王艷 王莎莎 朱春陽(yáng) 董晨 王瑞 邱文生

［摘要］ ?目的 ?探討不同濃度蟾蜍他靈（BT）對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

方法采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度（0、10、20、40、80、160、320 nmol/L）的BT處理24和48 h后的細(xì)胞活力，并計(jì)算半抑制濃度（IC50）；平板克隆實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證0、12.5、25.0 nmol/L BT（設(shè)為A、B、C組）處理14 d后對(duì)HCT116細(xì)胞集落形成能力的影響；使用劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證0、25、50 nmol/L BT（設(shè)為A、C、D組）處理24 h后對(duì)HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響；應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A、C、D組處理24 h后HCT116細(xì)胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)水平。

結(jié)果CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BT處理HCT116細(xì)胞24或48 h后，隨著B(niǎo)T的濃度增加，其抑制HCT116細(xì)胞增殖的作用顯著增強(qiáng)（F=2 106.00、3 725.00，P<0.05），處理24和48 h的IC50分別為49.59、24.10 nmol/L；平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B、C組細(xì)胞的集落數(shù)量顯著少于A組（F=159.30，t=12.40、17.32，P<0.05）；劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C、D組細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著低于A組（F=120.30、296.80，t=12.71～21.27，P<0.05）；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BT顯著上調(diào)HCT116細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白表達(dá)（F=2 736.00，P<0.05），其中C、D組顯著高于A組（t=50.27、72.13，P<0.05）；而B(niǎo)T顯著下調(diào)N-cadherin蛋白表達(dá)（F=626.80，P<0.05），其中C、D組顯著低于A組（t=26.54、33.57，P<0.05）。

結(jié)論BT可明顯抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，有望成為結(jié)直腸癌治療的潛在候選藥物。

［關(guān)鍵詞］ ?結(jié)直腸腫瘤；HCT116細(xì)胞；蟾酥甾類；細(xì)胞增殖；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；腫瘤浸潤(rùn)；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

［中圖分類號(hào)］ ?R735.34

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ ?A

Effect of bufotalin on the proliferation， migration， invasion， and epithelial-mesenchymal transition of human colorectal cancer HCT116 cells

WANG Yan， WANG Shasha， ZHU Chunyang， DONG Chen， WANG Rui， QIU Wensheng

（Faculty of Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

;［ABSTRACT］?Objective?To investigate the effect of different concentrations of bufotalin （BT） on the proliferation， migration， invasion， and epithelial-mesenchymal transition of human colorectal cancer HCT116 cells.

Methods?CCK-8 assay was used to measure cell viability after 24 and 48 h of BT treatment at different concentrations （0， 10， 20， 40， 80， 160， and 320 nmol/L）， and the half-maximal inhibitory concentration （IC50） was calculated. The plate colony formation assay was used to verify the effect of BT treatment at the concentrations of 0， 12.5， and 25.0 nmol/L for 14 days on the colony formation ability of HCT116 cells （established as groups A， B， and C）. The wound healing assay and the Transwell assay were used to verify the effect of BT treatment at the concentrations of 0， 25， and 50 nmol/L for 24 h on the migration and invasion abilities of HCT116 cells （established as groups A， C， and D）. Western blot was used to measure the protein expression levels of E-cadherin and N-cadherin in HCT116 cells after 24 h of treatment in groups A， C and D.

Results?CCK-8 assay showed that after HCT116 cells were treated by BT for 24 or 48 h， the inhibitory effect of BT on the proliferation of HCT116 cells increased significantly with the increase in the concentration of BT （F=2 106.00，3 725.00，P<0.05）， with an IC50 value of 49.59 nmol/L for 24-hour treatment and 24.10 nmol/L for 48-hour treatment. The plate colony formation assay showed that groups B and C had a significantly lower number of colonies of cells than group A （F=159.30，t=12.40，17.32，P<0.05）. The wound healing assay and the Transwell assay showed that compared with group A， groups C and D had significantly lower cell migration rate and number of invading cells （F=120.30，296.80，t=12.71-21.27，P<0.05）. Western blot showed that BT significantly upregulated the protein expression level of E-cadherin in HCT116 cells （F=2 736.00，P<0.05）， and groups C and D had a significantly higher expression level than group A （t=50.27，72.13，P<0.05）; BT significantly downregulated the protein expression level of N-cadherin （F=626.80，P<0.05）， and groups C and D had a significantly lower expression level than group A （t=26.54，33.57，P<0.05）.

