姚悅 余庭庭 張瑞 包會英 周會玲

摘 要 為探究茶樹葉提取物與殼聚糖復配處理對蘋果采后主要病害的影響，首先通過離體試驗篩選具有最佳抑菌效果的復配組合，以‘短枝富士蘋果為材料，采用復配組合浸泡果實10 s，24 h后接種擴展青霉（Penicilliosis.expansum）或灰葡萄孢（Botrytis.cinerea）的方法，研究了抗病相關生理指標。結果表明：20%茶樹葉提取物與1.5%殼聚糖等比復配抑菌效果最佳;與對照組和殼聚糖處理組相比，茶樹葉復配殼聚糖處理組蘋果青霉病和灰霉病病斑顯著降低（P＜0.05）；幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活力提高，苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸-4-羥化酶活性升高，總酚、類黃酮和木質素累積（P＜0.05）?？梢?，茶樹葉復配殼聚糖可通過誘導蘋果病程相關蛋白和苯丙烷代謝途徑中關鍵酶響應，促進抗性次生代謝物質積累，抑制病斑直徑，減緩病害發(fā)生。

關鍵詞 蘋果；茶樹葉；殼聚糖；青霉??；灰霉病

蘋果（Malus domestica）屬于薔薇科（Rosoideae）蘋果亞科（Maloideae）蘋果屬（Malus）植物，營養(yǎng)價值高，富含礦物質和維生素［1］。在采后貯藏過程中，蘋果會發(fā)生一系列生理變化，硬度下降，營養(yǎng)物質分解等；長期貯藏的蘋果不僅品質快速下降，而且由于微生物作用將導致腐爛損失加重，嚴重影響商品價值，大幅降低經(jīng)濟效益［2］。病原菌侵染是引起蘋果采后貯運中腐爛損失的主要原因，部分病原菌如擴展青霉、灰葡萄孢等，具有較高生存能力，在低溫貯藏期間仍會感染果實，加大了蘋果采后貯藏期間的防治難度［3］。目前，防治侵染性病害多依賴化學殺菌劑，雖然其防治操作便捷，短時間內(nèi)效果明顯，但廣泛使用化學試劑已經(jīng)造成了愈加嚴峻的食品安全與環(huán)境污染等問題；并且由于病原菌的遺傳靈活性和高進化潛力，化學殺菌劑作用往往受到抗藥性病原菌株削弱，需要通過加大藥劑使用量和施用次數(shù)才能達到預期防治效果［4］。再者，多數(shù)情況下生物拮抗菌防治不具有廣譜的抑菌效果，對于感病情況較為復雜的采后病害綜合防治效果較弱［5］。然而，與化學藥劑和生物防治相比，植物源抑菌的優(yōu)勢在于來源豐富、食用安全、環(huán)境友好，且多重組分使其具有廣譜、多靶點的抑菌效應。近年來，國內(nèi)外已有多篇植物源成分對果蔬保鮮的相關報道，表明其具有降低果蔬采前和采后病害的發(fā)生率的功效。Augustin等［6］研究發(fā)現(xiàn)大蒜、生姜和螺旋藻的提取物涂抹對芒果減緩失重率和硬度降低，延長其貨架期，推遲葉綠素分解和果實成熟有明顯效果。Givi等［7］研究表明，75%和100%的石榴皮提取物通過增加果皮總酚和類黃酮含量，提高苯丙氨酸解氨酶活性，降低溫州蜜柑的侵染率和病斑直徑。天然物質茶樹葉含有許多功效成分如茶蛋白、茶多酚、茶多糖、咖啡堿、茶葉皂甙、B氨基丁酸、茶氨酸、茶色素等［8］，尤其是茶多酚具有高效的抑菌作用，清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用等功效［9］。茶多酚中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠促肽聚糖降解，阻礙病原菌細胞壁形成；還有研究認為茶多酚可與活性氧化物反應產(chǎn)生過氧化氫，從而發(fā)揮抑菌效果［10-11］。雖然茶多酚抑菌作用研究很多，但目前關于利用老、舊茶樹葉提取物抗病作用的研究較少。為了探究茶樹葉提取物對蘋果采后抗病性，本試驗利用成膜性和抑菌作用良好的殼聚糖［12］與茶樹葉提取物復配，分析可降解真菌細胞壁主要成分的病程相關蛋白與苯丙烷代謝途徑關鍵酶活性趨勢，以及直接抑菌物質含量變化，討論復配組合防治采后病害效用，以期為茶樹葉提取物在果實保鮮方面的應用提供理論依據(jù)，為蘋果采后病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茶樹葉于5月底采自西北農(nóng)林科技大學茶葉綜合實驗站‘陜茶一號，要求無明顯病蟲害。短枝富士蘋果（Malus domestica ‘Fuji）采自西北農(nóng)林科技大學千陽蘋果試驗站，要求大小均勻，成熟度、著色基本一致，且無病蟲害和機械損傷。

