白瑩 王一卉 葛歡歡 卞雯晗 陳鵬

［摘要］ ?目的 ?探討小鼠角膜上皮細胞永生化細胞系的建立方法，并鑒定其表型的穩(wěn)定性。

方法提取小鼠角膜上皮原代細胞，以猴空泡病毒40大T抗原（SV40-LT）慢病毒感染小鼠角膜上皮原代細胞建立永生化細胞系。通過HE染色與免疫熒光染色對角膜上皮組織表型和標記物（K12、Pax6、Ki-67）進行鑒定。提取原代角膜上皮細胞并對其角膜上皮細胞分層蛋白K14進行鑒定，觀察細胞明場視野評估細胞形態(tài)學特征。對轉染后的P1和P8代細胞的部分標志物（K12、Pax6、Ki-67、ABCG2、K14）進行鑒定。采用結晶紫染色法觀察轉染后的P1和P8代細胞克隆的形成能力。

結果小鼠角膜上皮組織中K12、Pax6、Ki-67染色陽性；P1、P8代小鼠角膜上皮細胞中K12、Pax6、Ki-67、K14和ABCG2染色陽性，上述標志物陽性率比較，差異均無顯著性（P＞0.05），P1與P8代小鼠角膜上皮細胞克隆能力無明顯差異（P＞0.05）。

結論使用SV40-LT慢病毒轉染小鼠角膜上皮，成功建立永生化小鼠角膜上皮細胞系，表型穩(wěn)定且穩(wěn)定增殖。

［關鍵詞］ ?細胞系；上皮細胞；角膜；轉染；遺傳標記；小鼠，近交C57BL

［中圖分類號］ ?R329.24;R394

［文獻標志碼］ ?A

Establishment and phenotypic identification of an immortalized mouse corneal epithelial cell line

BAI Ying， WANG Yihui， GE Huanhuan， BIAN Wenhan， CHEN Peng

（Department of Human Anatomy， Histology and Embryology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

;［ABSTRACT］?Objective?To investigate the method for establishing an immortalized mouse corneal epithelial cell line， and to identify the stability of its phenotype.

Methods?Primary mouse corneal epithelial cells were extracted and transfected with Simian Vacuolating Virus 40 Large T Antigen （SV40-LT） lentivirus to establish an immortalized cell line. HE staining and immunofluorescent staining were used to identify the phenotypes and markers （K12， Pax6， Ki-67） of corneal epithelium. Primary cor-

neal epithelial cells were extracted to identify K14 protein in corneal epithelial cell layer， and bright field observation was performed to evaluate cell morphological characteristics. Several markers （K12， Pax6， Ki-67， ABCG2， K14） were identified for P1 and P8 cells after transfection. Crystal violet staining was used to observe the colony-formation ability of P1 and P8 cells after transfection.

Results?Mouse corneal epithelium was stained positive for K12， Pax6 and Ki-67， while the P1 and P8 generations of mouse cor-

neal epithelial cells were stained positive for K12， Pax6， Ki-67， K14， and ABCG2; there were no significant differences in the positive rates of the above markers （P>0.05）. There was no significant difference in colony-formation ability between P1 and P8 cells （P>0.05）.

Conclusion?The immortalized mouse corneal epithelial cell line is successfully established by transfection with SV40-LT lentivirus， which has stable phenotype and proliferation.

［KEY WORDS］?Cell line; Epithelial cells; Cornea; Transfection; Genetic markers; Mice， inbred C57BL

角膜上皮位于角膜前表面，由非角化上皮細胞有序排列而成，在視覺系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。角膜上皮細胞（CECs）不斷從角膜緣干細胞或祖細胞（LSCs）中更新而來，LSCs或CECs缺乏會引起角膜表面缺損、角膜炎等，最終可能導致失明［1-2］。

