馮曉陽，徐丹鴻，楊 迪，劉錦田

（1.黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)系，黑龍江 哈爾濱 150025；2.中國鐵路哈爾濱局集團(tuán)有限公司哈爾濱鐵路疾病預(yù)防控制中心，黑龍江 哈爾濱 150006）

錦燈籠（紅菇娘） 素有“草本水果”之稱，不僅富含氨基酸、蛋白質(zhì)、纖維素、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，還含有豐富的化學(xué)成分，包括甾體類、黃酮類、萜類、生物堿類、苯丙素類、糖苷類、酚酸類等[1]，迄今已從錦燈籠中分離鑒定出大約159 種化合物[2]。其全草及果實(shí)、根均可入藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其后歷代本草多有收載，是2005 年版藥典中規(guī)定的藥用部位。多糖是錦燈籠屬植物的主要有效成分之一，具有抗氧化、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、改善腸道微生態(tài)等多種生物活性[2]。目前，錦燈籠多作為水果供當(dāng)?shù)厝耸秤?，?duì)其有益成分的提取和精深加工，在食品及生物醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)?huì)有廣闊的應(yīng)用前景[3]。以藥食兩用、苦寒無毒的草本植物錦燈籠為原料，對(duì)錦燈籠果實(shí)多糖采用超聲波輔助熱水法提取，對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用三氯乙酸法對(duì)制得的粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理，以期為工業(yè)化大規(guī)模提取錦燈籠多糖提供依據(jù)和參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

錦燈籠，購自黑龍江省哈爾濱。

1.2 儀器

DHG-9240 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、HBS-5 型真空泵，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；ALC-1104 型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；HHS 型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；TDL- 5-W 型臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；TV-1901 型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品；BCD-238（L） 型美菱電冰箱，合肥美菱股份有限公司產(chǎn)品；KQ300-VDB 型超聲波，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試劑

無水乙醇、無水乙醚、石油醚、丙酮、濃硫酸、重蒸苯酚、葡萄糖、考馬斯亮藍(lán)、牛血清白蛋白、三氯乙酸，以上試劑均為分析純化學(xué)試劑。

2 試驗(yàn)方法

2.1 材料預(yù)處理

新鮮的錦燈籠果實(shí)去腐爛后清洗，于60 ℃條件下烘干，粉碎過篩（40 目），石油醚脫脂處理后備用。

2.2 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定[4]。

2.3 多糖提取率

2.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[5]。

2.5 超聲輔助熱水浸提法提取錦燈籠果實(shí)多糖工藝的研究

稱取相同質(zhì)量的經(jīng)脫脂處理后的錦燈籠果實(shí)粉末，采用超聲波輔助熱水浸提法提取水溶性多糖，研究超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比對(duì)多糖得率的影響。并對(duì)4 個(gè)因素做三水平的正交試驗(yàn)，均以多糖提取率為指標(biāo)。

錦燈籠果實(shí)多糖提取的單因素試驗(yàn)水平見表1。

表1 錦燈籠果實(shí)多糖提取的單因素試驗(yàn)水平

2.6 三氯乙酸除蛋白法

依次取錦燈籠果實(shí)粗多糖液20 mL，加入等體積的三氯乙酸溶液，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%，2%，3%，4%，5%，6%，振搖30 min，于4 ℃條件下靜置過夜，離心（轉(zhuǎn)速4 000 r/min，時(shí)間5 min） 棄去沉淀，收集上清液，測(cè)定多糖保留率和蛋白脫除率。

3 結(jié)果與分析

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得回歸方程：Y=0.009 6X-0.004 61，R2=0.999 2.

3.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以牛血清蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得回歸方程：Y=0.000 6X+0.068 7，R2=0.998 5.

3.3 超聲輔助熱水浸提法提取錦燈籠果實(shí)多糖工藝的研究

3.3.1 超聲功率對(duì)錦燈籠果實(shí)多糖得率的影響

分別稱取相同質(zhì)量的脫脂錦燈籠果實(shí)粉末，料液比為1∶15，超聲溫度為60 ℃的條件下，分別于超聲功率為140，160，180，200，220 W 的條件下超聲處理30 min，研究不同超聲功率對(duì)多糖得率的影響。

超聲功率對(duì)錦燈籠果多糖得率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對(duì)錦燈籠果多糖得率的影響

由圖1 可知，錦燈籠果實(shí)多糖提取率均隨著超聲功率的升高先增加后減少。果實(shí)多糖在超聲功率為200 W 時(shí)，提取率達(dá)到最大值，超過200 W 時(shí)，多糖提取率開始下降，這是由于超聲功率越大，其機(jī)械振動(dòng)強(qiáng)度越大，對(duì)錦燈籠果實(shí)多糖的破碎作用越強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致多糖分子糖苷鍵的斷裂，影響多糖得率。

