胡素楠，戰(zhàn)映妤，陳泳汀，王淑涵，鄭桂玲，張保華

(青島農(nóng)業(yè)大學新農(nóng)藥創(chuàng)制研究所，青島 266109)

農(nóng)藥在防治病蟲草害、保障農(nóng)作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)等方面發(fā)揮著不可忽視的作用，已經(jīng)成為一種重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料[1]。但化學農(nóng)藥由于長期使用，對土壤、空氣以及水源等環(huán)境生態(tài)造成不良影響，其在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留也威脅到了食品安全[2]。生物農(nóng)藥具有選擇性強，對人畜安全高效，對生態(tài)環(huán)境影響較小等優(yōu)點，已經(jīng)成為病蟲害綠色防控和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保障之一[3]。

甜菜夜蛾核型多角體病毒(Spodoptera exiguan ucleopolyhedrovirus，SeNPV)來源于致病的甜菜夜蛾幼蟲，對甜菜夜蛾及相同科屬的大部分害蟲具有專一活性和高致病力，屬于環(huán)境友好的生物殺蟲劑[4]。甜菜夜蛾核型多角體病毒能夠有效控制甜菜夜蛾種群的數(shù)量增長，尤其對抗性甜菜夜蛾有良好的防治效果，具有重要的經(jīng)濟、生態(tài)和環(huán)保價值，應用前景廣闊。核型多角體病毒主要由多角體蛋白和其包裹的病毒粒子構(gòu)成，在高溫和紫外照射條件下易變性失活，影響其殺蟲性能[5]。

海藻酸鈉(sodium alginate)是一種來源廣泛、成本低廉的天然多糖大分子化合物，可與鈣離子等金屬陽離子發(fā)生固化形成凝膠，具有良好的生物相容性，在環(huán)境中易被生物降解，同時對人畜無毒，因此常被用作載藥材料[6-7]，尤其是作為蛋白質(zhì)類生物活性物質(zhì)、活體細胞、真菌或細菌等的載體或包埋材料[8-9]。

基于海藻酸鈉的良好生物降解性和生物相容性，本研究以海藻酸鈉為包埋材料，通過優(yōu)化載體濃度、進樣速率等工藝條件，采用噴霧法制備了甜菜夜蛾核型多角體病毒顆粒劑，采用掃描電鏡等手段對其進行了表征，并進一步考察病毒顆粒劑的熱穩(wěn)定性、抗紫外性能和殺蟲活性，從而為SeNPV 病毒制劑的開發(fā)應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器與設(shè)備

HH—1 型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇榮華儀器制造有限公司)，78 HW—1 數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機有限公司)，HC—3018 高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，F(xiàn)A1104 B 電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)，BT—9300 ST 激光粒度分布儀(丹東百特儀器有限公司)，JEOL7500 F型掃描電子顯微鏡(日本電子公司)，F(xiàn)D—1A—50 冷凍干燥機(上海比郎儀器制造有限公司)。

1.1.2 藥品與試劑

甜菜夜蛾核型多角體病毒(青島農(nóng)業(yè)大學植物醫(yī)學學院)，海藻酸鈉(AR，天津市博迪化工有限公司)，氯化鈣(AR，天津市巴斯夫化工有限公司)。

1.1.3 試驗蟲源

甜菜夜蛾3 齡幼蟲(青島農(nóng)業(yè)大學植物醫(yī)學院實驗室飼養(yǎng))。

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒海藻酸鈉顆粒劑制備與表征

病毒海藻酸鈉顆粒劑的制備 參考顏光耀等[10]的方法，先配制一定質(zhì)量濃度的海藻酸鈉溶液，將1 mL SeNPV(濃度為1.5×106PIB/mL)緩緩滴加到海藻酸鈉溶液中，避光磁力攪拌1 h。然后將均勻混合的含病毒的海藻酸鈉溶液使用二流體噴嘴進行霧化(噴嘴與液面相距20 cm)，按照一定的進樣速率將霧化液噴入0.1 mol/L 的氯化鈣溶液中進行凝聚。噴霧結(jié)束后，取部分病毒顆粒劑懸浮液，用激光粒度分布儀測量病毒顆粒劑的粒徑大小。并將剩余的顆粒劑懸浮液進行抽濾，冷凍干燥，得到病毒海藻酸鈉顆粒劑固體試樣，將試樣置于4 ℃冰箱中保存待用。

制備工藝單因素試驗 以海藻酸鈉質(zhì)量濃度和進樣速率為制備條件，進行制備工藝優(yōu)化，海藻酸鈉濃度設(shè)為0.5%、1.0%、1.5%，進樣速率分別為11、13、15 mL/min，其他條件保持一致，按照上述方法步驟制備病毒顆粒劑。