原代角膜上皮細胞通常在培養(yǎng)3～4代后即停止生長，導致每次實驗中產(chǎn)生的細胞數(shù)量很少，這也是影響角膜上皮疾病相關實驗研究深入開展的瓶頸問題。因此，建立可以無限增殖，并且表型穩(wěn)定的角膜上皮細胞系十分必要［3］。目前，相關研究報道了原代小鼠角膜上皮細胞的提取方法與應用情況，但在細胞傳代增殖過程中出現(xiàn)的細胞衰老和形態(tài)改變等問題仍然難以解決［4］。海弗利克極限理論提出體細胞的增殖能力是有限的，不能進行無限的增殖復制，但在一些特殊條件干預下，細胞也可以實現(xiàn)無限增殖，且無惡化的表征，即處于正常細胞與癌細胞之間的一種永生化細胞狀態(tài)［5］。研究顯示，猴空泡病毒40大T抗原（SV40-LT）片段能與細胞內(nèi)的p53及其他相關蛋白結合，所形成的復合體可導致p53蛋白失活，進一步使抑癌基因失效無法表達，從而防止細胞出現(xiàn)分裂停滯，達到調(diào)整宿主細胞周期使細胞處于永生化狀態(tài)的目的［6-8］。研究顯示，將SV40-LT慢病毒轉染原代赫特維希上皮根鞘細胞后，能成功建立棕色脂肪永生化細胞系和上皮根鞘永生化細胞系［9］。本研究通過將SV40-LT慢病毒轉染小鼠角膜上皮細胞以構建其永生化細胞系，旨在為角膜上皮疾病的實驗研究提供足夠細胞來源，減少實驗動物成本。

1 材料與方法

1.1 動物和材料

8～10周齡雄性C57BL/6小鼠10只，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。免疫熒光K12、Ki-67、K14兔單克隆抗體購自美國Abcam公司；兔單克隆抗體ABCG2購買于武漢愛博泰克生物科技有限公司；鼠單克隆抗體Pax6購買于美國Biolegend公司。SV40-LT（pGMLV-SV40T-PURO Lentivirus，啟動子為EF1SymbolaA@，載體類型為慢病毒，組成型表達方式，嘌呤毒素真核抗性，熒光標記）購自上海吉滿生物科技有限公司。

1.2 角膜組織切片HE染色

10只小鼠適應性喂養(yǎng)3 d，異氟烷氣體麻醉后脫頸處死，取出左側眼球，其中5顆眼球以石蠟包埋后切片。將切片脫蠟后依次用蘇木精、伊紅染色，中性樹膠封片后，顯微鏡明場視野觀察角膜組織形態(tài)。剩余5顆眼球置于冰凍組織包埋劑中，－80 ℃冷凍后切片。

1.3 角膜上皮原代細胞的提取及培養(yǎng)

剝離出10只小鼠的右側眼球，置于4 ℃含有1 500 U/L dispase Ⅱ的KSFM培養(yǎng)基中，第2天剝離出角膜，置于48孔板中，加入含1% ITS、1%青霉素/鏈霉素和2% B-27補充劑的KSFM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基），置于含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，為原代小鼠的角膜上皮細胞。在培養(yǎng)48 h時使用倒置顯微鏡明場視野觀察原代角膜上皮細胞的形態(tài)。

1.4 永生化細胞系的建立及細胞傳代

1.4.1嘌呤毒素的最低致死濃度測定 將嘌呤霉素加入完全培養(yǎng)基中，以1 mg/L為一個濃度梯度，配制成0～10 mg/L不同濃度的培養(yǎng)基。將原代小鼠角膜上皮細胞以1×104個/孔接種于48孔板中，置于培養(yǎng)箱中，當細胞融合度達50%～60%時，將原培養(yǎng)基替換為含不同濃度嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d，隨時通過顯微鏡觀察，以全部細胞為漂浮狀態(tài)且未見貼壁細胞為細胞全部死亡的判斷標準，實驗共重復3次。測得嘌呤霉素的最低致死濃度為2 mg/L。

1.4.2細胞的轉染 將原代小鼠角膜上皮細胞以1×104個/孔接種于48孔板中，待融合度達60%～70%時，通過細胞計數(shù)板計算細胞數(shù)目，每孔約為2.0×105個細胞，按照公式（病毒量=MOI值×細胞數(shù)目÷病毒滴度）計算培養(yǎng)基中需加入SV40-LT的病毒量，其中病毒滴度為5×108 PFU/mL（由上海吉滿生物科技有限公司提供），以MOI值分別為20、10、5進行摸索實驗。加入按照上面方法計算出的不同SV40-LT病毒量后再培養(yǎng)48 h，更換為完全培養(yǎng)基，通過熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)當MOI值為5時，角膜上皮細胞會出現(xiàn)慢病毒自帶的紅色熒光，表示細胞轉染成功。將轉染成功細胞的培養(yǎng)基更換為篩選培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基中加入2 mg/L的嘌呤霉素），每48 h更換1次。當細胞融合度達85%以上時，將細胞移至培養(yǎng)瓶中使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.3細胞傳代 取培養(yǎng)瓶中的小鼠角膜上皮細胞，吸出原培養(yǎng)基，PBS清洗細胞后加入2.5 g/L胰蛋白酶500 μL消化細胞，后置于含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中觀察5 min，待細胞呈分散漂浮狀態(tài)時，吸出胰蛋白酶，加入完全培養(yǎng)基終止消化。將細胞收集到15 mL離心管當中，以1 000 r/min離心5 min，吸除上清液，按照吸除上清液的2倍體積重新加入完全培養(yǎng)基，混勻后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，得到P1代小鼠角膜上皮細胞。重復上述步驟，得到P8代小鼠角膜上皮細胞。

