熒光素示蹤法結(jié)合HPLC 直接測(cè)定，將游離紫杉醇與紫杉醇納米粒在C18同時(shí)定性定量測(cè)定，并且交叉驗(yàn)證了所測(cè)定的包封率值，結(jié)果無(wú)明顯差異。吳瑾瑾等［19］根據(jù)獼猴桃根多糖帶有負(fù)電性這一特征，用陰離子交換樹(shù)脂分離游離藥物與脂質(zhì)體。李文靜等［20］利用硫酸長(zhǎng)春新堿在溶液狀態(tài)下可形成有機(jī)銨鹽離子，被陽(yáng)離子交換樹(shù)脂完全吸附，以達(dá)到分離游離硫酸長(zhǎng)春新堿目的。更有學(xué)者利用多聚陽(yáng)離子魚(yú)精蛋白與帶負(fù)電的脂質(zhì)體納米粒產(chǎn)生絮凝作用，使載藥脂質(zhì)納米粒沉淀，離心后取上清測(cè)定游離藥物含量［21-22］。

3 影響因素

3.1 藥物的溶解性

藥物的溶解性是影響包封率測(cè)定的一大原因，在使用超速離心法測(cè)定包封率時(shí)，脂溶性藥物難以溶解在分散介質(zhì)中，在巨大的離心力作用下沉降在底部，難以與密度較大的載藥納米粒分開(kāi)，這時(shí)通過(guò)測(cè)定上清中游離藥物含量而計(jì)算包封率的結(jié)果會(huì)偏大。使用超濾法與透析法時(shí)，脂溶性藥物由于難以溶解在分散介質(zhì)中，聚集而成的微粒容易堆積、阻塞超濾膜與透析膜的孔徑，阻塞游離藥物的透出，也會(huì)導(dǎo)致測(cè)得的包封率值偏大。

3.2 密度

根據(jù)沉降理論公式，離心法只適用于載藥納米粒的密度與離心液體介質(zhì)密度不同的載藥納米粒的沉淀。這就需要專業(yè)離心儀器來(lái)支持超高的離心力。因此，在一般的操作條件下，特別是當(dāng)顆粒密度與液體介質(zhì)相似時(shí)，超速離心常常導(dǎo)致分離效率低下［11,23］。并且加樣回收實(shí)驗(yàn)無(wú)法證明 “上清液” 中是否還含有載藥納米粒，也無(wú)法證明較長(zhǎng)時(shí)間的超速離心是否導(dǎo)致了藥物泄漏。

3.3 溶劑量

運(yùn)用超濾離心法測(cè)定包封率時(shí)，濃差極化是阻礙游離藥物透過(guò)膜的主要因素，超濾過(guò)程中，超濾膜內(nèi)藥物逐漸濃縮，可能形成膠束，進(jìn)一步使低分子量物質(zhì)難以透過(guò)超濾膜，使包封率測(cè)定結(jié)果偏大［24］。而葡聚糖凝膠柱層析法與透析法［25］皆是由于洗脫液體積過(guò)大或透析介質(zhì)體積過(guò)大，使載藥納米粒被大量稀釋，致使部分納米粒破裂，包載的藥物泄漏，使游離藥物含量增大，測(cè)得的包封率會(huì)比真實(shí)值小。因此分離溶劑的量對(duì)包封率測(cè)定結(jié)果也有明顯的影響。

3.4 分離時(shí)間

SEC、AF4 和透析法分離時(shí)間均較長(zhǎng)，但在游離藥物與載藥納米粒分離過(guò)程中，不可避免地伴隨著載藥納米粒內(nèi)藥物的溶出（釋放），因此，分離時(shí)間應(yīng)該盡可能短。但分離時(shí)間不夠又無(wú)法使游離藥物與載藥納米粒完全分開(kāi)，所測(cè)得的包封率往往偏大。此外，在使用超速離心法時(shí)，離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使納米粒長(zhǎng)時(shí)間處于很大的離心力下［26］，強(qiáng)大外力可能致納米粒破裂，包載藥物泄漏，使測(cè)得的包封率偏小。離心法中長(zhǎng)時(shí)間的離心也可能導(dǎo)致納米粒聚集，阻礙了游離藥物的分離，使測(cè)得的包封率過(guò)大。離心時(shí)間不夠又無(wú)法將全部載藥納米粒完全沉淀，分離不完全，測(cè)得的包封率偏小。因此分離時(shí)間的優(yōu)化尤為重要。

