摘要：本研究以‘ZN-1’和‘保定’苜蓿（Medicago sativa L.‘Baoding’）為試驗材料，以濃度梯度為0 mmol·L-1，40 mmol·L-1和80 mmol·L-1，pH值為9.3的混合鹽堿溶液（NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3摩爾比為1∶1∶1∶1）進行脅迫處理，比較2個紫花苜蓿幼苗的生長指標、生理指標和基因表達（ROS清除、離子轉(zhuǎn)運和光合調(diào)控3類基因）差異，以期為解析紫花苜蓿耐混合鹽堿脅迫響應機制提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，隨著混合鹽堿脅迫濃度的增加，2個紫花苜蓿的株高、干重、葉綠素含量、光合速率以及Fv/Fm等均出現(xiàn)明顯的損傷（Plt;0.05）。其中，‘ZN-1’的耐混合鹽堿性顯著高于‘保定’苜蓿，主要表現(xiàn)為‘ZN-1’的株高和生物量更高、葉綠素含量和抗氧化酶的活性更高，凈光合速率更強，脯氨酸和可溶性糖含量更高，葉片ROS積累量和地下部Na+積累更少，ROS清除、脯氨酸生物合成、Na+液泡區(qū)隔化以及葉綠素維持相關(guān)編碼基因的表達水平更高。因此，脯氨酸生物合成、Na+液泡區(qū)隔化、葉綠素維持以及抗氧化酶可能在‘ZN-1’耐混合鹽堿脅迫中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；混合鹽堿脅迫；生理響應；基因表達

中圖分類號：S541.9 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）04-1044-11

Effects of Mixed Saline-Alkali Stress on Physiology and Gene Expression of Alfalfa Seedlings

ZHU Chen-chen1， SHI Kun1， HE Qin-kun1， ZHENG Yu-qin1， YUAN Feng2， LIU Ya-ling2， WANG Zan1*

Abstract：In this study，two alfalfa （Medicago sativa L.） materials ‘Baoding’ and ‘ZN-1’ were treated with the mixed saline-alkali solution （NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3 in 1∶1∶1∶1 ratio at pH 9.3） at the concentrations of 0 mmol·L-1，40 mmol·L-1 and 80 mmol·L-1，and compared for the tolerance. The morphology，physiology，and expression of the selected genes that are involved in ROS-scavenging，ion transport，and photosynthetic regulation were investigated at the alfalfa seedling stage，to look into the response to mixed saline-alkali stress. The results showed that with the increase of mixed saline-alkali concentration，significant （Plt;0.05） damage was observed in the plant height，dry weight，chlorophyll content，photosynthetic rate，and Fv/Fm，in both the alfalfa materials. Compared with ‘Baoding’，‘ZN-1’ demonstrated significantly higher saline-alkali tolerance，as evidenced by higher plant height，more biomass，more contents of chlorophyll content，proline，and soluble sugar，stronger antioxidant activity，promoted robust photosynthesis，and less accumulation of ROS in leaves and Na+in root. In ‘ZN-1’，the significantly up-regulated genes were associated with the pathways of ROS scavenging，proline biosynthesis，Na+ vacuolar compartmentalization，and chlorophyll maintenance. In summary，proline biosynthesis，Na+ vacuolar compartmentalization，chlorophyll maintenance，and antioxidants may play an important role in the ‘ZN-1’ tolerance of mixed saline-alkali stress.

Key words：Alfalfa;Mixed saline-alkali stress;Physiological responses;Genes expression

土壤鹽堿化是植物主要的非生物脅迫之一，可影響植物建植、減緩生長、引起葉片黃化和早衰、降低產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴重限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力和農(nóng)業(yè)發(fā)展［1］。由于全球氣溫升高、過度施肥和灌溉方法不當?shù)纫蛩?，過量的鹽離子在土壤中層積，導致土壤次級鹽堿化程度不斷加?。?，3］。據(jù)統(tǒng)計，中國的鹽堿化土地約1億公頃，占全國總耕地面積的10%［4］，近年來鹽堿地面積仍在不斷擴大。培育耐鹽堿植物對解決我國土壤鹽堿化問題、提高鹽堿地利用率、改善鹽堿地土壤結(jié)構(gòu)特性具有重要意義。

