1.重要意義

該研究表明，用一種調(diào)節(jié)劑靶向σ2R/TMEM97，可以在小鼠模型中降低疼痛超敏性，且具有精確的選擇性。研究還發(fā)現(xiàn)整合應(yīng)激反應(yīng)(ISR)的抑制是一種潛在的作用機(jī)制，它將受體與細(xì)胞信號(hào)事件聯(lián)系在一起，在臨床前和臨床上驗(yàn)證了這種機(jī)制對(duì)緩解疼痛的作用。該研究表明，σ2R/TMEM97 可以被特定的小分子選擇性地結(jié)合，從而在對(duì)神經(jīng)病理性疼痛至關(guān)重要的細(xì)胞亞群中產(chǎn)生ISR 抑制作用。因此，σ2R/TMEM97 靶向療法有可能在非阿片受體的情況下有效地緩解疼痛。

2.背景

神經(jīng)病理性疼痛是由軀體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病引起的，影響的人數(shù)約占總?cè)丝诘?0%，是造成嚴(yán)重慢性疼痛的主要原因。神經(jīng)病理性疼痛的治療是一項(xiàng)重大的臨床挑戰(zhàn)，因?yàn)楝F(xiàn)有藥物不僅療效有限，而且還會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。目前急需能通過(guò)非阿片類藥物和非成癮機(jī)制緩解神經(jīng)病理性疼痛并改善不良反應(yīng)的新型藥物。

2017 年，σ2受體(σ2R)被確認(rèn)為跨膜蛋白 97(TMEM97)。該研究發(fā)現(xiàn)，幾種選擇性與σ2R/TMEM97結(jié)合的小分子能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈而持久的抗神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛效應(yīng)，這一發(fā)現(xiàn)被結(jié)構(gòu)不同的分子獨(dú)立復(fù)制。盡管σ2R/TMEM97 的生物功能尚不十分清楚，但它是一種與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的跨膜蛋白，在鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)及穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用。20(S)-羥基膽固醇最近被確定為σ2R/TMEM97 的內(nèi)源配體。σ2R/TMEM97 的作用主要集中于癌癥，但它也與包括阿爾茨海默病和帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。在許多神經(jīng)退行性疾病模型中，包括創(chuàng)傷性腦損傷、亨廷頓病和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性，藥物作用于σ2R/TMEM97靶點(diǎn)具有神經(jīng)保護(hù)作用。

調(diào)節(jié)σ2R/TMEM97 緩解神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制尚不清楚。鑒于σ2R/TMEM97 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，該研究驗(yàn)證假設(shè)σ2R/TMEM97 靶向是否可通過(guò)干擾包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)在內(nèi)的ISR 來(lái)緩解疼痛。ISR 是對(duì)細(xì)胞應(yīng)激源的一種適應(yīng)性反應(yīng)，如錯(cuò)誤折疊蛋白的堆積、脂質(zhì)和氧化應(yīng)激、氨基酸和血紅蛋白匱乏以及病毒感染。與ISR 相關(guān)的一個(gè)典型信號(hào)事件是真核生物啟動(dòng)因子 2α (eIF2α)在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中被磷酸化，這種磷酸化由4種激酶?jìng)鬟f：蛋白激酶 R (PKR)、蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、血紅蛋白調(diào)節(jié)抑制因子(HRI)和蛋白GCN2。eIF2α 的磷酸化會(huì)抑制全局蛋白質(zhì)合成，并促進(jìn)mRNA 的翻譯，例如活化轉(zhuǎn)錄因子 4 (ATF4)。該研究表明，ISR 的誘導(dǎo)與創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷、代謝紊亂和自身免疫性疾病引起的神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)。

另一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是，σ2R/TMEM97 配體的抗神經(jīng)病理性疼痛作用是否特異歸因于它們與 σ2R/TMEM97 的結(jié)合，因?yàn)檫@類化合物在σ1 受體上也能產(chǎn)生巨大活性，并且該受體在動(dòng)物模型中對(duì)抗疼痛具有促進(jìn)作用。該研究使用Tmem97基因敲除 (KO) 小鼠和一種對(duì) σ2R/TMEM97 有更好選擇性的小分子 FEM-1689 來(lái)檢驗(yàn)σ2R/TMEM97 與小鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中的抗痛覺(jué)有因果關(guān)系這一假設(shè)。事實(shí)上，F(xiàn)EM-1689 在SNI 模型中的抗疼痛作用在 TMEM97 敲除小鼠中完全消失。該研究還表明，F(xiàn)EM-1689 在小鼠和人類背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG) 神經(jīng)元中以σ2R/TMEM97 依賴性方式抑制 ISR。該研究提供了以 σ2R/TMEM97 為靶點(diǎn)作為基礎(chǔ)治療神經(jīng)病理性疼痛方法的有力機(jī)制論證。