3.3.2 超聲溫度對(duì)錦燈籠果實(shí)多糖提取率的影響

分別稱取相同質(zhì)量的脫脂錦燈籠果實(shí)粉，料液比為1∶15，超聲功率180 W，分別于超聲溫度為40，50，60，70，80 ℃的條件下超聲處理30 min，研究不同超聲溫度對(duì)多糖得率的影響。

超聲溫度對(duì)錦燈籠果實(shí)多糖得率的影響見圖2。

圖2 超聲溫度對(duì)錦燈籠果實(shí)多糖得率的影響

由圖2 可知，隨著超聲溫度的升高，多糖得率隨之增加，在超聲輔助提取，超聲溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高，但溫度過高會(huì)影響多糖的活性，同時(shí)對(duì)儀器設(shè)備的要求也提高。

3.3.3 超聲時(shí)間對(duì)錦燈籠果多糖提取率的影響

分別稱取相同質(zhì)量的脫脂錦燈籠果實(shí)粉末，料液比為1∶15，超聲功率180 W，分別于超聲溫度為60 ℃的條件下超聲處理30，40，50，60，70 min，研究不同超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。

超聲時(shí)間對(duì)錦燈籠果實(shí)多糖得率的影響見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)錦燈籠果實(shí)多糖得率的影響

由圖3 可知，超聲時(shí)間為30～50 min 時(shí)，隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，果實(shí)多糖在超聲處理時(shí)間為50 min 時(shí)，提取率達(dá)到最大值。超聲處理具有較強(qiáng)的剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間處理會(huì)使大分子的糖苷鍵斷裂，從而影響多糖得率，使錦燈籠果實(shí)多糖得率呈下降趨勢(shì)。

3.3.4 料液比對(duì)錦燈籠果實(shí)多糖提取率的影響

分別稱取相同質(zhì)量的脫脂錦燈籠果實(shí)粉末，在料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，超聲功率180 W，超聲溫度為60 ℃的條件下超聲處理30 min，研究不同料液比對(duì)多糖得率的影響。

料液比對(duì)錦燈籠果實(shí)多糖得率的影響見圖4。

圖4 料液比對(duì)錦燈籠果實(shí)多糖得率的影響

由圖4 可知，隨著提取劑水用量的增大，錦燈籠果實(shí)多糖的提取率也隨之增加，在用水量較低時(shí)，不利于多糖物質(zhì)的溶出，得率較低，但用水量過大會(huì)增加濃縮成本。因此，在選擇料液比時(shí)需考慮工藝的實(shí)用性，料液比應(yīng)適宜。

3.3.5 優(yōu)化超聲法提取錦燈籠果實(shí)多糖工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮多糖得率、減少能耗及可操作性，選取超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比進(jìn)行正交試驗(yàn)，提取次數(shù)1 次。

錦燈籠果實(shí)多糖超聲提取L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 錦燈籠果實(shí)多糖超聲提取L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由極差分析可知，影響多糖提取率各因素的主次關(guān)系為超聲功率＞超聲溫度＞超聲時(shí)間＞料液比，得出超聲法提取錦燈籠果多糖的最佳工藝條件為超聲功率200 W，超聲溫度80 ℃，超聲處理40 min，料液比1∶20，錦燈籠果實(shí)多糖得率可達(dá)到3.72%。

3.6 三氯乙酸除蛋白法

TCA 法脫蛋白效果見圖5。

圖5 TCA 法脫蛋白效果

結(jié)果表明，隨著三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，脫蛋白效果增強(qiáng)，同時(shí)多糖含量保留率也隨著三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而減少，三氯乙酸法脫蛋白時(shí)反應(yīng)較為劇烈，當(dāng)三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過4%時(shí)，多糖保留率減少的速率增大，其原因可能是三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，對(duì)多糖有破壞作用。綜合考慮，蛋白質(zhì)脫除率和多糖得率及三氯醋酸可能對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的影響，選擇三氯乙酸最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，此時(shí)蛋白質(zhì)的脫除率為40.26%，多糖保留率為81.71%。

4 結(jié)論

探索了超聲法輔助熱水浸提法制備錦燈籠多糖的最佳提取工藝路線。結(jié)果表明，在超聲功率200 W，超聲溫度80 ℃，超聲處理40 min，料液比1∶20 條件下，錦燈籠果實(shí)多糖得率可達(dá)到3.72%。錦燈籠果實(shí)粗多糖在三氯乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，蛋白質(zhì)的脫除率為40.26%，多糖損失率較低，多糖得率為81.71%。錦燈籠粗多糖含有一定量的蛋白質(zhì)和色素，有關(guān)錦燈籠多糖結(jié)構(gòu)及生理活性的研究后期需要進(jìn)一步探討。