土壤鹽堿化，包括由中性鹽（NaCl和Na2SO4）引起的鹽脅迫、堿性鹽（Na2CO3和NaHCO3）引起的堿脅迫以及二者引起的混合鹽堿脅迫。鹽脅迫主要對植物產(chǎn)生滲透脅迫和離子脅迫［2，3］，限制植物對土壤水分和養(yǎng)分的吸收；在鹽脅迫的基礎(chǔ)上，堿脅迫還會嚴重干擾細胞pH值穩(wěn)定性，啟動活性氧（Reactive oxygen species，ROS）破壞細胞膜完整性，抑制光合作用［5］。我國鹽堿地多以混合鹽堿為主，研究表明，較單一鹽脅迫和堿脅迫，混合鹽堿脅迫對植物的株高［6］、生物量和干重［7］、葉綠素含量［8］及光合作用［9］等具有更強的抑制作用。為了適應土壤鹽堿化，植物已經(jīng)形成包括生理調(diào)控（如離子吸收和轉(zhuǎn)運［6，10，11］、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累［12，13］、抗氧化酶活性增加［7］）和分子調(diào)控（如相關(guān)鹽堿脅迫響應基因簇的表達［12，14］）等在內(nèi)的多種響應機制。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上最重要的多年生豆科牧草之一，因其品質(zhì)好、蛋白含量高、生態(tài)適應性廣等優(yōu)勢［15，16］，被稱為“牧草之王”。據(jù)統(tǒng)計，我國苜蓿干草進口量已經(jīng)從2007年的0.3萬噸迅速增加到2021年的199.2萬噸［17］，優(yōu)質(zhì)苜蓿干草進口壓力巨大。然而，作為我國苜蓿主產(chǎn)地之一的寧夏地區(qū)，土壤鹽堿化嚴重，且多為NaCl，Na2SO4，NaHCO3和Na2CO3的混合型次生鹽堿地，pH值一般在8.0～9.5之間，有些地區(qū)甚至高達10.4［18］，嚴重限制了苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。前期對紫花苜蓿耐鹽堿性的研究多以單鹽脅迫（如NaCl）［19，20］或單堿脅迫（NaHCO3或Na2CO3）［21，22］為主，對于模擬大田環(huán)境中含四種鹽成分的混合鹽堿脅迫對紫花苜蓿幼苗的影響探究較少。因此，本研究以課題組培育的紫花苜蓿新品系‘ZN-1’和鹽敏感地方品種‘保定’紫花苜蓿為試驗材料，設(shè)置pH值為9.3，不同濃度梯度（0 mmol·L-1，40 mmol·L-1和80 mmol·L-1）的混合鹽堿溶液（NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3摩爾比為1∶1∶1∶1）進行處理，通過檢測混合鹽堿脅迫下紫花苜蓿的幼苗生長指標、生理響應和基因表達變化，比較不同基因型紫花苜蓿對混合鹽堿脅迫的響應差異，為研究紫花苜?；旌消}堿脅迫響應機制和培育耐混合鹽堿紫花苜蓿新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為‘ZN-1’和‘保定’（M. sativa L.‘Baoding’）紫花苜蓿，均由中國農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學與技術(shù)學院牧草基因資源與遺傳改良實驗室保存并提供，其中‘ZN-1’是該實驗室培育的紫花苜蓿新品系。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于中國農(nóng)業(yè)大學溫室進行。從供試紫花苜蓿種子中挑選顆粒飽滿的籽粒播種在裝有栽培基質(zhì)（營養(yǎng)土與蛭石1∶1等體積混合）的50孔穴盤中育苗，每孔播種4～5粒種子，20 d后選擇生長健壯且長勢一致的幼苗移栽至塑料花盆（直徑10 cm，高10 cm），每盆定苗3株，再生長20 d后將幼苗隨機分為3組（1個對照組和2個脅迫組），每組5盆材料，開始進行混合鹽堿脅迫處理。