3.結(jié)果

（1）TMEM97 mRNA 在人和小鼠DRG 中表達(dá)：為了評(píng)估σ2R/TMEM97 是否在人類痛覺(jué)感受器中表達(dá)，該研究使用從器官捐獻(xiàn)者那里獲得的人類DRG進(jìn)行RNAscope 原位雜交。發(fā)現(xiàn)TMEM97在人類所有類型的感覺(jué)神經(jīng)元中均有表達(dá)，包括SCN10A(Nav.8) 陽(yáng)性的痛覺(jué)感受器。約70% 的人DRG 神經(jīng)元表達(dá) SCNI0A 轉(zhuǎn)錄物，這與之前的觀察結(jié)果一致，所有接受評(píng)估的神經(jīng)元均表達(dá)TMEM97mRNA。表達(dá) TMEM97 的神經(jīng)元細(xì)胞大小分布矩陣（平均 = 74 μm） 顯示，TMEM97mRNA 并不局限于一個(gè)亞群。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP7的陽(yáng)性衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)TMEM97。利用既往發(fā)表的人類DRG空間 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)集鑒定并量化了人類 DRG 中表達(dá)TMEM97 的神經(jīng)元亞群。該研究驗(yàn)證了他們的發(fā)現(xiàn)，即TMEM97在人 DRG 的所有神經(jīng)元亞型中均有表達(dá)，尤其是在腦啡肽原(PENK)陽(yáng)性痛覺(jué)感受器和 A6 LTMRs 中表達(dá)量更高。小鼠 DRG 神經(jīng)元和衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Tmem97mRNA，其表達(dá)模式與人 DRG 幾乎相同。此外，之前發(fā)表的小鼠單細(xì)胞 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，Tmem97在所有 DRG 神經(jīng)元亞型中均有表達(dá)，尤其是在非肽能神經(jīng)元、施萬(wàn)細(xì)胞和衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量更高。最近開(kāi)發(fā)的嚙齒動(dòng)物、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類 DRG 的統(tǒng)一數(shù)據(jù)集顯示，TMEM97在所有感覺(jué)神經(jīng)元類型中均有表達(dá)。

（2）鑒定FEM-1689 為強(qiáng)效σ2R/TMEM97 結(jié)合配體：甲苯并唑類藥物和去苯唑類藥物代表了生物活性配體的兩種不同化學(xué)類型，包括 UKH-1114、JVW-1034、SAS-0132 和DKR-1677，它們都能選擇性地結(jié)合σ2R/TMEM97。第一組包括 UKH-1114，它能緩解小鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中的機(jī)械超敏反應(yīng)，并降低亨廷頓病模型中神經(jīng)元的毒性?；赨KH-1114 在神經(jīng)病理性疼痛模型中的積極治療效果，該研究對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了修改，以找到具有更好結(jié)合特性和理化性質(zhì)的親脂性更低的類似物，合成了比 UKH-1114 少一個(gè)亞甲基的 FEM-1689，發(fā)現(xiàn)它是一種具有高選擇性和更好理化性質(zhì)的化合物。除了σ1R（10 倍）和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體（NET；24 倍）外，F(xiàn)EM-1689 對(duì)σ2R/TMEM97 的選擇性比40 種中樞神經(jīng)系統(tǒng)蛋白高 100 倍以上。