Conclusion?BT can significantly inhibit the proliferation， migration， invasion， and epithelial-mesenchymal transition of human colorectal cancer HCT116 cells and is expected to become a potential candidate for the treatment of colorectal cancer.

［KEY WORDS］?Colorectal neoplasm; HCT116 cells; Bufanolides; Cell proliferation; Cell movement; Neoplasm invasiveness; Epithelial-mesenchymal transition

結(jié)直腸癌在全球發(fā)病率居第三位，死亡率僅次于肺癌［1］。近年來(lái)，盡管手術(shù)和藥物治療有了重大進(jìn)展，但晚期結(jié)直腸癌患者預(yù)后仍然很差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，Ⅰ期結(jié)直腸癌患者的5年生存率為90%，而Ⅳ期患者的5年生存率下降至10%左右［2］。因此，迫切需要尋找新的治療藥物，使結(jié)直腸癌患者獲益。

蟾蜍他靈（BT）是一種從中藥蟾酥中分離出來(lái)的蟾蜍二烯內(nèi)酯［3］。其已被證明具有強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性［4-6］。近年來(lái)，BT因其顯著的抗腫瘤活性而受到廣泛的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，BT可誘導(dǎo)人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期停滯和凋亡，從而抑制其增殖［7］；BT還可以通過(guò)抑制STAT3/上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）軸來(lái)抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和HCC1937細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［8］。另外，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549異種移植模型中，5、10 mg/kg的BT可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)［9］。然而，BT是否具有抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用尚不明確。本研究通過(guò)使用不同濃度BT處理人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞后，檢測(cè)BT對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲能力的影響，并探究BT對(duì)HCT116細(xì)胞EMT的影響，旨在為結(jié)直腸癌新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人正常腸上皮細(xì)胞系NCM460、人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116由武漢普諾賽生命科技有限公司提供， CCK-8試劑盒及BT購(gòu)自上海陶術(shù)生物科技有限公司， BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白酶抑制劑購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，E-cadherin和N-cadherin單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology（CST），GAPDH多克隆抗體和羊抗兔二抗購(gòu)于上海愛(ài)必信生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將NCM460和HCT116細(xì)胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、潮濕、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳2～3代且待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCM460和HCT116細(xì)胞以10 000個(gè)/孔接種至96孔板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h以后，分別使用濃度為0、10、20、40、80、160、320 nmol/L的BT處理細(xì)胞，第24、48小時(shí)時(shí)分別向各孔細(xì)胞中加入10 μL的CCK-8檢測(cè)試劑孵育1 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處各孔的吸光度（A）值。

使用Graphpad Prism 8.0軟件計(jì)算半抑制濃度（IC50）。以BT處理HCT116細(xì)胞第24、48 小時(shí)的IC50為依據(jù)，選擇合適的濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成能力

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞以800個(gè)/孔接種至6孔板，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔中分別加入2 mL濃度為0、12.5、25 nmol/L的BT培養(yǎng)液處理細(xì)胞（設(shè)為A、B、C組），繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，每3 d換液一次。當(dāng)肉眼觀察到有細(xì)胞集落形成時(shí)，取出6孔板，去除原培養(yǎng)液，每孔加入4%多聚甲醛固定30 min，以0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，拍照并使用Image J軟件計(jì)算各組集落數(shù)量。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

準(zhǔn)備6孔板，用馬克筆在其背后畫(huà)橫線，橫線相隔0.5 cm。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞接種在6孔板上，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到約90%時(shí)，用100 μL無(wú)菌移液器吸頭垂直于6孔板背后橫線在孔板內(nèi)進(jìn)行劃痕，用PBS沖洗3次，然后在每孔中分別加入2 mL濃度為0、25、50 nmol/L的BT培養(yǎng)液處理細(xì)胞（設(shè)為A、C、D組），用顯微鏡在第0、24小時(shí)時(shí)拍攝劃痕愈合情況，并計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

準(zhǔn)備含有Matrigel膠的Transwell小室。在24孔板中加入含10%血清的培養(yǎng)基，然后用鑷子將小室置于24孔板內(nèi)，取在6孔板中處理24 h的A、C、D組HCT116細(xì)胞分別以50 000個(gè)/孔混合200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基加入小室，最后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待24 h后，去除原培養(yǎng)液，使用4%多聚甲醛固定30 min，以0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min。于倒置顯微鏡下觀察，并隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，使用Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)水平