根據(jù)王曉春等［23］、張曉磊等［24］以及Wang等［25］的研究，結(jié)合中國寧夏鹽堿地情況［18］及預實驗結(jié)果，NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3摩爾比為1∶1∶1∶1，pH值為9.3左右的混合鹽堿溶液能夠較好的區(qū)分開不同紫花苜蓿間的耐混合鹽堿性。因此，將NaCl，Na2SO4，NaHCO3和Na2CO3四種鹽以摩爾比1∶1∶1∶1的比例分別配置40 mmol·L-1（鹽濃度0.39%）和80 mmol·L-1（鹽濃度0.78%）的混合鹽堿溶液，用HCl調(diào)整溶液pH值為9.3。對2個脅迫組幼苗分別澆灌100 mL濃度為40 mmol·L-1和80 mmol·L-1的混合鹽堿溶液，對照組則澆灌100 mL蒸餾水（0 mmol·L-1），每3 d重復澆灌一次相應溶液，期間定期澆灌相同體積的營養(yǎng)液。脅迫第28 d開始測定生長、生理指標及基因表達量。將不同處理下的紫花苜蓿同一位置的葉片剪下放入錫箔紙中做好標記，立即置于液氮中，充分冷凍后于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)指標測定。

1.3 指標和測定方法

1.3.1 生長指標 株高（cm）：用量尺測量基部到最高位置。地上、地下干重（g）：將地上和地下部分開洗凈，在烘箱105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重，天平分別稱量地上和地下部干重［26］。

1.3.2 生理指標 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測定：采用酸性茚三酮顯色法測定脯氨酸含量［27］，采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量［27］。

Na+和K+含量測定：分別取地上和地下部烘干的樣品，粉碎過篩后稱取約100 mg，用HNO3-H2O2反應體系消解，采用原子吸收法［28］分別測定地上和地下部的鈉和鉀元素含量。

葉綠素含量測定：采用乙醇丙酮提取法［27］。同時采用多光譜成像技術(shù)檢測紫花苜蓿葉片葉綠素含量，具體方法為，脅迫處理結(jié)束后，隨機選取同一位置的葉片，將其放置在多光譜成像儀Videometer Lab（Videometer A/S，丹麥）中，按照王雪萌等［29］的方法獲取多光譜圖像，使用VideometerLab v3.14軟件去除背景，獲得645 nm波長下的歸一化標準判別分析（normalized canonical discriminant analysis，nCDA）圖像。

H2O2和O2-含量和抗氧化酶活性檢測：分別使用3，3-二氨基苯聯(lián)胺（Diaminobenzidine，DAB）和氯化硝基四氮唑藍（Nitrotetrazolium blue chloride，NBT）染色技術(shù)通過組織化學染色法檢測紫花苜蓿葉片的過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）和超氧陰離子（O2-）積累水平［30］。采用氮藍四唑法測定SOD活性［31］，采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性［32］。

葉片光合和葉綠素熒光參數(shù)：在晴朗天氣的上午09：00—11：30，選取頂端自上而下第三至五片葉子，使用便攜式光合測量儀LI-6400（Li-Cor，美國）測定凈光合速率、氣孔導度和胞間CO2。使用便攜式葉綠素熒光儀MultispeQ（Photosynq，美國）［33］測定葉片PSII的有效量子產(chǎn)率（Effective quantum yield of PSII，Y（II）），非光化學淬滅（Non-photochemical quenching，NPQ）和PSⅡ最大光化學量子產(chǎn)量（Maximum efficiency of photosystem II，F(xiàn)v/Fm）［34］。

1.3.3 基因表達檢測 使用RN09-EASY spin RNA快速提取試劑盒（艾德萊，中國）提取植株的總RNA，PC5801-TRUEscript RT Master Mix試劑盒（艾德萊，中國）進行反轉(zhuǎn)錄，將其作為模板，以MsActin為內(nèi)參（表1），使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒（諾唯贊，中國）進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR），采用2-ΔCT［13］的算法計算表達量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用GraphPad Prism 8和SPSS 26.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，用GraphPad Prism 8和Adobe Photoshop CS4作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合鹽堿脅迫對紫花苜蓿生長的影響

通過觀察不同混合鹽堿濃度下2個紫花苜蓿的表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著濃度升高，植株葉片萎蔫程度和褪綠程度均增加，且株高逐漸變矮（圖1 A和B）；但在80 mmol·L-1混合鹽堿處理后，‘ZN-1’仍有部分葉片未出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，但‘保定’苜蓿葉片幾乎全部萎蔫（圖1 A）。在脅迫處理結(jié)束后，測量了2個紫花苜蓿的株高、地上生物量和地下生物量，混合鹽堿脅迫顯著降低了紫花苜蓿的生物量（圖1B～D）。在40 mmol·L-1混合鹽堿脅迫下，2個紫花苜蓿的株高和生物量均無顯著差異，‘ZN-1’的株高和地上生物量略高于‘保定’苜蓿；在80 mmol·L-1混合鹽堿脅迫下，‘ZN-1’的地上生物量顯著高于‘保定’苜蓿。在混合鹽堿脅迫處理下，‘ZN-1’的耐混合鹽堿性強于‘保定’苜蓿。