擴張青霉（Penicilliosis.expansum）和灰葡萄孢（Botrytis.cinerea）分離于感染青霉病和灰霉病的蘋果果實純化所得。兩菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)7 d，以體積分數(shù)為0.05% Tween-80的無菌水稀釋為105 mL-1的病原菌孢子懸浮液以備用。

茶多酚標準品（純度99%），上海源葉生物公司；幾丁質、苯丙氨酸、抗壞血酸、苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfurylfluoride，PMSF）、昆布多糖、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），美國Sigma公司；殼聚糖（98%脫乙酰度殼聚糖）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、乙二胺四乙酸二鈉、β-巰基乙醇、3，5-二硝基水楊酸、Tris-HCl、甲醇、丙三醇、TritoX-100、鹽酸、磷酸、無水醋酸鈉、冰醋酸、鹽酸羥胺、亮抑酶肽，陜西中楊生物公司。

1.2 儀器設備

超高效液相色譜儀（HPLC），美國安捷倫科技有限公司；BX51正置熒光顯微鏡+X71倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社；I3X型多標記微孔板檢測系統(tǒng)，美國Molecular Devices；A11型液氮研磨儀，德國IKA公司；JXN-26高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶樹葉提取物制備 試驗樣品茶樹葉參考楊莉莉［13］水提法。取10 g茶樹葉浸于200 mL乙醇水溶液（體積分數(shù)50%）中，溫水浴55 ℃浸提2 h，再借助旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸餾使乙醇充分揮發(fā)，再以純水定容至100 mL。

1.3.2 茶樹葉提取物成分及濃度分析 采用HPLC法測定茶樹葉提取物成分與濃度。色譜條件為：色譜柱C18，流動相由10%甲酸（A）和乙腈（B）組成，梯度洗脫，流速1 mL/min，進樣量10? μL，柱溫30 ℃，參考波長280 nm［14］。

稱取茶多酚標準品20 mg于50 mL的小燒杯中，少量10%甲酸溶解，定容于25 mL容量瓶，作為茶多酚標準品儲備液。逐級稀釋一系列不同質量濃度的標準溶液，0.45 μm濾膜過濾，進行HPLC分析。分別移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL茶多酚標準品儲備液于10 mL容量瓶中，10%甲酸定容，重復3次。以積分峰面積為橫坐標，茶多酚標準品質量濃度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 單因素試驗設計 分別含有料液比20%、15%、10%、5%的茶樹葉提取物或體積分數(shù)2%、1.5%、1%、0.5%的殼聚糖的PDA培養(yǎng)基上，接種20 μL 105 mL-1擴展青霉或灰葡萄孢孢子懸浮液，于培養(yǎng)箱（25 ℃、避光）培養(yǎng)7 d，記錄菌落直徑。每組合3次重復，根據(jù)抑菌率判斷兩種物質的作用效果。