3.5 納米粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

納米粒在長(zhǎng)時(shí)間的高速離心［26］、大量稀釋［25］、不合適洗脫劑的作用下，均可能破裂使其中包載的游離藥物泄漏，使測(cè)得的包封率偏小，因此在考察游離藥物回收率的同時(shí)，還需要考察載藥納米粒在分離過(guò)程中結(jié)構(gòu)的變化。

3.6 膜的孔徑和膜材質(zhì)

對(duì)于透析、超濾離心、AF4 法均涉及膜材的選擇，如果在方法學(xué)驗(yàn)證中為追求游離藥物的回收率符合驗(yàn)證要求而選擇過(guò)大孔徑的膜，也可能導(dǎo)致載藥納米粒透過(guò)到濾液中，造成錯(cuò)誤的結(jié)果［11］。因此，必須根據(jù)游離藥物的分子量，對(duì)分離膜的截留分子量進(jìn)行限制，一般不能超過(guò)游離藥物分子量的10 倍。

膜材質(zhì)的選擇問(wèn)題也需要注意，從實(shí)驗(yàn)室常用的Millipore 及Amicon 超濾離心管說(shuō)明書(shū)中得知，其常用的膜材質(zhì)為聚醚砜（PES），僅適用于生物液體及水溶液，對(duì)甲醇的耐受僅≤60%，所以實(shí)驗(yàn)中使用甲醇作為溶劑并不恰當(dāng)，結(jié)果表明超濾離心法測(cè)包封率的重復(fù)性一般，推測(cè)實(shí)驗(yàn)中超濾膜的結(jié)構(gòu)可能已發(fā)生變化［22,27］，因此該研究得到的包封率結(jié)果的準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步考察。

4 應(yīng)對(duì)方法

4.1 通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證可以控制的因素

可以得知，分離條件選擇不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致包封率測(cè)定結(jié)果偏離真實(shí)值。所以對(duì)游離藥物與載藥納米粒的分離方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證是必要的。例如在苦參堿凍干脂質(zhì)體的包封率測(cè)定中［28］，分別使用了透析法、葡聚糖凝膠柱色譜與微柱離心法，每種方法都依次進(jìn)行了條件優(yōu)化及方法學(xué)驗(yàn)證，確定了透析袋及空白脂質(zhì)體對(duì)游離藥物均沒(méi)有吸附、截留作用，透析時(shí)間能夠使游離藥物釋放完全；確定了葡聚糖凝膠柱對(duì)游離藥物沒(méi)有吸附作用，空白脂質(zhì)體的加入不影響游離藥物的洗脫，合適的柱體積，洗脫液的用量及合適的上樣量；確定了制得的微柱對(duì)空白脂質(zhì)體沒(méi)有截留作用，可以將載藥脂質(zhì)體與游離藥物分開(kāi)的離心條件，認(rèn)為此3 種方法都可行。但是3 種方法最終的測(cè)定結(jié)果并不一致，通過(guò)比較，透析法測(cè)定包封率偏低，推測(cè)與脂質(zhì)體中的藥物泄漏有關(guān)，同時(shí)說(shuō)明藥物泄漏問(wèn)題及影響因素難以通過(guò)常規(guī)方法學(xué)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)。