（3）FEM-1689 對(duì)雄性和雌性小鼠的抗痛覺(jué)效應(yīng)需要完整的Tmem97基因：一個(gè)尚未解決的重要問(wèn)題是σ2R/TMEM97 配體是否會(huì)特異地降低疼痛超敏性通過(guò)作用于σ2R/TMEM97。為了解決這個(gè)問(wèn)題，該研究使用了一種TMEM97 全基因敲除小鼠。雄性和雌性 TMEM97 敲除小鼠與野生型小鼠具有相似的爪機(jī)械敏感性 (vonFrey) 、爪熱敏感性（熱輻射實(shí)驗(yàn)）和爪冷敏感性（丙酮）反應(yīng)，這表明 TMEM97 的缺失并沒(méi)有改變它們的基線感覺(jué)。 TMEM97 全身敲除小鼠在 SNI 之后是否會(huì)發(fā)展出增強(qiáng)或減弱的機(jī)械性神經(jīng)病理性疼痛表型，在神經(jīng)損傷后第 7、10和14 天進(jìn)行敏反應(yīng)。在神經(jīng)損傷后 30 天進(jìn)行測(cè)試時(shí)，小鼠仍對(duì)機(jī)械過(guò)敏。對(duì)雌雄野生型和 TMEM97全身敲除小鼠進(jìn)行單次靜脈注射 FEM-1689 處理，劑量為 10 mg/kg（該劑量根據(jù)既往對(duì)結(jié)構(gòu)相似的σ2R/TMEM97 配體UKH-1114 的研究確定）。連續(xù)7 天每日評(píng)估TMEM97 全身敲除和野生型小鼠誘發(fā)的機(jī)械閾值，發(fā)現(xiàn)兩組的機(jī)械敏感性幾乎沒(méi)有變化。在用 20 mg/kg 的高劑量 FEM-1689 對(duì)小鼠進(jìn)行第2次治療之前，先讓小鼠恢復(fù)2 周。研究發(fā)現(xiàn)，這種較高劑量的FEM-1689 一次給藥可有效逆轉(zhuǎn)雄性和雌性野生型小鼠的機(jī)械超敏反應(yīng)，持續(xù)時(shí)間約為 4天。值得注意的是，F(xiàn)EM-1689 未能降低 TMEM97全身敲除小鼠的機(jī)械超敏反應(yīng)，這表明FEM-1689的作用依賴于σ2R/TMEM97。該研究也對(duì)雄性和雌性小鼠的 FEM-1689 作用大小進(jìn)行了量化測(cè)量。

（4）FEM-1689 抑制ISR 并促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)，依賴于σ2R/TMEM97：該研究旨在闡明 FEM-1689通過(guò)與σ2R/TMEM97 結(jié)合而作用于感覺(jué)神經(jīng)元的機(jī)制。既往研究表明，σ2R/TMEM97 與膽固醇合成和運(yùn)輸、加工之間存在聯(lián)系，而膽固醇合成和運(yùn)輸過(guò)程受到 5'單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)及其底物乙酰輔酶A 羧化酶的嚴(yán)格調(diào)控。該研究用不同濃度 (10、100、1000 nM) FEM-1689 處理培養(yǎng)的小鼠DRG 神經(jīng)元，與目標(biāo)結(jié)合(K = 17 + 8 nM)一致，處理時(shí)間為16 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p-ACC 水平?jīng)]有變化，而已知的AMPK 激活劑 A769662 (100 μM) 卻能提高野生型和TMEM97 全身敲除神經(jīng)元的 p-ACC水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)EM-1689 并不影響AMPK-p-ACC通路，因此一定還存在另外一種抗鎮(zhèn)覺(jué)通路。

隨后，檢驗(yàn)了FEM-1689 是否會(huì)抑制在DRG神經(jīng)元中的ISR 這一假說(shuō)。多種證據(jù)支持這一假說(shuō)：①σ2R/TMEM97 和 ISR 轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，如蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶 (PERK) ，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上；②最近一份關(guān)于20(S)-羥基膽固醇對(duì)σ2R/TMEM97 影響的報(bào)告涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體網(wǎng)絡(luò)；③ISR 參與 DRG神經(jīng)元的創(chuàng)傷誘導(dǎo)和糖尿病神經(jīng)病理性疼痛。因此，培養(yǎng)了野生型和TMEM97 全身敲除小鼠DRG 神經(jīng)元，用FEM-1689 處理 16 h，并用免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)方法測(cè)量 p-eIIF2α 水平的變化。ICC測(cè)量顯示，TMEM97 全身敲除神經(jīng)元中p-eIF2α 的基礎(chǔ)水平遠(yuǎn)低于野生型神經(jīng)元。用ISR 抑制劑 ISRIB (200 nM)處理野生型神經(jīng)元后，p-eIF2α 水平的降低程度與載體和ISRIB 處理的TMEM97 全身敲除神經(jīng)元中 p-eIF2α水平的降低程度相同。與藥物處理的細(xì)胞相比，F(xiàn)EM-1689 降低了野生型小鼠DRG 神經(jīng)元的 p-eIF2α水平，但沒(méi)有降低TMEM97 全身敲除小鼠DRG 神經(jīng)元的 p-eIF2α 水平。該研究發(fā)現(xiàn) FEM-1689 在100 nM時(shí)最大程度地抑制了 ISR，抑制程度與ISRIB 200 nM相同。該研究計(jì)算出 FEM-1689 在野生型小鼠DRG神經(jīng)元中的 p-eIF2αIC50為30 nM，這與FEM-1689 與TMEM97 的結(jié)合親和力非常相似。