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.3.4 復配組合篩選 采用離體試驗篩選茶樹葉提取物與殼聚糖優(yōu)勢復配組合，試驗因素及水平見表1。于培養(yǎng)皿中加入5 mL復配劑（提取? 物∶殼聚糖=1∶1），后倒入20 mL PDA培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中注入20 μL? 105mL-1擴展青霉或灰葡萄孢孢子懸浮液，于培養(yǎng)箱（25? ℃、避光）培養(yǎng)? 7 d，記錄菌落直徑，每組合3次重復，根據(jù)抑菌率篩選優(yōu)勢復配組合。再以優(yōu)勢復配劑組合浸泡果實10 s，取出后自然風干，對照組采用清水相同處理，室溫放置60 d，統(tǒng)計腐爛率。每組合3次重復，每次重復30個果，根據(jù)腐爛率篩選最優(yōu)復配組合。

腐爛率=腐爛果數(shù)/總果數(shù)×100%

1.3.5 復配劑抗病性試驗 蘋果果實先經(jīng)75%酒精表面消毒后分為復配組、殼聚糖組和對照組，復配組為離體試驗篩選的最佳組合，殼聚糖組為1.5%殼聚糖溶液，對照組為清水。每個處理組含60個果實，分別浸泡10 s取出自然晾干，24 h后，在果實赤道部位陰陽兩面分別接種5? μL菌懸液，用塑料薄膜覆蓋置于溫度25 ℃、相對濕度90%室內(nèi)。每組處理固定30個果，用于每日測量病斑直徑情況，另30個果實每天取病斑周圍1～2 cm內(nèi)健康果肉組織，用液氮迅速冷凍后磨成粉末狀，于-80 ℃保存，后續(xù)測定抗性代謝酶活力及次生代謝物質含量。每組處理重復3次。

1.3.6 測定指標與方法 幾丁質酶（chitinase，CHI）和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase，GLU）活力測定，參照王大蔣等［15］的方法測定，略做修改。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine amonialyase，PAL）活力測定，參照曹建康等［16］的方法測定，略做修改。

肉桂酸-4-羥化酶（trans-cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）活力測定，參照Liu等［17］的方法測定，略做修改。

總酚和類黃酮含量測定，參照Toor等 ［18］的方法測定總酚和類黃酮含量，并以每克果肉在280 nm和325 nm波長處的OD值分別表示總酚和類黃酮含量，略作調(diào)整。

木質素含量測定，參照周會玲等［19］的方法測定木質素含量，并以每克果肉在280 nm波長處的OD值表示木質素含量，略作調(diào)整。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用MS Office Excel 2019軟件整理數(shù)據(jù)并繪圖，采用SPSS 23.0軟件的LSD法和ANOVA鄧肯氏多重差異法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 茶樹葉提取物成分及濃度確定

通過HPLC數(shù)據(jù)分析知茶樹葉提取物和茶多酚標準品在相同的保留時間出峰，得茶樹葉提取物得主要成分為茶多酚。其次，以不同質量濃度標準溶液的積分峰面積為橫坐標，茶多酚標準品質量濃度為縱坐標，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線定量分析提取物中的茶多酚濃度（圖1）。

茶多酚標準品擬合方程為y=1.32×10-5x+0.035 2，相關系數(shù)r=0.999 1，說明茶多酚質量濃度為0.040～0.280 mg/mL，峰面積與質量濃度呈良好線性關系，可按標準曲線法進行定量分析。移取茶樹葉提取物10 μL，采用“1.3.2”節(jié)中液相色譜條件分析，重復3次，得積分峰面積平均值為1.63×104，代入擬合方程，可得茶樹葉提取物中茶多酚含量為0.250 mg/mL。

2.2 單因素試驗結果

圖2為茶樹葉提取物和殼聚糖在不同濃度下的抑菌效果，兩者在各自濃度梯度下的抑菌率均表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）。由下圖可知，茶樹葉提取物料液比為20%、15%和10%時抑菌率遠高于殼聚糖，5%提取物和0.5%殼聚糖的抑菌率相似。