2.2 混合鹽堿脅迫下紫花苜蓿葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化

鹽堿脅迫會對植株產(chǎn)生滲透脅迫，植物為應對滲透脅迫，可以通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如脯氨酸和可溶性糖等）的含量響應鹽堿脅迫。因此，我們進一步檢測了混合鹽堿脅迫下脯氨酸和可溶性糖含量的變化。由圖2可知，在正常生長條件下，2個紫花苜蓿的脯氨酸含量和可溶性糖含量無顯著差異；混合鹽堿脅迫處理后，脯氨酸的含量顯著升高（Plt;0.05），且‘ZN-1’葉片中脯氨酸含量顯著高于‘保定’（Plt;0.05，圖2 A）。在40 mmol·L-1混合鹽堿處理后，‘保定’苜蓿葉片中的可溶性糖含量顯著高于‘ZN-1’（Plt;0.05），但在80 mmol·L-1混合鹽堿處理后，‘ZN-1’葉片中的可溶性糖含量顯著高于‘保定’苜蓿（Plt;0.05，圖2 B）。在高濃度的混合鹽堿脅迫下，‘ZN-1’可以合成更多的脯氨酸和可溶性糖，從而緩解滲透脅迫引起的傷害，表現(xiàn)出了更強的耐混合鹽堿性。

2.3 混合鹽堿脅迫下紫花苜蓿莖和根中K+和Na+含量變化

脅迫處理結(jié)束后，檢測了2個紫花苜蓿地上和地下K+和Na+含量。地上部，除40 mmol·L-1鹽堿脅迫處理下‘ZN-1’地上部K+含量顯著高于‘保定’（Plt;0.05），其余均無顯著差異；地下部，除80 mmol·L-1鹽堿脅迫處理下‘保定’地下部的Na+含量顯著高于‘ZN-1’（Plt;0.05），其余均無顯著差異（圖3）。由于根的抗逆性從某種程度上決定了植物的抗性，因此，地下部的Na+過量積累可能是因為‘保定’苜蓿耐混合鹽堿性較低。

2.4 混合鹽堿脅迫下紫花苜蓿光合作用和葉綠素含量的變化

在脅迫處理結(jié)束后，測量了2個紫花苜蓿葉片的光合作用、光合熒光參數(shù)和葉綠素含量。由圖4可知，混合鹽堿脅迫嚴重限制了紫花苜蓿的光合作用。在混合鹽堿脅迫下，‘ZN-1’的凈光合速率（圖4 A）、氣孔導度（圖4B）和胞間CO2濃度（圖4C）均顯著高于‘保定’（Plt;0.05）；在80 mmol·L-1的鹽堿脅迫下，‘ZN-1’的Y（II）（圖4D）和Fv/Fm（圖4E）也顯著高于‘保定’（Plt;0.05）。在混合鹽堿脅迫下‘ZN-1’的光合作用能力強于‘保定’，與生物量（圖1C和D）結(jié)果一致。另外，NPQ是植物或藻類在光照過強時的一種光保護機制，即植物耗散過剩光能為化學能的能力［36］；但當植物遭到強烈脅迫時，葉片嚴重損傷，不能有效利用光能，主要以化學能的形式耗散，因此，NPQ會大量增加。在80 mmol·L-1混合鹽堿脅迫下，‘保定’的NPQ顯著高于‘ZN-1’（Plt;0.05，圖4E），表明高濃度混合鹽堿脅迫下，‘保定’的葉片損傷程度高于‘ZN-1’。

由圖5可知，混合鹽堿脅迫減少了紫花苜蓿葉片的葉綠素含量，葉綠素a（圖5B）、葉綠素b（圖5A和C）和葉綠素總含量（圖5D）均顯著下降（Plt;0.05）。正常生長條件下，2個紫花苜蓿葉片中的葉綠素含量無顯著差異，但在混合鹽堿脅迫下，‘ZN-1’葉片的葉綠素含量均顯著高于‘保定’（Plt;0.05）。

