摘" " 要：為了解決萱草愈傷組織僅生長(zhǎng)增大并未分化出芽的問(wèn)題，提高其繁殖系數(shù)，采用不同濃度配比的6-BA 和IBA為外源激素，對(duì)選育的JH2-2萱草繼代培養(yǎng)的愈傷組織接種培養(yǎng)，并對(duì)不同顏色的愈傷組織制成石蠟切片進(jìn)行觀(guān)察。結(jié)果表明：在接種培養(yǎng)的第6天開(kāi)始有小綠芽自愈傷組織上分化而出，第21天愈傷組織的分化率達(dá)到最大值，同時(shí)部分愈傷組織出現(xiàn)玻璃化，且后續(xù)沒(méi)有分化發(fā)芽跡象。外源激素6-BA比IBA對(duì)萱草愈傷組織的分化影響更大。適合萱草愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)的培養(yǎng)基比例組合為：MS+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂 6 g·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1，pH值為6.5，分化率達(dá)100%。對(duì)不同顏色的萱草愈傷組織制成石蠟切片進(jìn)行觀(guān)察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一種為胚性愈傷組織，外形呈球形顆粒狀，細(xì)胞排列整齊、緊密，細(xì)胞核染色較深；另一種為非胚性愈傷組織，外形松軟粗糙無(wú)固定形狀，細(xì)胞大小不均勻且無(wú)固定形狀，細(xì)胞核不明顯。在萱草的組織培養(yǎng)過(guò)程中，可以?xún)?yōu)先考慮接種乳白色和綠色的活性高的愈傷組織，對(duì)于提高萱草的分化率和繁殖率具有重要意義。本研究結(jié)果可為優(yōu)化萱草離體快繁技術(shù)體系，進(jìn)一步創(chuàng)造新品種提供一定的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：萱草；愈傷組織；分化；石蠟切片

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.1+9" " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2024.03.002

Study on Callus Differentiation Culture of Hemerocallis fulva

LIU Susu1， YIN Xinyan2， LI Jinxia2， ZHAO Lihong1， CHU Boyan2

（1.Hebei Agricultural University，Baoding，Hebei 071000，China； 2.Hebei Academy of Forestry and Grassland Science，Shijiazhuang，Hebei 050061，China）

Abstract： In order to solve the problem that Hemerocallis fulva healing tissues only grew and did not differentiate into buds， and to improve the reproduction coefficient， the healing tissues of selected JH2-2 hemerocallis successional culture were inoculated and cultured by using different ratios of exogenous hormones of 6-BA and IBA， and the healing tissues with different colours of healing tissues were made into paraffin slices for observation.The experimental results showed that on the 6th day of inoculation and culture， small green buds began to differentiate from the injured tissue one after another. On the twenty-first day， the differentiation rate of callus reached the maximum one after another. At the same time， some callus appeared vitrification， and there was no sign of differentiation and germination in the follow-up. The exogenous hormone 6-BA had a greater effect on the differentiation of hemerocallis than IBA. The proportion of medium suitable for differentiation culture of hemerocallis was MS+sucrose 30 g·L-1+agar 6 g·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1， pH Value was 6.5， and the differentiation rate reached 100% under this condition. It was found that one of them was embryogenic callus， which was spherical and granular in shape， the cells were arranged neatly and closely， and the nuclei were stained deeply. The other was non embryogenic callus， with soft and rough appearance， no fixed shape， uneven cell size and no fixed shape， and unclear nucleus. In the process of hemerocallis tissue culture， priority could be given to the inoculation of milky-white and green active healing tissues， which was of great significance for improving the differentiation and reproduction rates of hemerocallis. The results of the study can provide certain technical support for optimizing the technical system of hemerocallis in vitro fast propagation and further creating new varieties.