該研究進(jìn)一步表征了FEM-1689 降低p-eIF2α水平的時(shí)間動(dòng)態(tài)，通過(guò)在0.5、1、3、6、12 和16 h，用100 nM FEM-1689 處理野生型小鼠DRG 神經(jīng)并量化p-eIF2α 的免疫反應(yīng)，由此進(jìn)一步確定了FEM-1689 降低p-eIF2α 水平的時(shí)間動(dòng)態(tài)。 通過(guò)這種方法，計(jì)算出了FEM-1689 在體外降低p-eIF2α 水平的半衰期為 5 h。用 FEM-1689 處理小鼠 DRG 神經(jīng)元16 h 后，ISR 的抑制作用達(dá)到最大。這一延長(zhǎng)的時(shí)間與 FEM-1689 延遲和延長(zhǎng)的抗痛覺(jué)效應(yīng)一致。FEM-1689 沒(méi)有降低野生型或 TMEM97 全身敲除小鼠神經(jīng)元中 BiP（一種對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和ISR 啟動(dòng)很重要的伴侶）的水平。對(duì)培養(yǎng)的小鼠DRG 神經(jīng)元進(jìn)行的Sholl 分析表明，F(xiàn)EM-1689 能促進(jìn)野生型神經(jīng)元的神經(jīng)元突起，但不能促進(jìn)TMEM97 全身敲除神經(jīng)元的神經(jīng)元突起。值得注意的是，經(jīng)藥物處理的TMEM97 全身敲除神經(jīng)元的神經(jīng)元突起比經(jīng)藥物處理的野生型神經(jīng)元更明顯—這可能是由于TMEM97 全身敲除細(xì)胞的ISR 減少，從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)的合成。這些數(shù)據(jù)表明，σ2R/TMEM97 是FEM1689 減少I(mǎi)SR 和促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)所必需的。

（5）去甲苯并嗎啡σ2R/TMEM97配體SAS- 0132和DKR-1677 可增強(qiáng)ISR：該研究探討的下一個(gè)問(wèn)題是，與σ2R/TMEM97 結(jié)合的其他化合物是否會(huì)抑制ISR，以及ISR 抑制是否是σ2R/TMEM97 調(diào)節(jié)劑所特有促進(jìn)抗痛覺(jué)的作用。σ2R/TMEM97 調(diào)節(jié)劑不同的生物學(xué)結(jié)果可能源于單個(gè)配體與蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合、相互作用方式的差異。同源的哌嗪取代的去甲苯并嗎啡SAS-0132 和DKR1677 代表了一種在結(jié)構(gòu)上不同于芳基取代的去甲苯并嗎啡 FEM-1689 的化學(xué)類型。對(duì) SAS-0132 和 FEM-1689 進(jìn)行計(jì)算對(duì)接研究，結(jié)果表明這兩種調(diào)節(jié)劑與 σ2R/TMEM97 擴(kuò)展結(jié)合位點(diǎn)的相互作用不同。SAS-0132 具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其本身沒(méi)有抗痛覺(jué)作用，之前的研究表明它能抑制 UKH-1114 的抗痛覺(jué)作用，而 UKH-1114是 FEM-1689 的同源物。這一觀察結(jié)果與單個(gè)σ2R/TMEM97 調(diào)節(jié)劑可能發(fā)揮不同的、有時(shí)是相反的生物效應(yīng)的假設(shè)是一致的。事實(shí)上，在用 10、30、100 和300 nM 的 SAS-0132 或DKR1677 處理野生型小鼠 DRG 神經(jīng)元16 h 后，發(fā)現(xiàn)這兩種化合物都能促進(jìn) eIF2α 的磷酸化，與FEM-1689 的抑制作用形成鮮明對(duì)比。這些數(shù)據(jù)表明，σ2R/TMEM97 結(jié)合化合物的不同化學(xué)類型對(duì)ISR 有不同的影響，可能是通過(guò)它們與σ2R/TMEM97 的相互作用方式介導(dǎo)的。