2.3 不同復配組合抑菌效果比較

依照“1.3.3”節(jié)中試驗組合，通過抑菌率比較不同組合對擴展青霉和灰葡萄孢的離體抑制作用。圖3為不同組別在離體條件下抑菌率，無論接種P.expansum還是B.cinerea，組合1、組合2、組合3和組合5的抑菌率顯著優(yōu)于其他組合（P<0.05）。隨茶樹葉提取物與殼聚糖濃度降低，病原菌的生長抑制率呈下降趨勢。其中組合1、組合2、組合5對兩種病原菌的生長抑制率均達到100%，具有良好的抑菌效果，故組合1、組合2和組合5為離體抑菌中的優(yōu)勢組合，并且結合單因素實驗結果可認為每個組合中茶樹葉提取物的抑菌作用高于殼聚糖。

將組合1、組合2與組合5分別處理果實? 10 s，篩選最佳復配劑。從圖4可看出，貯藏60 d后對照腐爛率61.08%，3個組合分別是? 32.65%、18.98%、37.29%。與CK組相比，3種組合均能顯著降低腐爛率，其中組合2表現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01），即組合2為最優(yōu)復配組合。在3個組合配比中，組合2（20%茶樹葉提取物和1.5%殼聚糖）的提取物濃度高，但殼聚糖濃度較低依舊具有良好的抑菌作用，這種表現(xiàn)與Wang等［20］研究相符，較高的殼聚糖濃度會抑制果實正常呼吸作用，可能是組合1與組合5導致果實腐爛率略高的原因。殼聚糖水溶液會在果實表面形成一層半透性膜，構成一個低氧、高二氧化碳的微環(huán)境，若其濃度過高，可能會造成果實無氧呼吸與酒精發(fā)酵，導致果實腐爛率升高。

2.4 復配劑對果實病斑直徑的影響

如圖5-A所示，接種P.expansum后2 d內(nèi)病斑直徑未出現(xiàn)明顯變化，于3 d各組別開始出現(xiàn)明顯差異且隨時間差異愈顯（P< 0.05）；殼聚糖處理組和CK組間雖存在差異，但二者保持著近似的病斑直徑增速，分別為3.38 mm/d和? 4.17 mm/d，而復配劑處理組的病斑直徑增速? 1.49 mm/d可以說十分平緩。如圖5-B所示，接種B.cinerea后各組別間病斑直徑與圖5-A相差無幾，只是B.cinerea生長速率較慢，復配劑處理組、殼聚糖處理組和CK組同樣表現(xiàn)明顯差異? （P<0.05），病斑直徑增速分別為1.12 mm/d、? 1.61 mm/d和1.91 mm/d。圖6為蘋果青霉病和灰霉病發(fā)病外觀照片。綜上，復配劑處理具有顯著抑制青霉病與灰霉病病斑生長，從而減緩蘋果采后病害的發(fā)生。

2.5 復配劑對果實CHI和GLU活力的影響

CHI和GLU即是植物體內(nèi)兩類重要的病程相關蛋白（PR蛋白）。CHI與GLU協(xié)同作用可降解多種真菌細胞壁的主要成分，抑制真菌生長。依圖7可知，無論是接種P.expansum 還是B.cinerea，CHI活性均呈現(xiàn)出先升后降的總體趨勢。接種P.expansum 后（圖7-A），3個組合處理后CHI活性先迅速升高，于1 d時便顯示差異（P<0.05）；并均于2 d達到活性峰值呈極顯著差異（P<0.01），相較CK組，此刻復配劑處理組CHI活性最高55.79 U/（min·g），殼聚糖處理組CHI活性較高46.36 U/（min·g）。接種B.cinerea后（圖7-B），3個處理組在2 d開始表現(xiàn)出差異持續(xù)至4 d；并于3 d達到活性峰值，相較CK組，此刻復配劑處理組CHI活性高28.15%（P<0.01），殼聚糖處理組CHI活性高13.07%（P<0.05）。在7 d內(nèi)，復配劑處理組CHI活性整體顯著高于CK組，略高于殼聚糖處理組。