1.5 小鼠角膜上皮細胞和組織的免疫熒光染色

將原代、P1和P8代小鼠角膜上皮細胞分別接種于24孔板中，待融合度達60%時，吸出原培養(yǎng)基，PBS洗滌2次后，使用4%多聚甲醛固定20～25 min，以PBS洗滌10 min后，正常山羊血清封閉1 h。原代小鼠角膜上皮細胞中加入兔抗K12，P1、P8代小鼠角膜上皮細胞中均分別加入兔抗K12、鼠抗Pax6、兔抗K14、兔抗Ki-67和兔抗ABCG2一抗，4 ℃條件下過夜，第2天使用PBS洗滌3次后，避光條件下每孔加入二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次。以DAPI室溫染色5 min，PBS洗滌后，于倒置熒光顯微鏡下觀察原代細胞中K12及P1、P8代細胞中K12、Pax6、Ki-67、K14和ABCG2的表達情況，并計算陽性率。取1.2中制備的小鼠角膜組織切片，按照上述步驟進行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察角膜組織中K12、Pax6、Ki-67的表達情況。

1.6 克隆形成實驗

將P1和P8代小鼠角膜上皮細胞分別接種于6孔板中，待融合度達80%時，吸除培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS清洗5 min后，加入結晶紫溶液染色25 min后吸出，以PBS清洗細胞3次后，記錄克隆形成數(shù)，計算克隆形成率。

1.7 統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 9軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以 ±s表示，兩組間比較采用非配對t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 ?果

2.1 小鼠角膜上皮組織表型及標志物鑒定

小鼠角膜組織切片HE染色結果顯示，其角膜上皮由3～5層細胞構成，角膜上皮復層正常，角膜基質(zhì)膠原纖維呈矩形規(guī)則排列（圖1A）。角膜組織切片免疫熒光染色顯示，K12在整個角膜上皮中的染色均呈陽性，但在鄰近結膜的角膜緣基底上皮中的染色呈陰性（圖1B）；Pax6和Ki-67在角膜上皮中的染色均呈陽性（圖1C、D）。

2.2 原代小鼠角膜上皮細胞的表型及明場視野

免疫熒光染色顯示，原代小鼠角膜上皮細胞中K12顯著表達，見圖2A～B；圖2B中綠色為K12，藍色為DAPI。明場視野觀察顯示，角膜組織碎片周圍有向外增殖的角膜上皮細胞，呈鵝卵石狀，見圖2C～D。

2.3P1和P8代小鼠角膜上皮細胞表型及標志物鑒定

免疫熒光染色顯示，P1、P8代小鼠角膜上皮細胞中K12、Pax6、Ki-67、K14以及ABCG2染色陽性（圖3）。P1和P8代細胞的上述標志物陽性率比較，差異均無顯著性（P＞0.05），見表1。P1和P8代細胞的明場視野觀察顯示，角膜上皮細胞形態(tài)正常，呈鵝卵石狀，且分布均勻（圖4）。

2.4 克隆形成實驗

P1、P8代細胞的克隆形成率分別為（375.70±10.02）%、（357.30±11.93）%，兩者比較差異無顯著性（P＞0.05）。

3 討 ?論

目前全世界約有1 000萬人由于眼外傷、嚴重的感染、神經(jīng)營養(yǎng)性角膜病變、病原體侵入等原因致角膜盲［1，10-12］。角膜移植手術與自體或異體角膜緣移植是治療角膜盲的最有效手段，但受到全球供體角膜短缺以及免疫排斥反應發(fā)生率過高的限制，導致目前角膜病治療依然是一大難題［13-14］。角膜上皮細胞對于角膜病理學、分子生物學、免疫學相關的實驗研究至關重要，但體外培養(yǎng)的原代小鼠角膜上皮細胞傳代次數(shù)有限，并且容易衰老，因此實驗時需要大量的實驗小鼠，增加了實驗成本［15］。

