連曉文 曾維銓 陳廷輝 莊雅馨 郭澤興 劉 晶 黃丙勇

膝骨性關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一種漸進性的退行性疾病,隨著疾病進展常常累及軟骨、軟骨下骨及周圍滑膜的病變[1],臨床主要表現(xiàn)包括膝關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動不利,甚者出現(xiàn)活動功能障礙。最新流行病學研究結(jié)果顯示,預計到2050年,全球的KOA人數(shù)將比2020年增加74.9%[2]。因此,積極探尋能夠改善膝關(guān)節(jié)功能、延緩疾病進展且作用機制明確的干預手段具有重要意義。中醫(yī)提出“膝者,筋之府”“筋骨同源”的經(jīng)筋理論,“從筋施治”,松解膝關(guān)節(jié)“筋”與“骨”結(jié)合部的“筋結(jié)”可作為治療KOA的切入點[3]。針刀治療可以通過松解膝關(guān)節(jié)周圍的高張力點,進而緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)功能[4],近年來被多個臨床指南推薦[5,6]。筆者團隊前期研究應用針刀髕周松解法治療早期膝骨性關(guān)節(jié)炎取得了較好療效[7]。本研究通過觀察針刀髕周松解法對KOA兔膝關(guān)節(jié)行為學、軟骨形態(tài)學及軟骨細胞凋亡率的影響,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6個月齡健康雄性新西蘭兔18只,體質(zhì)量2.0～2.25 kg,由杭州富陽紅鳳養(yǎng)兔場提供[生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2020-0004)],委托福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心[動物實驗設(shè)施許可證號:SYXK(閩)2020-0003]訂購、喂養(yǎng)。實驗室自然光照,保持溫度22～25 ℃、濕度35%～65%。單籠喂養(yǎng)、自由進水、攝食。此實驗已通過福建中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準(批件文號:FJTCMIACUC2022202)并全程遵照《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》進行。

1.2 實驗試劑HE染色試劑盒、番紅O固綠染色試劑盒、TUNEL細胞凋亡試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)、10%EDTA(天津聚恒達化工有限公司)、4%多聚甲醛(北京蘭捷科技有限公司)、0.9% NaCl 注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)、3%戊巴比妥鈉。

1.3 實驗儀器一次性0.4 mm×40 mm 無菌針刀(馬鞍山邦德醫(yī)療器械有限公司);高分子石膏(河北邦恩斯醫(yī)療器械有限公司);手術(shù)刀片及相關(guān)器械(蘇州市開元醫(yī)療器械有限公司);一次性包埋模具(海門市寧創(chuàng)實驗器材有限公司);脫水機、包埋機(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);石蠟切片機(LEICA);正置光學顯微鏡(MSHOT)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組與造模適應性喂養(yǎng)1周后,采用隨機數(shù)字表法將實驗兔分為空白組、模型組和針刀組,每組6只。模型組和針刀組均使用改良的Videman法造模[8],使實驗兔的左后肢保持伸膝 0°位,并在其髕骨前方放置石膏托,然后用高分子石膏單層纏繞左后肢,將踝關(guān)節(jié)固定至背屈 60°位,最后在最外層纏繞防咬繃帶。實驗兔連續(xù)固定6周,拆除石膏后,應用Lequesne MG法進行評價,以總分≥4分作為造模成功的標準[9]?？瞻捉M常規(guī)飼養(yǎng)6周,無干預。造模實驗期間各組兔飲水、進食量基本一致,體質(zhì)量無明顯差異,精神良好,無死亡。

1.4.2 干預方法造模成功后對針刀組實驗兔進行針刀干預,參考《中國經(jīng)筋學》[10]選取股內(nèi)側(cè)肌、股外側(cè)肌、髕內(nèi)側(cè)支持帶、髕外側(cè)支持帶、髕韌帶在髕骨上的附著點以及鵝足腱脛骨內(nèi)髁附著點。常規(guī)消毒后,使用一次性無菌針刀于治療點進行針刀松解治療,結(jié)束后無菌棉球按壓。每隔7 d干預1次,共4次。其余2組常規(guī)飼養(yǎng)4周,無干預。