2.6 混合鹽堿脅迫下紫花苜蓿ROS水平和抗氧化酶活性的變化

通過NBT和DAB染色技術(shù)檢測了2個紫花苜蓿葉片中O2-和H2O2的積累水平。如圖6所示，混合鹽堿脅迫下，O2-（圖6A）和H2O2（圖6B）含量均極大增加；在80 mmol·L-1混合鹽堿脅迫下，‘保定’苜蓿的O2-和H2O2的積累量均大于‘ZN-1’。以上結(jié)果表明在混合鹽堿脅迫下，‘保定’苜蓿產(chǎn)生了更多的活性氧，造成嚴重的氧化傷害?？寡趸窼OD和POD活性檢測結(jié)果表明，在混合鹽堿脅迫處理下，2個紫花苜蓿的SOD酶活性變化不顯著，但POD活性顯著增加，且‘ZN-1’的POD活性顯著高于‘保定’（Plt;0.05）。因此，‘ZN-1’的POD酶活性較高可能是其ROS水平相對較低的原因。

2.7 混合鹽堿脅迫對紫花苜蓿鹽堿脅迫相應相關(guān)基因表達水平的影響

基于表型和生理指標，我們進一步檢測了混合鹽堿脅迫下，ROS清除、離子轉(zhuǎn)運和葉綠素降解等相關(guān)基因的變化（圖7）。首先，在ROS清除和脯氨酸合成方面，我們檢測了POD、SOD和APX等抗氧化酶編碼基因［14，37］、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶編碼基因GSTU8（glutathione transferase）、黃酮醇合成酶編碼基因FLS13（flavonol synthase）［38-39］、查爾酮異構(gòu)酶編碼基因CHI-B（chalcone isomerase）［40］、F-Box家族的MsFTL［35，41］以及脯氨酸合成酶基因MsP5CS1等基因的表達量。結(jié)果表明，在80 mmol·L-1混合鹽堿脅迫下，這些基因都受到顯著誘導表達，其中在40 mmol·L-1混合鹽堿脅迫下，‘ZN-1’ 中MsPOD表達量顯著高于‘保定’苜蓿（Plt;0.05），其他基因均無顯著差異；在80 mmol·L-1混合鹽堿脅迫下，除MsPOD和MsGSTU8的表達量二者無顯著差異，其余基因的表達量在‘ZN-1’中均顯著高于‘保定’苜蓿（Plt;0.05，圖7 A）。其次，在離子轉(zhuǎn)運方面，我們檢測了Na+轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因SOS1（salt overly sensitive）［42］，液泡膜上的Na+/H+反轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因NHX1（tonoplast Na+/H+ antiporter）［43］的表達量。結(jié)果顯示，80 mmol·L-1混合鹽堿脅迫顯著誘導MsSOS1的表達（Plt;0.05），但2個紫花苜蓿MsSOS1表達無顯著差異；MsNHX1基因在混合鹽堿脅迫下表達量均增加，且‘ZN-1’的MsNHX1表達水平顯著高于‘保定’苜蓿（Plt;0.05，圖7 B）。另外，在光合作用方面，我們檢測了可以延緩植物葉片葉綠素降解的基因SGR（STAY-GREEN）［44-46］和Rubisco亞基穩(wěn)定性相關(guān)基因RbcX2［47］的表達量。由圖7C可知，在正常生長條件下，MsSGR1和MsRbcX2的表達水平較低，當受到混合鹽堿脅迫后，MsSGR1和MsRbcX2基因表達量均顯著上調(diào)（Plt;0.05），且脅迫濃度越高，基因表達水平越高，并且‘ZN-1’中MsSGR1和MsRbcX2基因表達水平顯著高于‘保定’苜蓿（Plt;0.05）。