（6）FEM-1689 可抑制 HEK293T 細(xì)胞中的ISR：人類胚胎腎臟(HEK) 293 T 細(xì)胞表達(dá)σ2R/TMEM97（人類蛋白圖譜），因此該研究者質(zhì)疑FEM-1689是否會(huì)抑制該細(xì)胞系的 ISR。使用 ICC 和分光光度法發(fā)現(xiàn)，在FEM1689 處理 2 h 或 16 h 后，p-eIF2α 免疫活性會(huì)出現(xiàn)濃度依賴性降低。測(cè)試了 FEM-1689在從0.1 nM 至1000 nM 9 種濃度下的作用，在HEK 細(xì)胞中測(cè)得FEM-1689 在 2 h 和 16 h 處理?xiàng)l件下的 p-eIF2αIC50，分別為 5.9 nM 和 0.7 nM。發(fā)現(xiàn)2 h的 FEM-1689 培養(yǎng)期產(chǎn)生了一條具有S 型函數(shù)特征的曲線。采用Western 印跡法檢測(cè)了 FEM-1689 處理對(duì)更多 ISR 相關(guān)蛋白的影響。用 FEM-1689 處理HEK293T 細(xì)胞16 h 后，在BiP 表達(dá)保持穩(wěn)定的情況下，eIF2α、eIF2A 和 p-PERK 的磷酸化呈濃度依賴性減少。表明FEM-1689 影響了 HEK293T細(xì)胞中ISR 的PERK-eIF2α 臂，HEK293T 細(xì)胞可作為用于開(kāi)發(fā)針對(duì)σ2R/TMEM97 的疼痛治療藥物篩選平臺(tái)。

（7）FEM-1689 逆轉(zhuǎn)甲基乙二醛誘導(dǎo)的機(jī)械超敏反應(yīng)：甲基乙二醛(MGO)是糖酵解的代謝副產(chǎn)物，與糖尿病神經(jīng)病理性疼痛和其他疼痛性神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。該研究試圖確定FEM1689 降低p-eIF2α 水平的作用是否能減輕MGO 引起的ISR依賴性機(jī)械超敏反應(yīng)。給野生型小鼠足底注射1次MGO (20 ng) ，使其產(chǎn)生持續(xù)6 天的機(jī)械超敏反應(yīng)。一組小鼠在注射MGO 24 h 后接受FEM-1689（20 mg/kg，靜脈注射）或ISRIB（2.5 mg/kg，腹腔注射）治療。在實(shí)驗(yàn)的剩余時(shí)間內(nèi)，F(xiàn)EM-1689完全逆轉(zhuǎn)了MGO 誘導(dǎo)的機(jī)械過(guò)敏性，而ISRIB 的作用則是短暫的。數(shù)據(jù)顯示FEM-1689 可完全逆轉(zhuǎn)MGO 引起的ISR 依賴性痛覺(jué)過(guò)敏。這證明了開(kāi)發(fā)用于糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的 σ2R/TMEM97 調(diào)節(jié)劑的實(shí)用性。

（8）FEM-1689 在人類感覺(jué)神經(jīng)元中降低p-eIF2α并逆轉(zhuǎn)MGO 誘導(dǎo)的ISR 活性：為了將對(duì)嚙齒類動(dòng)物DRG 的研究結(jié)果推廣到人類，該研究用FEM-1689 對(duì)器官捐獻(xiàn)者培養(yǎng)的人DRG 神經(jīng)元進(jìn)行了 16 h 的處理。與小鼠的數(shù)據(jù)一致，發(fā)現(xiàn)FEM-1689 在濃度為 10 nM 和 100 nM 時(shí)能顯著降低人類神經(jīng)元中 p-eIF2α 的水平。然后評(píng)估了FEM-1689 是否能逆轉(zhuǎn)人 DRG 神經(jīng)元中病理 ISR的激活。為了在體外誘導(dǎo) ISR，用 1 μM 的MGO處理人神經(jīng)元，這一濃度存在于糖尿病神經(jīng)病理性疼痛病人的血漿中。MGO 處理會(huì)增加人DRG 神經(jīng)元中peIF2α 的水平，而 FEM-1689 (100 nM)的協(xié)同處理會(huì)阻止這種增加。這些發(fā)現(xiàn)表明與造成神經(jīng)病理性疼痛刺激有關(guān)的ISR 激活可以被σ2R/TMEM97調(diào)節(jié)劑阻斷。