Key words： Hemerocallis fulva; callus; differentiation; paraffin section

萱草（Hemerocallis fulva），為五?；疲ˋdoxaceae）萱草屬（Hemerocallis）宿根草本植物，其葉叢生，花形普遍較大，株型美麗，花色艷麗，品種眾多，廣泛應(yīng)用于園林景觀(guān)建設(shè)和城市綠化，是一種重要的園林花卉。目前，萱草其繁殖主要采用分株和扦插等方法，由于繁殖系數(shù)低，限制了萱草在生產(chǎn)上的大規(guī)模栽培。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的萱草品種多為國(guó)外引進(jìn)的矮生多倍體品種，結(jié)實(shí)率低，大多依靠分株繁殖，年增殖率低。因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁育試管苗，可有效提高其繁育系數(shù)，滿(mǎn)足多方位的需求[1]。

關(guān)于激素對(duì)萱草植株再生影響的研究已有不少報(bào)道[2-7]，但是對(duì)萱草繁殖系數(shù)提高的研究還有局限性。在新品種繁殖過(guò)程中，使用分株和扦插等方法，其繁殖系數(shù)低，且繁殖周期較長(zhǎng)。為了快速提高新品種數(shù)量，可以選擇使用組織培養(yǎng)方法來(lái)提高繁殖系數(shù)。但是在愈傷組織分化的過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)部分萱草的愈傷組織僅生長(zhǎng)增大并未分化出芽，因此找到合適的培養(yǎng)基促使萱草的愈傷組織分化出芽成為重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。目前對(duì)萱草的組織培養(yǎng)研究已有一些進(jìn)展[8-10]，但通過(guò)石蠟切片觀(guān)察胚性愈傷組織還未有相關(guān)報(bào)道。

本研究通過(guò)揭示6-BA和IBA 2種激素不同配比對(duì)萱草的愈傷組織分化率的影響，以篩選出較適宜的激素配比。在對(duì)萱草的組織培養(yǎng)過(guò)程中，經(jīng)常出現(xiàn)褐化和玻璃化等現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致出芽分化率降低。為了更好地解決這一問(wèn)題，了解愈傷組織在分化過(guò)程中的細(xì)胞活性變化規(guī)律，對(duì)萱草愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)和細(xì)胞方面的探討，便于明確萱草愈傷組織分化與細(xì)胞活性的關(guān)系，為后續(xù)萱草組織培養(yǎng)接種愈傷組織類(lèi)型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為河北省林業(yè)和草原科學(xué)研究院選育的JH2-2萱草繼代培養(yǎng)無(wú)菌苗的愈傷組織。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織培養(yǎng) 將萱草愈傷組織在無(wú)菌條件下分割成1 cm×1 cm的小方塊，分別接入到繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)基分別為：①M(fèi)S+蔗糖 30 g·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1；②MS+蔗糖 30 g·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1；③MS+蔗糖 30 g·L-1+6-BA 1.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1；④MS+蔗糖 30 g·L-1+6-BA 1.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1；⑤MS+蔗糖 30 g·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1；⑥MS+蔗糖 30 g·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1，pH值為 6.5。每瓶 6 小塊愈傷組織，重復(fù)6組，于25 ℃光照條件下培養(yǎng)20 d。培養(yǎng)溫度控制在（24±2） ℃，光照強(qiáng)度為（1 500±200） lx，光照時(shí)間 16 h·d-1。

1.2.2 石蠟切片 采用常規(guī)石蠟切片的流程進(jìn)行制片和觀(guān)察。將0.5 cm2萱草愈傷組織材料放入FAA溶液中固定，切片厚度10 μm，每種類(lèi)型材料重復(fù)3個(gè)，將晾干封好的切片置于Nikon顯微鏡下觀(guān)察并在20×拍照。具體觀(guān)察萱草愈傷組織細(xì)胞形態(tài)及染色狀況，尋找胚性愈傷組織細(xì)胞和非胚性愈傷組織細(xì)胞的差異變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

無(wú)菌條件接種后，6 d后愈傷組織開(kāi)始出現(xiàn)分化出芽，每 3 d觀(guān)察1次，統(tǒng)計(jì)分化情況，統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為以每塊愈傷組織分化出2個(gè)及2個(gè)以上芽體確定為分化，統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)為1，分化出2個(gè)以下芽體統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)為0.5，未分化出芽體計(jì)數(shù)為0。第21天結(jié)束統(tǒng)計(jì)，并以第21天統(tǒng)計(jì)結(jié)果做試驗(yàn)分析。