1.2.2 病毒海藻酸鈉顆粒劑的形貌表征

取干燥至恒重的顆粒劑試樣少許，用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察顆粒劑形貌。

1.2.3 病毒海藻酸鈉顆粒劑的生物活性測定

采用飼料混毒法測定病毒顆粒劑對甜菜夜蛾幼蟲的生物活性。分別取病毒含量一致的病毒懸浮液和病毒顆粒劑懸浮液，取0.2 mL 用一次性注射器均勻滴加到飼料上，晾干，使表面沒有明顯的水漬。挑取大小均勻的3 齡甜菜夜蛾幼蟲15 頭，輕輕地放在裝有混毒飼料的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱(溫度為25 ℃，濕度為65%)中觀察培養(yǎng)，每24 h 觀察記錄幼蟲的病死數(shù)量，并記錄病蟲死蟲的形態(tài)特征，觀察7 d 或直至幼蟲全部死亡。每個處理重復3 次，計算平均死亡率。

1.2.4 病毒海藻酸顆粒劑的抗紫外線性能測定

稱取0.02 g 病毒海藻酸鈉顆粒劑，用蒸餾水配制成2 mL 的溶液，3 次重復。分別于紫外分析儀(30 W，波長范圍在200～300 nm，255 nm 處最強) 中照射1、2 h。處理完成后，放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。配? mL 與上述處理含有相同病毒量的SeNPV 溶液作為陽性對照，蒸餾水作為空白對照，在紫外線條件下處理相同時間。將紫外處理過的蒸餾水、SeNPV、病毒顆粒劑溶液采用飼料混毒法測定對甜菜夜蛾幼蟲的生物活性，記錄7 d 的死亡率。

1.2.5 病毒海藻酸鈉顆粒劑的耐熱性能測定

將SeNPV 和病毒顆粒劑分別用蒸餾水配制成病毒含量相同的懸浮液，取2 mL 分裝于10 mL 離心管中，水浴加熱并測量溫度。加熱處理分成2 組：溫度設(shè)置為25、35、45 ℃，處理時間為6 h，處理后的病毒溶液冷卻至室溫后置于4 ℃冰箱冷藏保存。采用飼料混毒法測定處理的病毒和病毒顆粒劑對甜菜夜蛾幼蟲的生物活性，記錄7 d 的死亡率。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒海藻酸鈉顆粒劑制備

2.1.1 海藻酸鈉濃度對顆粒劑性能及對甜菜夜蛾幼蟲死亡率的影響

已有研究表明，載體用量會影響顆粒劑的形態(tài)、產(chǎn)率和粒徑等性能[11-12]，表1 是選用不同用量的海藻酸鈉所制備的病毒顆粒劑的產(chǎn)率和粒徑。其中當海藻酸鈉用量為1%時，顆粒劑產(chǎn)率最高，達到79.43%，海藻酸鈉用量為0.5%時，所得顆粒劑的中位徑(D50)最小，但海藻酸鈉含量為1%、1.5%的中位徑(D50)差異不顯著。表明海藻酸鈉含量較低時，形成的顆粒劑不能完整包埋病毒，導致顆粒劑粒徑偏小和顆粒劑的產(chǎn)率偏低，但海藻酸鈉含量過高時，黏度增大，霧化效果差，也影響了顆粒劑的產(chǎn)率。

表1 不同海藻酸鈉用量制備的顆粒劑的產(chǎn)率及中位徑

由圖1 不同病毒顆粒劑對甜菜夜蛾幼蟲的致死曲線趨勢可以看出，所制備的海藻酸鈉病毒顆粒劑的感染力及致病力與SeNPV 病毒差異不顯著，說明包埋病毒不會影響SeNPV 病毒的感染力及致病力。

圖1 海藻酸鈉濃度對病毒顆粒劑對甜菜夜蛾3 齡幼蟲致死能力的影響

圖2為不同用量海藻酸鈉制備的病毒顆粒劑的掃描電鏡圖和粒徑分布，由圖2 中A～C 圖可以看出，所制備的病毒顆粒劑均呈不規(guī)則形狀，其中海藻酸鈉用量為1%時，外觀相對飽滿，表面光滑，形狀較為規(guī)則。圖2 D 顯示的是不同海藻酸鈉用量對病毒顆粒劑的粒度的影響，可以看出，0.5%的海藻酸鈉用量制備的顆粒劑粒度分布不如其他海藻酸鈉用量制備的顆粒劑集中，結(jié)合顆粒劑產(chǎn)率，確定1%的海藻酸鈉作為病毒顆粒劑制備的載體用量。