4.討論

該研究表明，σ2R/TMEM97 配體對(duì)小鼠的抗痛覺(jué)作用需要σ2R/TMEM97 的直接調(diào)節(jié)，而不是σ1R或任何其他蛋白或受體。調(diào)節(jié)σ2R/TMEM97 可抑制小鼠和人類 DRG 神經(jīng)元的ISR。由于ISR 的減少與疼痛緩解有關(guān)，F(xiàn)EM-1689 以及σ2R/TMEM97 抗痛覺(jué)作用的細(xì)胞機(jī)理可能與ISR 的減少有關(guān)。最后，發(fā)現(xiàn)人類痛覺(jué)感受器表達(dá)TMEM97基因，而在培養(yǎng)的人DRG 神經(jīng)元中，F(xiàn)EM-1689 可減少eIF2α 磷酸化，而且使用FEM-1689 可預(yù)先抑制人神經(jīng)元中MGO 誘導(dǎo)ISR。這些結(jié)果表明，在疼痛病人中靶向σ2R/TMEM97 可以通過(guò)抑制 ISR 來(lái)降低機(jī)械超敏反應(yīng)，在小鼠中也觀察到了類似的機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)可將σ2R/TMEM97 作為開(kāi)發(fā)有效治療神經(jīng)病理性疼痛的真正靶點(diǎn)。

σ2R/TMEM97 調(diào)節(jié)劑在小鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中的作用時(shí)間過(guò)程不同于其他許多起效迅速的抗痛覺(jué)化合物。在本研究之前，有兩個(gè)不同的研究小組使用不同類別的 σ2R/TMEM97 配體在小鼠 SNI 模型中獨(dú)立觀察到了這種緩慢起效的抗痛覺(jué)效應(yīng)。該研究證明了這種效應(yīng)是由σ2R/TMEM97特異介導(dǎo)的，因?yàn)樾坌院痛菩?TMEM97 全身敲除小鼠完全喪失了抗痛覺(jué)活性。這些觀察結(jié)果表明，σ2R/TMEM97 的信號(hào)傳遞動(dòng)力學(xué)可能是延遲反應(yīng)的主要根本原因。ISR 通過(guò)影響激活轉(zhuǎn)錄因子4 (ATF4)和C/EBP 同源蛋白(CHOP)等關(guān)鍵損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的翻譯來(lái)控制基因表達(dá)的持久變化。ISR 介導(dǎo)的變化涉及多種轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾，啟動(dòng)和進(jìn)展都需要時(shí)間。與配體和 σ2R/TMEM97 結(jié)合的藥代動(dòng)力學(xué)相比，F(xiàn)EM-1689 的起效時(shí)間要晚一些，可能就是這個(gè)時(shí)間過(guò)程造成的。Σ2R/TMEM97 調(diào)節(jié)下游的分子信號(hào)傳導(dǎo)途徑還需要進(jìn)一步研究。

其他有關(guān) ISR 抑制劑的研究與該研究對(duì)FEM-1689 的研究結(jié)果之間存在一個(gè)重要的差異。該研究注意到 ISR 抑制劑 ISRIB 和 4-PBA 在體內(nèi)緩解機(jī)械過(guò)敏反應(yīng)的療效持續(xù)時(shí)間（小時(shí)）相對(duì)短于FEM-1689（天）。ISRIB 和 FEM-1689 在藥效持續(xù)時(shí)間上的差異可能是由于它們?cè)?ISR 通路上游的作用機(jī)制以及每種化合物的藥代動(dòng)力學(xué)上的差異造成的。ISRIB 與eIF2B 異源結(jié)合并促進(jìn)其催化活性，eIF2B 是鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子，是回收非磷酸化 eIF2 復(fù)合物所必需的。在ISR 激活時(shí)間長(zhǎng)、范圍廣的情況下，ISRIB 的作用會(huì)被削弱。FEM-1689不可能與ISRIB 具有相同的ISR 抑制機(jī)制。因此，這些結(jié)果表明，F(xiàn)EM-1689 可能提供了一種獨(dú)特的、比既往觀察到的ISRIB 更長(zhǎng)期調(diào)節(jié) ISR 的方法。