依圖8可知，接種兩種病原菌后，3個組別處理后GLU活性均呈現(xiàn)先升后降趨勢，并且在7 d內(nèi)，復配劑處理組GLU活性整體顯著高于CK組（P<0.05），高于殼聚糖處理組。接種P.expansum 后（圖8-A），3個組別均于3 d達到GLU活性峰值，相較CK組，復配劑處理GLU活性超? 7.47%（P<0.05），可高達0.296 U/（min·g），殼聚糖處理GLU活性可達0.286 U/（min·g）。接種B.cinerea后（圖8-B），3個組別處理后均于3 d達到活性峰值，相較CK組，復配劑處理GLU活性優(yōu)于9.97%（P<0.01），殼聚糖處理GLU活性超過5.10%（P<0.05）。綜上所述，復配劑處理可顯著提升果實CHI和GLU活性，增強抗性，抑制病原菌活性。

2.6 復配劑對果實PAL和C4H活力的影響

作為苯丙烷代謝途徑中的關鍵酶，PAL與C4H活性與植物抵御逆境脅迫、抵抗病原菌侵染能力密切相關，是佐證植物抗性強弱的重要指標之一。如圖9所示，在7 d內(nèi)無論是接種P.expansum 還是B.cinerea均會使得PAL活性呈現(xiàn)先升后降趨勢，區(qū)別在于PAL活性增速快慢以及其峰值高低。接種P.expansum （圖9-A），3個組別處理后均在4 d到達活性峰值，復配劑處理組活性分別顯著優(yōu)于CK組7.20%和殼聚糖處理組3.68% （P<0.05），故復配劑處理組PAL活性增速最快，在試驗后期3組處理也保持著相似速度減弱PAL活性。接種B.cinerea（圖9-B），復配劑處理組迅速升高后平緩下降，殼聚糖處理組快速增加快速降低，CK組則維持平緩上升趨勢并于7 d和復配劑處理組產(chǎn)生交匯。3個組別處理均在4 d到達PAL活性峰值，復配劑處理組活性極顯著高于CK組9.64%，顯著高于殼聚糖處理組3.72%；在5? d復配劑處理組活性仍保持顯著區(qū)別于后另兩組。

如圖10所示，受到病原菌侵染后，果實的C4H活性均表現(xiàn)出先降低再上升后下降趨勢。接種P.expansum （圖10-A），在7 d內(nèi)復配劑處理組和殼聚糖處理組C4H活性皆極顯著高于CK組（P<0.01），但兩者間未表現(xiàn)出明顯差異。接種B.cinerea后（圖10-B），復配劑處理組C4H活性始終顯著高于CK組（P<0.05），接種后大部分時間C4H活性高于殼聚糖組；相較于CK組在1 d和6 d表現(xiàn)出的活性峰值，復配劑處理組優(yōu)于5.60%和7.55%，殼聚糖處理組超過2.93%與4.62%；復配劑處理組最低值，相較于同時段CK組與殼聚糖處理組分別優(yōu)于5.15%與? 3.45%。綜上，復配劑處理推動PAL和C4H活性，對果實采后病害的抗性發(fā)揮促進作用。

2.7 復配劑對果實類總酚、黃酮、木質素含量的影響

植物體內(nèi)總酚和類黃酮為直接抵御外敵病原菌的守衛(wèi)，木質素則是鞏固城防細胞壁的重要抗性系統(tǒng)成員。如圖11所示，在7 d內(nèi)3個組別處理后總酚含量呈現(xiàn)出先快速升高后平緩降低趨勢。接種病原菌初期，各處理組總酚含量并沒有表現(xiàn)出明顯差異，而是伴隨病原菌進一步侵染加重，于接種4 d達各處理組總酚含量峰值。在4 d時，接種P.expansum （圖11-A），復配劑處理組總酚含量極顯著超出CK組6.71%（P