取接種于培養(yǎng)皿處理24 h的A組、C組、D組HCT116細(xì)胞，將含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液加入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行充分裂解后，提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度配置等量等體積的蛋白樣本，隨后100 ℃煮沸5 min，放入－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0% SDS-PAGE凝膠分離蛋白樣本，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，然后加入一抗于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。第2天用二抗常溫孵育1 h，使用顯影儀顯影獲取蛋白條帶。以GAPDH作為內(nèi)部參照，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Image J軟件處理圖像。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料以 ±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett方法，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1BT對(duì)HCT116細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度（0、10、20、40、80、160、320 nmol/L）的BT處理24或48 h，隨著濃度的升高，BT對(duì)NCM460細(xì)胞活力的抑制能力逐漸增強(qiáng)（F=478.70、659.90，P<0.05）。經(jīng)不同濃度（0、10、20、40、80、160、320 nmol/L）的BT處理24或48 h，隨著濃度的升高，BT對(duì)HCT116細(xì)胞活力的抑制能力逐漸增強(qiáng)（F=2 106.00、3 725.00，P<0.05）。詳見(jiàn)圖1。BT處理NCM460細(xì)胞24和48 h后的IC50分別為261.40、141.10 nmol/L，BT處理HCT116細(xì)胞24和48 h的IC50分別為49.59、24.10 nmol/L。根據(jù)BT處理HCT116細(xì)胞24和48 h的IC50值，后續(xù)選擇濃度0、12.5、25 nmol/L的BT用于平板克隆實(shí)驗(yàn)，濃度0、25、50 nmol/L的BT用于其他實(shí)驗(yàn)。

2.2BT對(duì)HCT116細(xì)胞集落形成能力的影響

平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A～C組HCT116細(xì)胞的集落數(shù)量分別為（453.00±17.00）、（301.00±8.89）、（240.70±17.56）個(gè)，各組間比較差異有顯著性（F=159.30，P<0.05），其中B、C組顯著少于A組（t=12.40、17.32，P<0.05），C組顯著少于B組（t=4.92，P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3BT對(duì)HCT116細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A、C、D組HCT116細(xì)胞的遷移率分別為（28.84±3.00）%、（4.22±2.38）%、（1.63±1.49）%，各組間比較差異有顯著意義（F=120.30，P<0.05），其中C、D組顯著低于A組（t=12.71、14.05，P<0.05），D組與C組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4BT對(duì)HCT116細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A、C、D組HCT116細(xì)胞的侵襲數(shù)量分別為（781.00±77.00）、（21.33±1.53）、（8.67±0.58）個(gè)，各組間比較差異具有顯著性（F=296.80，P<0.05），其中C、D組顯著少于A組（t=20.92、21.27，P<0.05），D組與C組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖4。

2.5BT對(duì)HCT116細(xì)胞EMT的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A組、C組、D組HCT116細(xì)胞中E-cadherin的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、2.02±0.03、2.47±0.04，N-cadhe-

rin的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.48±0.02、0.34±0.04。隨著B(niǎo)T的濃度增加，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（F=2 736.00，P<0.05），其中C、D組顯著高于A組（t=50.27、72.13，P<0.05），D組顯著高于C組（t=21.86，P<0.05）；而N-cadherin蛋白表達(dá)則顯著下調(diào)（F=626.80，P<0.05），其中C、D組顯著性低于A組（t=26.54、33.57，P<0.05），D組顯著低于C組（t=7.03，P<0.05）。見(jiàn)圖5。

3 討 ?論

結(jié)直腸癌是一種始于結(jié)腸和直腸的癌癥。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)估計(jì)，到2040年，全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)將明顯增加，死亡率將明顯增高［10］。目前結(jié)直腸癌的臨床治療主要包括手術(shù)和化療，然而耐藥性的發(fā)生和化療相關(guān)的毒副作用是結(jié)直腸癌患者化療失敗或停藥的主要原因［11-12］。中藥因其在緩解癥狀、降低放化療引起的不良反應(yīng)、延長(zhǎng)生存期等方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，成為腫瘤治療的一個(gè)研究熱點(diǎn)［13］。BT是一種從中藥蟾酥中提取的類固醇內(nèi)酯類化合物［14］。蟾酥是中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍有毒分泌物中的干燥產(chǎn)物，其在中國(guó)用于疾病的治療已有數(shù)百年的歷史［15］。其中蟾蜍二烯內(nèi)酯被認(rèn)為是蟾酥最主要的活性成分之一，其對(duì)多種腫瘤具有顯著的抑制作用［16］。