圖2 海藻酸鈉濃度對病毒顆粒劑的形貌和粒徑的影響

2.1.2 進樣速率對顆粒劑性能及對甜菜夜蛾幼蟲死亡率的影響

表2為不同進樣速率制備的病毒顆粒劑的產(chǎn)率及中位徑(D50)的大小，隨著進樣速率的增加，D50略微增大，但進樣速率為13 mL/min 時，顆粒劑的產(chǎn)率最高，達到77.24%。

表2 不同進樣速率制備的顆粒劑的產(chǎn)率和中位徑

圖3為不同進樣速率制備的病毒顆粒劑對甜菜夜蛾3 齡幼蟲致死率的影響，由圖3 可知，海藻酸鈉病毒顆粒劑對甜菜夜蛾幼蟲的致死率均隨著時間的延長而提高，且與未加工成顆粒劑的病毒致死率的趨勢接近一致，說明進料速率沒有降低顆粒劑中病毒的殺蟲活性。

圖3 不同進料速率制備的病毒顆粒劑對甜菜夜蛾3 齡幼蟲致死率的影響

圖4為不同進料速率制備的病毒顆粒劑的外觀形貌和粒徑分布。由圖4A～4 C 可以看出，不同進料速率對病毒顆粒劑的形貌影響不大，所制備的顆粒劑均呈現(xiàn)不規(guī)則多面形狀，其中進料速率為13 mL/min時，形貌較為規(guī)則。圖4 D 病毒顆粒劑的粒度分布顯示進料速率對顆粒劑的粒徑和分布影響不顯著，粒徑分布較集中，D50在130 μm 左右，綜合病毒顆粒劑的產(chǎn)率，確定進料速率為13 mL/min。

圖4 進料速率對病毒顆粒劑的形貌和粒徑的影響

基于以上對病毒顆粒劑制備中海藻酸鈉用量、進料速率等的優(yōu)化篩選，確定海藻酸鈉用量為1%，進樣速率為13 mL/min。在此基礎(chǔ)上制備病毒顆粒劑(病毒含量1.0×106PBI/g)，并以甜菜夜蛾3 齡幼蟲為對象，測定病毒顆粒劑的殺蟲活性，具體結(jié)果見圖5。由圖5 可以看出，海藻酸鈉病毒顆粒劑的殺蟲活性隨時間的趨勢圖與未加工的病毒的殺蟲活性接近，說明病毒經(jīng)包埋后沒有降低甜菜夜蛾核型多角體病毒的殺蟲活性。

圖5 病毒顆粒劑化對甜菜夜蛾3 齡幼蟲致死率的影響

2.2 病毒顆粒劑的抗紫外輻射和耐熱性能

昆蟲病毒對環(huán)境適應性較差，尤其對紫外線和高熱比較敏感，容易失活[13]。因此，本文考察了病毒顆粒劑化對其抗紫外和耐熱性能的影響，具體結(jié)果如圖6。從圖6 A 中可以看出，紫外處理1、2 h后的SeNPV 的死亡率分別為40.25%、33.33%；病毒顆粒劑的死亡率分別為59.83%、46.67%，顆粒劑化的SeNPV 對甜菜夜蛾幼蟲的致死率均高于未包埋的SeNPV，說明病毒顆粒劑化后對紫外線有一定的抵抗能力，可以降低紫外線對SeNPV 的殺滅作用。圖6 B 是不同處理溫度對病毒和病毒顆粒劑殺蟲活力的影響。由圖中可以分析，35 ℃處理下甜菜夜蛾幼蟲累積死亡率明顯高于25、45 ℃的處理，但在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，能增強病毒的活性。同時可以看到，相對于未包埋的昆蟲病毒，病毒包埋后可以減輕溫度對病毒活力的影響，對甜菜夜蛾幼蟲保持較高的致死率。

圖6 病毒顆粒劑化對其抗紫外輻射(A)和耐熱性能(B)的影響

3 結(jié)論

甜菜夜蛾核型多角體病毒是一類具有環(huán)境友好、毒力專一性強的昆蟲病毒類生物農(nóng)藥，本研究以海藻酸鈉為包埋材料，結(jié)合對海藻酸鈉濃度、進料量等工藝條件的優(yōu)化，利用噴霧法制備了病毒顆粒劑，所得的病毒顆粒劑形狀不規(guī)則，產(chǎn)品產(chǎn)率達到79.4%，病毒含量1.0×106PBI/g，D50在130μm 左右，且病毒顆粒劑具有良好的熱穩(wěn)定性和抗紫外性能。研究結(jié)果為甜菜夜蛾核型多角體病毒制劑的研究和應用提供了思路。