如圖12所示，接種P.expansum或B.cinerea病原菌后，復配劑處理組表征為迅速升高，于2 d時達類黃酮含量峰值，2 d后其含量緩慢減少；殼聚糖處理組表征為類黃酮含量緩慢提高4 d時達峰值，其后呈現(xiàn)平緩減少；CK處理組表征為類黃酮含量7 d內(nèi)始終呈緩慢增速，未表現(xiàn)出明顯峰值。在2 d，復配劑處理組較CK處理組極顯著高于32.00%，較殼聚糖處理組顯著高于? 24.39%。復配劑處理組峰值相較于殼聚糖處理組峰值略高于2.61%，但后者相較于前者延遲? 48 h出現(xiàn)。復配劑處理組相較于CK組總酚與類黃酮含量有顯著提高，相較于殼聚糖處理組總酚和類黃酮含量峰值呈現(xiàn)增高態(tài)勢，即證實復配劑處理可推動總酚與類黃酮含量提高，進而提高果實抵御病原菌侵染進攻。

如圖13所示，在7 d內(nèi)復配劑處理組的木質素含量均優(yōu)于殼聚糖處理組與CK組。接種? P.expansum 或B.cinerea后，復配劑處理組和殼聚糖處理組呈現(xiàn)緩慢升高后平穩(wěn)減少趨勢；CK處理組則表現(xiàn)為始終平穩(wěn)緩慢增加的態(tài)勢。接種P.expansum （圖13-A），復配劑處理組木質素含量于4 d實現(xiàn)峰值，極顯著優(yōu)于CK組? 103.80%，高于殼聚糖處理組16.67%；接種B.cinerea（圖13-B），復配劑處理組木質素含量于4 d實現(xiàn)峰值，極顯著優(yōu)于CK組58.10%，高于殼聚糖處理組14.56%。可見，經(jīng)過復配劑處理，果實更加容易產(chǎn)生并累積木質素，提高自身木質素含量，鞏固細胞壁穩(wěn)定，增加對病原菌侵染的抵抗能力。

3 討論與結論

老、舊茶樹葉的再利用是獲取茶多酚經(jīng)濟便捷的有效途徑，茶樹葉提取物復配殼聚糖兼具良好的抑菌保鮮作用與成膜效果。趙艷琳等［21］研究表明，茶葉提取物的抑菌效果明顯，并且在放置一月內(nèi)的抑菌效果穩(wěn)定；路志芳等［22］研究表明，1.0%殼聚糖涂膜對黃瓜失重率、維生素C含量、葉綠素含量、可溶性糖含量的降低減緩；陶永元等［23］研究表明，茶多酚復合殼聚糖可實現(xiàn)櫻桃果實抑制呼吸強度，減緩Vc、可滴定酸、可溶性糖等物質的消耗速率。本試驗研究表明，20%料液比的茶樹葉含茶多酚0.025 mg/mL，復配1.5%殼聚糖處理抑制病斑直徑擴展，減輕蘋果采后病害發(fā)生，且在接種3 d后開始出現(xiàn)顯著差異。這可能是由于接種前期復配劑需一定時間逐步侵蝕病原菌，3 d后方有明顯效用，因此在接種后3 d，復配劑處理組病斑直徑顯著低于與另外兩處理組（P<0.05）；而且，于5 d復配劑已充分抑制病原菌活性，表現(xiàn)為病斑直徑擴增趨于平穩(wěn)與極顯著差異（P<0.01）。

作為植物體內(nèi)兩類重要的PR蛋白，CHI和GLU主要負責降解病原菌細胞壁的工作［24］。Schlumbaum等［25］研究發(fā)現(xiàn)，由植物提純所得CHI可在體外抑制Trichoderm viride菌絲的生長。當植物受到病原菌侵染，表皮細胞受到威脅時，細胞中的CHI和GLU接收響應，活性升高［26］。在研究中，茶樹葉復配殼聚糖處理組的CHI和GLU迅速響應，且在7 d內(nèi)其活性均高于另兩組處理，有效提高果實對采后病原菌的抵抗力。此與袁仲玉等［27］、周曉婉等［28］采取蘆薈粗提物、1-甲基環(huán)丙烯增強蘋果抗性結果一致。

對于合成植物次生物質的苯丙烷代謝途徑，PAL是其中第一位催化酚類物質生成的酶，C4H是其中重要分支酶之一［29］。二者催化酚類的前體物質合成，其活性更是與植物抵御逆境脅迫、抵抗病原菌侵染能力密切相關，是佐證植物抗性強弱的重要指標之一。在研究中，茶樹葉復配殼聚糖處理組PAL和C4H的活性始終優(yōu)于另兩組，在相同時間內(nèi)擁有更高的活性水平，加快抵抗病原菌物的次生代謝物質生成，從而提高蘋果的抗病性。