1.4.3 取材干預結(jié)束后1周,使用3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉,耳緣靜脈空氣栓塞處死。將兔放于冰上,迅速解剖左膝關(guān)節(jié),觀察并記錄軟骨、滑膜表面的大體變化。隨后切取股骨髁軟骨組織投入4%多聚甲醛中固定。

1.5 觀察指標及檢測方法①行為學觀察:干預結(jié)束后1周對3組實驗兔進行Lequesne MG行為學評分[11],包括局部疼痛反應、步態(tài)改變、患肢關(guān)節(jié)活動度和腫脹情況4個維度評價?？偡譃?～11分,得分越高,表明關(guān)節(jié)功能障礙程度越重。②蘇木精-伊紅(HE)染色:股骨髁軟骨組織經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后行脫鈣處理。再進行脫水、石蠟包埋并制備切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水。蘇木精染色,流水沖洗;1%鹽酸乙醇分色,流水沖洗;PBS返藍,流水沖洗;伊紅染色,封片,鏡下觀察。③番紅O固綠染色:切片經(jīng)脫蠟至水后,用鐵蘇木素染色液3～5 min;再以1%鹽酸酒精分化;而后加入固綠染色液5 min,經(jīng)1%乙酸酸化后,再加入番紅染色液5 min。最后脫水透明,封片,鏡下觀察。④ TUNEL染色觀察:取各組實驗兔石蠟組織標本切片,脫蠟、脫水后,應用蛋白酶K、TdT酶、Streptavidin-HRP反應,DAB顯色;蘇木素復染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,封片。鏡下觀察,棕黃色細胞為陽性。在軟骨層隨機選取5個視野,采用FIJI細胞計數(shù)并計算凋亡率,計算公式:凋亡率=陽性細胞數(shù)/軟骨細胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 Lequesne評分與空白組相比,模型組左膝關(guān)節(jié)Lequesne評分顯著升高(P<0.05);與模型組相比,針刀組左膝關(guān)節(jié)Lequesne評分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組實驗兔左膝關(guān)節(jié)Lequesne評分比較 (分,

2.2 關(guān)節(jié)軟骨 滑膜與空白組相比,模型組關(guān)節(jié)面較粗糙,部分不完整,軟骨面無光澤,髕前滑膜增厚,色澤發(fā)黃;與模型組相比,針刀組關(guān)節(jié)面較為光滑、軟骨面光澤感增加,病變情況得以改善。

2.3 HE染色空白組軟骨面平滑,厚度正常,軟骨細胞結(jié)構(gòu)正常、排列有序;模型組軟骨面不平整,存在部分缺損,軟骨厚度變薄,軟骨細胞數(shù)量減少,排列松散,可見空泡細胞;針刀組軟骨面比模型組平滑、厚度增加,細胞數(shù)量增加,排列較為有序。見圖1。

注:①軟骨面平滑;②正常軟骨細胞;③潮線;④軟骨面存在缺損;⑤空泡細胞;⑥軟骨面恢復平滑。圖1 軟骨組織HE染色圖

2.4 番紅O固綠染色空白組軟骨面平整,軟骨和軟骨下骨厚度正常,軟骨細胞排列規(guī)整;模型組軟骨面存在缺損,軟骨層厚度變薄,軟骨下骨增厚,軟骨細胞數(shù)量減少,排列紊亂;針刀組軟骨面比模型組平整、軟骨厚度增加、軟骨細胞數(shù)量增多、排列較為整齊。見圖2。

注:①軟骨面平整;②潮線;③軟骨面缺損;④軟骨面恢復平整。圖2 軟骨組織番紅O固綠染色圖

2.5 TUNEL染色與空白組相比,模型組可見較多的軟骨細胞凋亡(P<0.05);與模型組相比,針刀組的軟骨細胞凋亡數(shù)量明顯減少(P<0.05)。見圖3,表2。

注:箭頭所示為凋亡的軟骨細胞。圖3 軟骨組織TUNEL染色圖

表2 3組實驗兔軟骨細胞凋亡率比較 (只,

3 討論

2021—2030年是全球進入健康老齡化的10年,骨關(guān)節(jié)炎往往與其他慢性疾病共存于老年患者身上,影響其生活質(zhì)量和整體功能。與其他類型的關(guān)節(jié)炎相比,KOA的患病率更高,世界衛(wèi)生組織指出這10年需要重點關(guān)注解決骨關(guān)節(jié)炎等嚴重影響患者生活質(zhì)量和活動功能的疾病[12]。因此,尋找高效易行的治療KOA方法十分重要。