在研究與σ2R/TMEM97 結(jié)合的化合物的過(guò)程中，該研究發(fā)現(xiàn)了幾種在多種動(dòng)物模型中表現(xiàn)出有益效果的化學(xué)類型。其中一組包括了芳基取代的甲烷苯并氮雜環(huán)丁烷（如UKH-1114 和 W-1034）。UKH-1114 可減輕神經(jīng)損傷后的機(jī)械超敏反應(yīng)，并可降低亨廷頓病模型中突變亨廷頓蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性。甲苯并唑嗪 JVW-1034 不僅能減少兩種嚙齒類動(dòng)物酒精依賴模型中的戒斷行為，還能緩解小鼠因長(zhǎng)期接觸酒精而導(dǎo)致的疼痛敏感性升高。UKH-1114 的近似物 FEM-1689 也能減輕神經(jīng)損傷后的機(jī)械超敏反應(yīng)以及對(duì) MGO 治療的反應(yīng)。另一類σ2R/TMEM97 調(diào)節(jié)劑包括哌嗪取代的苯并嗎啡類化合物（如SAS-0132 和 DKR-1677）。值得注意的是，SAS-0132 還能阻斷 UKH-1114 的抗痛覺(jué)活性，這表明不同的σ2R/TMEM97 結(jié)合化合物可能對(duì)痛覺(jué)有不同的影響。DKR-1677 是SAS-0132 的同源物，在兩種不同的創(chuàng)傷性腦損傷模型中具有保護(hù)作用。它能減少軸突變性，并在創(chuàng)傷性腦損傷的爆炸損傷模型中提供劑量依賴性的認(rèn)知能力增強(qiáng)，同時(shí)還能在控制性皮層撞擊模型中保護(hù)少突膠質(zhì)細(xì)胞和皮質(zhì)神經(jīng)元。DKR-1677 還能保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受缺血/再灌注損傷。該研究證明了SAS-0132 和DKR1677 增加小鼠 DRG 神經(jīng)元中p-eIF2α 的表達(dá)，而FEM-1689 則降低了p-eIF2α 的表達(dá)，表明這些化合物對(duì) ISR 有不同的影響。這些研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)針對(duì)σ2R/TMEM97 有效疼痛治療藥物的藥物篩選框架奠定了基礎(chǔ)。

要了解σ2R/TMEM97 調(diào)節(jié)劑如何影響ISR 還需要進(jìn)一步研究，文獻(xiàn)中已有各種直接和間接影響ISR 的線索。首先，σ2R/TMEM97 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜可能會(huì)通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將其與ISR 聯(lián)系起來(lái)，特別是通過(guò)影響激酶PERK 對(duì)eIF2α 的磷酸化。事實(shí)上，在 FEM-1689 處理 HEK 細(xì)胞后，P-PERK 在 p-eIF2α和 eIF2A 最大程度降低的濃度下減少，這表明σ2R/TMEM97 與PERK 途徑之可能存在聯(lián)系。其次，σ2R/TMEM97 很可能參與了生物活性脂質(zhì)（如羥基膽固醇）在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)，也許是通過(guò)像尼曼病C1(NPC1)蛋白那樣的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。過(guò)多的脂質(zhì)攝入和增加脂質(zhì)合成的需求會(huì)促進(jìn)ER 的脂質(zhì)應(yīng)激，已知這種應(yīng)激會(huì)激活I(lǐng)SR 的PERK-eIF2α 分支并損害線粒體功能。最后，σ2R/TMEM97 通過(guò)影響貯存操作的鈣離子進(jìn)入調(diào)節(jié)細(xì)胞 Ca2+動(dòng)態(tài)。ER 是細(xì)胞中最大的 Ca2+儲(chǔ)存庫(kù)，對(duì)引起ER 應(yīng)激和 ISR 誘導(dǎo)的 Ca2+水平波動(dòng)非常敏感。目前還不清楚 FEM-1689 的抗痛覺(jué)作用是否需要一種或多種與抑制 ISR 有關(guān)的機(jī)制。然而，這種與 ISR 抑制的聯(lián)系有助于進(jìn)一步探索σ2R/TMEM97 調(diào)節(jié)劑在 DRG 神經(jīng)元中的下游機(jī)制作用。