采用Microsoft Excel 2013軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖分析；使用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析和多重比較。分化率計(jì)算公式如下。

分化率=已分化愈傷組織塊數(shù)/總接種愈傷組織塊數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA和IBA對(duì)萱草愈傷組織分化出芽的影響

萱草愈傷組織分化出芽進(jìn)程的影響如圖1所示。接種第6天，除了處理4的愈傷組織未分化出芽，其他處理的愈傷組織均分化出芽；第9天，處理4分化出芽，處理2的萱草愈傷組織分化率最高（58%），處理3和處理4分化率最低（25%）；第12～18 d，處理1的愈傷組織分化較快，處理2的愈傷組織分化率最高，處理3和處理4的分化率沒(méi)有變化，處理5和處理6的分化率略有提高；第21天，各處理的分化率最高，處理1至處理6的分化率分別為92.22%、100%、66.67%、75%、75%和83.33%，之后愈傷組織停止分化出芽。整體來(lái)看，處理2對(duì)萱草愈傷組織分化出芽分化率的影響較好，分化率達(dá)到100%。

不同濃度的6-BA和IBA激素對(duì)愈傷組織分化率影響的顯著性方差分析如表1所示。由表1可知，激素6-BA對(duì)愈傷組織分化率具有極顯著影響，而激素IBA對(duì)愈傷組織分化率無(wú)顯著影響，且激素6-BA和IBA互作不明顯。

2.2 IBA濃度一定，不同濃度的6-BA對(duì)萱草愈傷組織分化出芽的影響

不同濃度的6-BA對(duì)萱草愈傷組織分化出芽進(jìn)程的影響如圖2和圖3所示。在IBA濃度為 0.1 mg·L-1和0.2 mg·L-1的處理中，6-BA對(duì)萱草愈傷組織分化出芽的影響一致，IBA濃度為 0.2 mg·L-1的處理中，接種第6天時(shí)，6-BA濃度為1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1處理下的萱草愈傷組織能分化出芽，而濃度為1.5 mg·L-1處理下的愈傷組織并沒(méi)有分化出芽；第9天所有處理的愈傷組織均分化出芽，第21天分化率達(dá)到最高，愈傷組織停止分化出芽，且在整個(gè)過(guò)程中分化出芽速度較為均勻。整體來(lái)看，6-BA濃度為1.0 mg·L-1的處理對(duì)萱草愈傷組織分化出芽的影響較好，分化率更高。

由表2可知，不同濃度的6-BA對(duì)愈傷組織分化率的影響排序?yàn)椋?.0 mg·L-1＞2.0 mg·L-1＞1.5 mg·L-1，且濃度為1.0 mg·L-1的處理顯著高于濃度為2.0 mg·L-1的處理。

2.3 在相同濃度的6-BA條件下，不同濃度的IBA對(duì)萱草愈傷組織分化出芽的影響

不同濃度的IBA對(duì)萱草愈傷組織分化出芽進(jìn)程的影響如圖4所示。在6-BA濃度為1.0、1.5、2.0 mg·L-1的處理中，IBA對(duì)萱草愈傷組織分化出芽的影響一致，數(shù)據(jù)顯示，6-BA濃度為1.0 mg·L-1的處理中，接種第6天，IBA濃度為0.1 mg·L-1和0.2 mg·L-1處理下的萱草愈傷組織均分化出芽，第21天分化率最高，愈傷組織停止分化出芽，且在整個(gè)過(guò)程中分化出芽速度先快后慢。整體來(lái)看，IBA濃度為0.2 mg·L-1的處理對(duì)萱草愈傷組織分化出芽的影響較好，分化率更高。