3 討論

紫花苜蓿作為全球最重要的飼草資源之一，但中國紫花苜蓿主產(chǎn)區(qū)嚴重的土壤鹽堿化極大地限制了紫花苜蓿的生長和品質(zhì)。本研究通過設(shè)置不同濃度（0 mmol·L-1，40 mmol·L-1，80 mmol·L-1）的混合鹽堿脅迫，發(fā)現(xiàn)在40 mmol·L-1混合鹽堿脅迫處理下紫花苜蓿的地下干重與對照無顯著差異（圖1 D），但地上干重和株高都顯著受到抑制（圖1A～C）；80 mmol·L-1混合鹽堿脅迫處理進一步加劇了抑制作用，地下生物量也顯著降低，并且‘保定’苜蓿的生長受到更嚴重的抑制（圖1）。這與張曉磊等［24］研究結(jié)果一致：混合鹽堿（NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3，1∶1∶1∶1，pH值為9.26～9.31）濃度≤50 mmol·L-1對紫花苜蓿根系影響不大且具有一定的促進作用，但100 mmol·L-1（pH值為9.44）的混合鹽堿便嚴重影響紫花苜蓿根系生長。而劉晶等［48］認為100 mmol·L-1的NaCl對紫花苜蓿無顯著抑制作用，200 mmol·L-1的NaCl才開始對紫花苜蓿造成不同程度的損傷。這說明相同鹽濃度下，混合鹽堿脅迫比單鹽脅迫對紫花苜蓿造成的傷害更大，Wang等［25］發(fā)現(xiàn)的“pH值為7.0 （NaCl∶Na2SO4，1∶1）和8.0（NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3，1∶2∶1）的200 mmol·L-1的鹽堿脅迫對紫花苜蓿的傷害不大，但當pH值升高至9.0（NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3，1∶1∶1∶1）或10.0（NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3，9∶1∶1∶9）時，紫花苜蓿的光合系統(tǒng)、氮代謝和滲透調(diào)節(jié)均受到嚴重損傷”能夠證明高pH值對紫花苜蓿的影響。因此，本研究中的40 mmol·L-1和80 mmol·L-1的混合鹽堿對紫花苜蓿造成的傷害可能是由高pH值（9.3）引起的。

離子脅迫是鹽堿脅迫引起的直接脅迫之一，植物已進化出一系列應對機制，其中Na+外排和液泡區(qū)隔化發(fā)揮重要作用［42，43］。于明倩等［49］研究表明，隨鹽堿脅迫濃度的增加（50 mmol·L-1和100 mmol·L-1），紫花苜蓿根系的Na+增加、K+降低、Na+/K+升高。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著混合鹽堿濃度的增加，無論是紫花苜蓿的地上還是地下部，Na+含量均顯著增加（圖3 A和D），K+/Na+比值顯著下降（圖3 C和F）；地下部分的K+含量顯著降低（圖3 E），而地上部分的K+含量有一定程度的增加（圖3 B），且‘ZN-1’和‘保定’苜蓿的地上和地下部分K+/Na+比值差異不大（圖3 C和F）。一方面，這與武祎等［28］在黃花苜蓿中發(fā)現(xiàn)的鹽或堿脅迫下地上部分K+含量變化不顯著的結(jié)果相似，可能存在其他陽離子（如Ca2+、Mg2+）轉(zhuǎn)運調(diào)控機制；另一方面，也可能是離子毒害不足以區(qū)分‘ZN-1’和‘保定’苜蓿2個紫花苜蓿間的耐混合鹽堿性，二者之間的差異可能主要由較高pH值的堿脅迫造成的。另外，基因檢測發(fā)現(xiàn)，2個紫花苜蓿葉片中的Na+外排調(diào)控基因MsSOS1表達量無顯著差異，但Na+液泡區(qū)隔化調(diào)控基因MsNHX1在‘ZN-1’中的表達量顯著高于‘保定’苜蓿（圖7 B），表明Na+的液泡區(qū)隔化作用在紫花苜?！甖N-1’的耐混合鹽堿中發(fā)揮重要作用。因此，堿脅迫在評估‘ZN-1’和‘保定’苜蓿2個紫花苜蓿間的耐混合鹽堿性中發(fā)揮的作用還需要設(shè)計實驗進一步驗證。