既往研究表明，BT對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca-109、EC9706、TE5、Hec2、TE11均有明顯的抑制作用［17］。成骨細(xì)胞瘤細(xì)胞U2OS異種移植模型小鼠經(jīng)0.5～1 mg/kg的BT處理后，小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)受到了顯著抑制［18］。然而，BT在結(jié)直腸癌中的抗腫瘤作用知之甚少。無(wú)限復(fù)制是癌細(xì)胞生長(zhǎng)所獲得的一種表型，癌細(xì)胞通過(guò)修復(fù)端粒來(lái)獲得無(wú)限倍增的能力［19］。因此，本研究首先探究了不同濃度（0、10、20、40、80、160、320 nmol/L）BT對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116增殖活力的影響，結(jié)果顯示，隨著濃度的升高，BT對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的抑制能力逐漸增強(qiáng)，并呈劑量依賴性，24和48 h的IC50分別為49.59、24.10 nmol/L。此外，本研究還設(shè)置了人正常腸上皮細(xì)胞NCM460作為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BT對(duì)于NCM460細(xì)胞有一定的抑制作用，24和48 h的IC50分別為261.40、141.10 nmol/L。與HCT116細(xì)胞比較，BT處理NCM460細(xì)胞24和48 h的IC50更高，這表明NCM460細(xì)胞比HCT116細(xì)胞更能耐受BT的毒副作用。另有研究表明BT可抑制成骨細(xì)胞瘤細(xì)胞MG63和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的集落形成能力［9，18］。因此，本研究也進(jìn)一步觀察了BT對(duì)HCT116細(xì)胞集落形成能力的影響，本研究以BT處理HCT116細(xì)胞24 h后的IC50為依據(jù)，設(shè)置0、12.5、25.0 nmol/L的濃度梯度處理HCT116細(xì)胞，結(jié)果顯示隨著B(niǎo)T濃度增加，HCT116細(xì)胞存活的集落數(shù)量顯著減少。以上這些結(jié)果表明，BT對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，BT可以抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、HCC1937細(xì)胞的遷移和侵襲能力［8］。轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因。在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞離開(kāi)原發(fā)部位并擴(kuò)散到全身，形成繼發(fā)腫瘤并最終致器官衰竭［20］。轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第一步是侵襲，腫瘤細(xì)胞穿透其周圍的基底膜并通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)遷移到周圍組織［21］。因此，本研究探究了BT是否會(huì)影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，以BT處理HCT116細(xì)胞24和48 h后的IC50為依據(jù)，設(shè)置0、25、50 nmol/L的濃度梯度處理HCT116細(xì)胞。劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，隨著B(niǎo)T濃度增加，HCT116的細(xì)胞遷移率和細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著減少，表明其能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

EMT被認(rèn)為是癌細(xì)胞一種關(guān)鍵的表型改變，其將上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，因此對(duì)腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要［22］。一些分子標(biāo)志物的表達(dá)水平可以揭示EMT的程度，如癌組織或癌細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)降低和N-cadherin表達(dá)增加可顯著性誘導(dǎo)EMT過(guò)程［23-24］。有研究證實(shí)，BT可以通過(guò)增加三陰性乳腺癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)和降低N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)，來(lái)抑制EMT過(guò)程［8］。在本研究中，BT處理可以顯著上調(diào)HCT116細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)N-cadherin蛋白表達(dá)，這表明BT可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，BT是一種有前途的天然抗癌藥物，能明顯抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移、侵襲和EMT過(guò)程，可為結(jié)直腸癌抗腫瘤治療藥物的開(kāi)發(fā)提供新的思路。但是本研究仍然存在諸多不足之處，僅局限于細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)研究，后續(xù)應(yīng)考慮構(gòu)建結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型，進(jìn)一步深入研究BT在動(dòng)物體內(nèi)的抗癌作用及其分子機(jī)制。

作者聲明： 王艷、邱文生、王莎莎負(fù)責(zé)研究構(gòu)思和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；王艷負(fù)責(zé)細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作；朱春陽(yáng)、董晨、王瑞負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。所有作者均參與該論文寫(xiě)作和修改并同意發(fā)表，且均聲明無(wú)利益沖突。

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（本文編輯 耿波 厲建強(qiáng)）