2.4 不同萱草愈傷組織細(xì)胞外部形態(tài)學(xué)觀(guān)察

根據(jù)觀(guān)察結(jié)果愈傷組織呈現(xiàn)出乳白、白色、黃色、綠色。第1種是乳白色愈傷組織（圖1- A），外表光滑，單體組成較大，顏色為乳白色，不透明度高，質(zhì)地較硬，切開(kāi)內(nèi)部緊實(shí)；第2種是白色愈傷組織（圖1- B），外表呈團(tuán)狀，單體組成較小，單體顆粒狀明顯，顏色為白色，不透明度較低，質(zhì)地綿軟，切開(kāi)內(nèi)部疏松，易散；第3種是黃色愈傷組織（圖1 -C），外表呈團(tuán)狀，較為粗糙，單體組成較小，單體顆粒狀明顯，顏色為淺黃色，不透明度較低，質(zhì)地綿軟，切開(kāi)內(nèi)部疏松呈鏤空狀，易散；第4種是綠色愈傷組織（圖1-D）外表呈團(tuán)狀單體組成較小，單體顆粒狀明顯，顏色為淺綠色，不透明度較低，質(zhì)地綿軟，切開(kāi)內(nèi)部疏松，易散。

通過(guò)持續(xù)觀(guān)察，筆者發(fā)現(xiàn)白色疏松質(zhì)地的愈傷組織逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黃色疏松質(zhì)地愈傷組織，后變至綠色疏松質(zhì)地愈傷組織，至此部分綠色疏松質(zhì)地愈傷組織會(huì)分化出芽，也有部分會(huì)玻璃化甚至褐化。玻璃化或者褐化的愈傷組織很難再分化出芽，活性會(huì)大幅度降低，后續(xù)繼代一般不會(huì)選擇接種玻璃化和褐化的愈傷組織進(jìn)行組織培養(yǎng)。

2.5 不同萱草愈傷組織細(xì)胞觀(guān)察結(jié)果

對(duì)4種不同愈傷組織的石蠟切片進(jìn)行觀(guān)察（圖2），筆者發(fā)現(xiàn)乳白色愈傷組織內(nèi)部材料和外部材料能觀(guān)察到胚性細(xì)胞。白色愈傷組織內(nèi)部材料和外部材料不能觀(guān)察到胚性細(xì)胞。黃色愈傷組織內(nèi)部材料不能觀(guān)察到胚性細(xì)胞，黃色愈傷組織外部材料偶爾觀(guān)察到胚性細(xì)胞。綠色愈傷組織內(nèi)部材料和外部材料均可觀(guān)察到胚性細(xì)胞。由以上結(jié)果推斷乳白色愈傷組織和綠色愈傷組織的細(xì)胞活性較大，白色愈傷組織和黃色愈傷組織的細(xì)胞活性較小，在同一種愈傷組織中，外部的愈傷組織胚性細(xì)胞要多于內(nèi)部的愈傷組織。

3 討論與結(jié)論

6- BA濃度為 1.0 mg·L-1時(shí)對(duì)萱草愈傷組織分化的影響力最大，IBA 濃度為 0.2 mg·L-1 時(shí)對(duì)萱草愈傷組織分化的影響力最大。在所有培養(yǎng)基組合中： MS+瓊脂 6 g·L-1+蔗糖 30 g·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1的分化率達(dá)到了100%，確定為本研究的最佳培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)方差分析，筆者發(fā)現(xiàn)6-BA對(duì)愈傷組織分化的影響顯著，IBA對(duì)愈傷組織分化的影響不顯著。但從整個(gè)分化培養(yǎng)的結(jié)果來(lái)看，隨著IBA濃度的增大，愈傷組織的分化率均會(huì)呈現(xiàn)出增高的趨勢(shì)，說(shuō)明IBA是萱草愈傷組織分化出芽培養(yǎng)的必需外源激素。以6-BA作為單個(gè)因子統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，整個(gè)分化過(guò)程隨著6-BA濃度的增加分化率呈先下降后升高的趨勢(shì)。以IBA作為單個(gè)因子統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，隨著IBA濃度的增加，分化率呈下降的趨勢(shì)。