鹽堿脅迫造成的植物葉綠體降解會影響光合作用，葉綠素含量在一定程度上能夠反映植物抗逆性［50］。林霞等［51］研究表明50 mmol·L-1和200 mmol·L-1的NaCl脅迫均對無柄小葉榕的葉綠素含量沒有顯著影響。王曉春等［23］認為有的紫花苜蓿品種在鹽濃度≤0.6%的混合鹽堿脅迫下葉綠素含量沒有顯著變化。本研究發(fā)現(xiàn)隨著混合鹽堿脅迫濃度的增加，紫花苜蓿的葉綠素降解程度顯著增加（圖5），但‘ZN-1’的葉綠素含量仍顯著高于‘保定’苜蓿，光合作用也相對更強（圖4），進一步的基因表達分析發(fā)現(xiàn)葉綠素維持基因MsSGR1和Rubisco亞基穩(wěn)定基因MsRbcX2的表達在‘ZN-1’中均顯著高于‘保定’苜蓿（圖7 C），表明葉綠素維持是紫花苜?！甖N-1’抵抗混合鹽堿脅迫的重要機制。另外，鹽堿脅迫下的光合速率降低受到氣孔因素和非氣孔因素的影響。于明倩等［49］發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫明顯降低了紫花苜蓿幼苗的光合速率和氣孔導度，增加了胞間CO2濃度。本研究發(fā)現(xiàn)在混合鹽堿脅迫下紫花苜蓿葉片的光合速率、氣孔導度和胞間CO2均顯著下降（圖4）。其中，40 mmol·L-1混合鹽堿脅迫并未引起Fv/Fm和NPQ的變化（圖4），80 mmol·L-1混合鹽堿脅迫導致Fv/Fm和Y（II）顯著降低，NPQ顯著增加，同時氣孔導度及胞間CO2下降幅度變小，說明氣孔導度是低濃度混合鹽堿脅迫下凈光合速率降低的原因，高濃度混合鹽堿脅迫下的光合速率下降是氣孔和非氣孔因素共同調(diào)控的結(jié)果，這與林霞等［51］的結(jié)論一致。

在正常生長條件下，植物體內(nèi)的ROS含量維持在一定水平，在ROS形成和清除之間維持動態(tài)平衡［52-53］，遭到環(huán)境脅迫后，植物體內(nèi)大量產(chǎn)生活性氧，引起氧化傷害，破壞細胞氧化還原平衡［54］。植物通過提高過氧化物酶的活性，清除過量活性氧，維持活性氧平衡。本研究發(fā)現(xiàn)在混合鹽堿脅迫下，紫花苜蓿也會大量產(chǎn)生活性氧（圖6 A和B），且過氧化物酶的活性會顯著增加（圖6C和D）。另外，黃酮醇途徑［39］是植物抗氧化的重要途徑，黃酮醇生物合成關(guān)鍵基因FLS13和CHI-B的表達水平在混合鹽堿脅迫下顯著增加，且在2個紫花苜蓿中具有顯著差異。因此，紫花苜蓿‘ZN-1’可以通過抗氧化物酶以及黃酮醇途徑降低混合鹽堿脅迫下的ROS水平，從而提高對混合鹽堿脅迫的耐受性。

4 結(jié)論

本研究以‘ZN-1’和‘保定’2個紫花苜蓿材料為研究對象，進行不同濃度的混合鹽堿脅迫處理，通過脅迫表型分析、生理響應和分子響應相關(guān)指標的檢測，從紫花苜蓿生長表型、滲透調(diào)節(jié)、光合作用、離子平衡和ROS清除等幾個方面探討了紫花苜蓿對混合鹽堿脅迫的可能響應機制，比較了2個紫花苜蓿耐混合鹽堿性的差異，發(fā)現(xiàn)‘ZN-1’的耐混合鹽堿性高于‘保定’苜蓿，脯氨酸合成、Na+液泡區(qū)隔化、葉綠素維持機制以及抗氧化酶和黃酮醇途徑可能是其耐混合鹽堿脅迫的重要機制，為耐混合鹽堿紫花苜蓿新品種的選育及機制研究提供理論基礎(chǔ)。

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（責任編輯 彭露茜）

收稿日期：2024-01-12;修回日期：2024-03-20

基金項目：國家草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心（籌）重大創(chuàng)新平臺建設(shè)專項（CCPTZX2023B04）；國家林業(yè)和草原種質(zhì)資源庫（2005DKA21003）資助

作者簡介：朱晨晨（1996-），女，漢族，山東聊城人，博士研究生，主要從事牧草基因資源挖掘與利用的相關(guān)研究，E-mail：zhucc@cau.edu.cn；*通信作者Author for correspondence，E-mail：zanwang@cau.edu.cn