SV40-LT是具有廣譜轉化效應的細胞永生化基因，可以與多種蛋白結合以延長細胞周期，為臨床細胞學研究提供了基礎。有研究表明SV40-LT轉染肝細胞后，與肝細胞內(nèi)的p53和磷酸化視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（pRB）結合，致p53和pRB功能喪失，腫瘤抑制通路失活，促進肝細胞增殖［6-8］。國內(nèi)外研究者不斷嘗試應用永生化技術體外建立角膜上皮細胞系［16-18］，如通過重組的SV40腺病毒載體或編碼端粒酶的逆轉錄病毒載體轉染人角膜上皮細胞成功構建了永生化人角膜細胞系［19-20］。但是人角膜樣本來源少，目前市場上銷售的永生化細胞系價格昂貴，因此如果能成功培養(yǎng)小鼠角膜上皮永生化細胞系，將會極大促進角膜病相關研究的開展。

研究顯示，K12是角膜上皮細胞的標志物［21］，在整個角膜上皮組織和角膜基底層上緣組織中均有表達，在永生化角膜上皮細胞中也廣泛表達；Pax6是角膜發(fā)育的主要調(diào)控基因，可直接與K12啟動子結合［22-23］，在永生化角膜上皮細胞系中廣泛表達；Ki-67是細胞增殖的標志物［24］。本研究首先對小鼠角膜組織切片進行了HE染色，顯示其角膜上皮由3～5層細胞構成，角膜基質(zhì)膠原纖維呈矩形規(guī)則排列。免疫熒光染色顯示，在整個角膜上皮中均可見染色陽性的K12、Pax6和Ki-67，提示在小鼠角膜上皮中均有K12、Pax6和Ki-67表達。然后本研究又對從角膜組織中提取出來的原代小鼠角膜上皮細胞進行培養(yǎng)，免疫熒光染色結果顯示，原代小鼠角膜上皮細胞中K12顯著表達，顯微鏡明場視野觀察顯示角膜組織碎片周圍有向外增殖的呈鵝卵石狀角膜上皮細胞，提示原代小鼠角膜上皮細胞提取成功。本研究又對原代小鼠角膜上皮細胞通過梯度摸索實驗，得到其轉染SV40-LT的最適MOI為5，計算加入培養(yǎng)板中的病毒量；為了讓細胞能夠穩(wěn)定轉染，又在培養(yǎng)液中加入最低致死濃度（2 mg/L）的嘌呤霉素，再將細胞進行傳代，獲得P1、P8代小鼠角膜上皮細胞。免疫熒光染色結果顯示，P8代與P1代細胞中K12、Pax6、Ki-67、K14和ABCG2均染色陽性，且K12、Pax6、Ki-67、K14和ABCG2陽性率比較，差異均無顯著性。K14是上皮細胞分化的標志物，僅僅表達于角膜緣基底細胞以及角膜上皮基底層［25-26］。ABCG2又稱乳腺癌抵抗蛋白1（BCRP1），是ABC家族的一員，是許多組織中干細胞的通用標志物［27］，在角膜緣干細胞中也顯著表達。最后為了評估傳代細胞的增殖能力，又進行了細胞克隆形成實驗，結果顯示P8和P1代細胞的克隆形成率無顯著差異。上述結果表明，轉染SV40-LT的原代小鼠角膜上皮細胞在傳代后穩(wěn)定表達K12、Pax6、Ki-67、K14和ABCG2，且沒有發(fā)生衰老或停止增殖等現(xiàn)象，說明永生化小鼠角膜上皮細胞系建立成功。但因為SV40-LT介導的細胞轉染會改變?nèi)旧w的結構和數(shù)量，與原代細胞相比，獲得的永生化細胞會隨著多次傳代出現(xiàn)異常核型，這也是本方法構建的細胞系局限性的一個方面。

綜上所述，本研究通過轉染SV40-LT成功建立了小鼠角膜上皮永生化細胞系，保留了原代小鼠角膜上皮細胞的特性，并且細胞的克隆能力良好。該方法獲得的小鼠角膜上皮細胞易于培養(yǎng)，穩(wěn)定增殖，為解決一直以來實驗用原代小鼠角膜上皮細胞數(shù)量少、易衰老等問題提供了可行方法，為角膜致病機制、藥物開發(fā)等方面的研究提供了可方便獲得的細胞系。

倫理批準和動物權利聲明： 本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學醫(yī)學部倫理委員會審核批準（文件號QDU-AEC-2022296）。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》的規(guī)定進行。

作者聲明： 白瑩、王一卉、陳鵬參與了研究設計；白瑩、王一卉、葛歡歡、卞雯晗參與了實驗操作、數(shù)據(jù)整理分析和論文寫作與修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波 厲建強）