在萱草的組織培養(yǎng)過(guò)程中，可以?xún)?yōu)先考慮接種乳白色和綠色的高活性愈傷組織，同時(shí)對(duì)于誘導(dǎo)其他活性較低的愈傷組織分化出芽也是需要深入研究的一個(gè)重要課題，對(duì)于提高萱草的分化率和繁殖率具有重要意義。目前，通過(guò)石蠟切片觀(guān)察萱草胚性愈傷組織還未有報(bào)道。黃碧蕓等[15]研究發(fā)現(xiàn)，外觀(guān)呈乳白色，整體組織致密，這類(lèi)胚性細(xì)胞體積小，有大而明顯的細(xì)胞核，外部由大體積非胚性細(xì)胞包裹，此類(lèi)愈傷組織增殖能力強(qiáng)，與本研究結(jié)果一致；張青華等[13]研究發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織呈球形顆粒狀，細(xì)胞排列整齊、緊密，細(xì)胞核染色較深，非胚性愈傷組織外形松軟粗糙無(wú)固定形狀，細(xì)胞大小不均勻且無(wú)固定形狀，細(xì)胞核不明顯，與本研究結(jié)果一致。

在愈傷分化出芽的時(shí)間內(nèi)6～18 d為分化出芽的時(shí)間段，18 d之后沒(méi)有分化出芽的愈傷很難繼續(xù)出芽，有的甚至?xí)霈F(xiàn)玻璃化和褐化的情況，可以考慮對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行進(jìn)一步的繼代或者其他操作，以保證其維持在活性較強(qiáng)的狀態(tài)。

植物組織培養(yǎng)方法的研究不僅涉及到的環(huán)節(jié)多，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響因素也較為復(fù)雜，試驗(yàn)材料個(gè)體的生長(zhǎng)狀態(tài)差異顯著。本研究初步探討了激素6-BA和IBA對(duì)萱草愈傷組織分化的影響，仍需要后續(xù)進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李成， 張建偉. 大花萱草組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)[J]. 林業(yè)實(shí)用技術(shù)， 2009（7）： 52-53.

[2] 李秀華， 杜貞， 武銀玉， 等. 大花萱草組培快繁體系的研究[J]. 植物研究， 2009， 29（6）： 757-762.

[3] 王曉娟， 金樑， 陳家寬. 大花萱草不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的比較研究[J]. 生命科學(xué)研究， 2005， 9（3）： 242-246.

[4] 朱華芳， 胡永紅， 瞿蒙滔. 萱草園藝品種繁殖技術(shù)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007， 35（16）： 4833-4834.

[5] 劉先芳， 羅軍， 吳鐵明. 重瓣大花萱草組織培養(yǎng)快速繁殖的研究[J]. 湖南林業(yè)科技， 2001， 28（4）： 41-42， 34.

[6] 郭達(dá)初， 劉克斌， 柴明良， 等. 大花萱草組織培養(yǎng)快速繁殖[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 1990， 2（3）： 137-141.

[7] 倪新， 馬毓. 多倍體萱草的組織培養(yǎng)及其繁殖[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 1984（3）： 202-206， 217.

[8] 楊乃博. 雜種大花萱草的試管繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊， 1985（5）： 39.

[9] 王漢海， 程貫召， 杜延飛. 大花萱草新品種 “金娃娃” 的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2002， 38（5）： 458.

[10] CHEN C H， HOLDEN D J. Organogenesis in daylily callus[J]. Proceedings of the South Dakota Academy of Science， 1972， 51： 146-149.

[11] 李紅， 李波， 陳雪梅， 等. 苜蓿愈傷組織細(xì)胞學(xué)觀(guān)察及芽分化的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 43（6）： 49-51.

[12] 周再知， 徐大平， 梁坤南， 等. 鈣離子及pH值對(duì)柚木組培苗生長(zhǎng)和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收的影響[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 29（3）： 1-5.

[13] 張青華， 王微， 陳鵬， 等. 玉露花莖誘導(dǎo)的2種愈傷組織細(xì)胞學(xué)及分化研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2021， 41（2）： 54-59.

[14] 常裕， 何亞蓉， 王凱琪， 等. 山丹丹愈傷組織分化培養(yǎng)研究[J]. 延安大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2021， 40（2）： 8-10.

[15] 黃碧蕓， 卓仁英， 喬桂榮. 毛竹不同類(lèi)型愈傷組織比較分析[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2023， 47（6）： 141-149.