身為植物苯丙烷代謝途徑產(chǎn)物，總酚和類黃酮是直接抵御外敵病原菌的守衛(wèi)，木質素則是鞏固城防細胞壁的重要抗性系統(tǒng)成員［30］。Deng等［31］和Li等［32］研究發(fā)現(xiàn)，苯丙烷代謝途徑關鍵酶能夠提高次生代謝物質含量，以此實現(xiàn)植物抗性提高。在研究中，茶樹葉復配殼聚糖處理組總酚、類黃酮和木質素含量優(yōu)于另兩組。此與Terry等［33］研究結果相同。在PAL和C4H保持較高活性增速和水平時，總酚和類黃酮也同樣維持在同處理組的較高含量上。

綜上所述，20%料液比的茶樹葉含茶多酚? 0.025? mg/mL，復配1.5%殼聚糖處理能夠明顯提高病程相關蛋白CHI和GLU活性，同時可增強苯丙烷代謝途徑關鍵酶PAL和C4H活力，推動次生代謝物質總酚、類黃酮和木質素生成累積，以此實現(xiàn)提高蘋果在采后貯藏過程中對病原菌的抵抗力，抑制采后貯藏常見病害的發(fā)生，有效改善蘋果貯藏品質。老、舊茶樹葉復配殼聚糖為蘋果采后病害防治提供新思路，也為茶樹葉再利用探尋出新途徑。

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Effect of Combining Tea Tree Leaf Extract with Chitosan on Postharvest Disease Resistance in Apples

YAO Yue，YU? Tingting，ZHANG Rui，BAO Huiying and? ZHOU Huiling

（College of Horticulture，Northwest A&F University，Yangling? Shaanxi 712100，China）

Abstract To explore the effects of? combining tea tree leaf extract with chitosan on the major postharvest diseases in apples，the combination with the best antibacterial effect was firstly selected through in vitro experiments，then the ‘Fuji apple was chosen as the experimental material.The fruits were soaked in the combination for 10s and induced for 24? h before inoculation with P.expansum and B.cinerea. Following the inoculation，the relevant disease resistance indicators were determined through regular sampling.Disease resistance indicators were assessed 24 hours after inoculation with P.expansum and B.cinerea? using regular samples..The results showed that 20% tea tree leaf extract and?? 1.5%? chitosan were the most effective antibacterial combination.Compared to the control and chitosan-treated groups，the tea tree leaves compounded with chitosan significantly inhibited the expansion of apple P.expansum and B.cinerea spots（P<0.05）.This formulation increased the activity of chitinase and β-1，3-glucanase，induced the response of key enzymes in the metabolic pathway of phenylpropane，significantly enhanced the activity of phenylalanine deaminase and cinnamate-4-hydroxylase，and promoted the accumulation of total phenols，flavonoids and lignin production of resistant secondary metabolites in apple fruit（P<0.05）.In conclusion，combination of tea tree leaves with chitosan promotes the accumulation of resistant secondary metabolites，suppress spot diameter and retards disease development by inducing key enzyme responses in the apple disease process-related protein and phenylpropane metabolic pathways.

Key words Apples; Teatree leaves; Chitosan; Penicilliosis; Gray mold

Received ?2022-10-29??? Returned 2022-12-01

Foundation item The? Natural Science Foundation of Shaanxi Privince （No.2021JZ-15）; the Key Project for Apple （No.2020zdzx03-05-01）.

First author YAO Yue，female，master student.Research area：postharvest physiology and storage preservation for horticultural products.E-mail：731265158@qq.com

Corresponding?? author ZHOU Huiling，female，associate professor，master supervisor.Research area：postharvest physiology and storage preservation horticultural product.E-mail：zhouhuiling@nwsuaf.edu.cn

（責任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）