神經(jīng)元生長(zhǎng)能力可用于評(píng)估藥物的神經(jīng)調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生作用。該研究結(jié)果表明，F(xiàn)EM-1689可通過(guò) Sholl 分析測(cè)量，以 σ2R/TMEM97 依賴性方式促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和復(fù)雜性。與未接受任何藥物治療的野生型神經(jīng)元相比，缺乏σ2R/TMEM97 的神經(jīng)元也顯示出更強(qiáng)的神經(jīng)元生長(zhǎng)能力。這是因?yàn)镮SR 水平降低，TMEM97 全身敲除神經(jīng)元的蛋白質(zhì)合成在基礎(chǔ)水平上未受抑制。軸突生長(zhǎng)是一個(gè)需要蛋白質(zhì)合成的過(guò)程，因此在這些條件下抑制 ISR 與蛋白質(zhì)合成的增強(qiáng)效應(yīng)是一致的。鑒于發(fā)現(xiàn)的對(duì)軸突生長(zhǎng)的影響，評(píng)估σ2R/TMEM97 配體是否能在體內(nèi)產(chǎn)生這種效應(yīng)，以及是否能導(dǎo)致神經(jīng)感受器對(duì)皮膚的適當(dāng)再神經(jīng)支配，避免與神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)的觸覺(jué)小體的異常靶向，將是非常重要的。

該研究結(jié)果解釋了有關(guān)用小分子調(diào)節(jié)σ2R/TMEM97 可產(chǎn)生抗痛覺(jué)效應(yīng)的機(jī)理起源的解讀。但仍有一些問(wèn)題尚未解決。首先，必須確定ISR 激活與FEM-1689 體內(nèi)抗痛覺(jué)作用之間的明確聯(lián)系。一種方法是評(píng)估Eif2s1-KO 小鼠的神經(jīng)病理性疼痛。這種實(shí)驗(yàn)較復(fù)雜，因?yàn)镋if21編碼的 eIF2α 缺失或通過(guò)點(diǎn)突變完全阻止eIF2α 磷酸化是致死的。此外，尚未發(fā)現(xiàn)eIF2α 的特異性拮抗劑。目前廣泛使用的抑制 ISR 化合物有化學(xué)物質(zhì)、ISR 激酶抑制劑和 eF2B 穩(wěn)定劑（如ISRIB），它們非特異性作用于 eIF2α，因此不是解決這一問(wèn)題的最佳工具。其次，目前還不清楚為什么TMEM97 全身敲除神經(jīng)元在基線時(shí)的 p-eIF2α 比WT 神經(jīng)元少。這就出現(xiàn)了一個(gè)悖論：σ2R/TMEM97（即TMEM97 全身敲除）的永久“拮抗”和 FEM-1689 對(duì)σ2R/TMEM97 的調(diào)節(jié)都會(huì)導(dǎo)致 p-eIF2α 水平的降低。此外，σ2R/TMEM97結(jié)合化合物的信號(hào)作用可能取決于所測(cè)量的途徑。第三， FEM-1689 可能具有某些多藥理作用，因?yàn)樗苊黠@結(jié)合σ1 受體(Ki = 167±54 nM)和NET(Ki = 405±227 nM) ，盡管其效力分別比σ2R/TMEM97低10 倍和24 倍(Ki = 17±8 nM)。由于FEM-1689對(duì)TMEM97 全身敲除小鼠的抗神經(jīng)中樞興奮作用被完全抑制，該研究得出結(jié)論，F(xiàn)EM-1689 在體內(nèi)的作用是由σ2R/TMEM97 而非σ1 受體、NET 或其他受體介導(dǎo)的。此外，σ1 受體拮抗劑和 NET 抑制劑可分別在急性期（數(shù)小時(shí)）或亞急性期（數(shù)天至數(shù)周）內(nèi)減輕痛覺(jué)過(guò)敏反應(yīng)，這兩者都不符合對(duì)FEM-1689 的觀察結(jié)果。然而現(xiàn)階段還不能排除多藥理學(xué)的可能性。第四，必須確定 FEM-1689 的活性是外周還是中樞部位的作用。雖然他們的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示該化合物很容易進(jìn)入大腦，但研究結(jié)果也顯示FEM-1689 在體外抑制了小鼠和人類DRG 的ISR。未來(lái)的實(shí)驗(yàn)將使用一種正在開(kāi)發(fā)的痛覺(jué)感受器特異性TMEM97 敲除小鼠來(lái)解決這一重要問(wèn)題。