為進(jìn)一步提高方法學(xué)驗(yàn)證的可靠性，還需要對(duì)分離過(guò)程中載藥納米粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，例如莊英華等［29］使用超濾離心法測(cè)定連翹酯苷脂質(zhì)體包封率，通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，證明超濾膜對(duì)連翹酯苷沒(méi)有吸附。其可進(jìn)一步利用定磷法測(cè)定濾液中的磷脂含量［30］，如為陰性，則可確認(rèn)所選擇的超濾離心管可以完全截留住脂質(zhì)體，并且脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)完整沒(méi)有發(fā)生破裂，這樣藥物泄漏可能性就大大降低。

4.2 目前尚不能通過(guò)常規(guī)方法學(xué)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)的因素

在現(xiàn)有的間接測(cè)定包封率的分離方法中，水溶性強(qiáng)的藥物制備的納米制劑比較容易出現(xiàn)方法學(xué)考察驗(yàn)證失真的問(wèn)題，因?yàn)橹灰せ蛘咛盍喜粚?duì)游離藥物產(chǎn)生非特異性吸附，那么通過(guò)加標(biāo)回收的方法，回收率測(cè)定的結(jié)果就一定能滿足方法學(xué)驗(yàn)證的要求。但分離過(guò)程中是否存在載藥納米粒中藥物的泄漏問(wèn)題卻不可得知。

為了克服這個(gè)缺陷，筆者認(rèn)為必須采用更為直接的方法，主要是利用被測(cè)藥物特殊的結(jié)構(gòu)，依靠光譜學(xué)或電化學(xué)技術(shù)，不經(jīng)分離直接地測(cè)定納米制劑中游離藥物的含量。比如COULIBALY 等［31］利用核磁共振定量硼譜（11B-qNMR）基于測(cè)定硼替佐米（BTZ）海藻酸鈉微粒中的BTZ 含量，包封于海藻酸鈉中的BTZ，由于分子的轉(zhuǎn)動(dòng)受到聚合物的抑制，譜峰展寬不干擾游離BTZ 的測(cè)定。AGRAHARI等［32］也采用了類(lèi)似的思路，在31P-qNMR 中游離的含磷化合物會(huì)產(chǎn)生一個(gè)尖峰，而被包封的藥物譜峰會(huì)展寬，可以方便區(qū)分游離藥物和包封藥物。如果能找到合適峰位的吸收峰代表游離藥物的含量，1H-qNMR 也可以用于游離藥物的直接定量［33］。其他的方法還包括電化學(xué)方法，如MORA 等［34］采用伏安法測(cè)定了直接阿霉素的脂質(zhì)體中游離藥物的含量。但這些方法極度依賴藥物及載體輔料的結(jié)構(gòu)特異性和差異性，方法的專屬性很強(qiáng)但通用性仍然較差。因此，還是需要對(duì)載藥納米粒和游離藥物在物理、化學(xué)性質(zhì)等方面的不同點(diǎn)進(jìn)行挖掘，開(kāi)發(fā)出具有不同工作原理的新方法，在各種方法之間進(jìn)行交叉驗(yàn)證，保證測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確。

5 小結(jié)

對(duì)同一納米藥物進(jìn)行包封率測(cè)定時(shí)，應(yīng)當(dāng)分別測(cè)試不同的分離方法，如所得結(jié)果具有明顯差異，則提示應(yīng)當(dāng)根據(jù)待測(cè)物的特性以及結(jié)合實(shí)驗(yàn)實(shí)際優(yōu)選合適的測(cè)定方法，而非僅僅選擇得到包封率測(cè)定結(jié)果最高的方法。

總的來(lái)說(shuō)，在所有的間接測(cè)定法中，超濾離心法是現(xiàn)階段最佳的分離方法，其分離時(shí)間最短，防止包封藥物在分離中的釋放，其分離過(guò)程中也未對(duì)納米粒進(jìn)行稀釋，只要能通過(guò)選擇合適的超濾膜避免非特異性吸附，并結(jié)合對(duì)載藥納米粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的考察，二者相互驗(yàn)證，便能得到現(xiàn)階段最能逼近真實(shí)值的包封率測(cè)定結(jié)果，是可以采用的通用方法。也相信在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中科研工作者能摸索出更多有效的方法在納米藥物包封率測(cè)定的實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮作用。