針刀療法是通過針刀縱疏、橫撥KOA病變的軟組織,減輕局部異常高張力,進而調(diào)整膝關(guān)節(jié)的應力分布,改善局部組織代謝,從而達到緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)活動的效果[4]。近年來,隨著針刀療法在臨床上的不斷應用和驗證,已被多個臨床指南推薦用于KOA治療[5,6]。

KOA屬于中醫(yī)“痹證”范疇,“筋傷”和“骨病”是其重要病機,兩者相互影響,互為因果,在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。“筋”強方可束“骨”,“骨”堅而“筋”有所附,兩者相互依存。KOA是隨著年齡增加而逐漸進展的疾病,KOA早期、中期往往以“筋傷”表現(xiàn)為主,“筋”損傷之后多表現(xiàn)為局部疼痛、軟組織長度短縮、雙側(cè)軟組織牽拉力不同。在站立和行走的過程中,骨與骨之間的壓力不均,關(guān)節(jié)面出現(xiàn)應力集中,促使“骨病”發(fā)生發(fā)展。“筋傷”和“骨病”兩者在疾病進展方面互相促進,后期逐漸發(fā)展到“筋骨同病”的狀態(tài),出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)周圍大量骨贅形成、軟組織短縮、關(guān)節(jié)畸形的嚴重表現(xiàn)[13]。經(jīng)筋理論指導下的針刀療法,是醫(yī)者根據(jù)膝關(guān)節(jié)周圍的經(jīng)筋循行路徑,通過拇指尋按查找筋結(jié)點,對其進行松解,近年來在KOA的臨床治療中廣泛應用。研究表明,在各種經(jīng)筋針刺療法中,針刀療法在治療KOA中具有較佳優(yōu)勢[14]。

本研究運用了改良Videman法建立了KOA兔模型,造模過程模擬了KOA的自然發(fā)病過程,避免了創(chuàng)傷造模方式帶來的炎性物質(zhì)釋放,可以較好地模擬臨床上針刀療法對KOA的治療效應。股四頭肌作為下肢最強壯的肌肉,“一體四頭”形成伸膝裝置,其結(jié)構(gòu)功能與KOA的發(fā)病具有密不可分的聯(lián)系[15]。髕周軟組織作為股四頭肌肌腱的延伸部分,其軟組織的張力變化會同步影響髕股關(guān)節(jié)和脛股關(guān)節(jié)的應力分布,影響KOA的發(fā)生發(fā)展。因此,本研究基于經(jīng)筋理論、依據(jù)《中國經(jīng)筋學》[10]中的治療位點和KOA筋結(jié)點的觸診規(guī)律,結(jié)合筆者團隊前期臨床研究結(jié)果,圍繞髕骨周圍軟組織選取了股內(nèi)、外側(cè)肌,髕內(nèi)、外側(cè)支持帶,髕韌帶在髕骨上的附著點以及鵝足腱脛骨內(nèi)髁附著點,作為本次針刀治療松解點開展治療,研究針刀療法的作用機制[16]。軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨中的惟一細胞類型,在生理條件下,它保持著增殖與凋亡的動態(tài)平衡,從而維持著關(guān)節(jié)軟骨的正常生理狀態(tài)。當KOA發(fā)生時,異常機械應力刺激打破了動態(tài)平衡,促使軟骨細胞過度凋亡,進而出現(xiàn)軟骨退化。近年來有學者發(fā)現(xiàn),KOA軟骨細胞凋亡率明顯高于正常軟骨細胞,軟骨細胞凋亡數(shù)量與軟骨退化程度、KOA嚴重程度呈正相關(guān)[17]。本實驗結(jié)果表明,與空白組相比,模型組左膝關(guān)節(jié)Lequesne評分顯著升高,軟骨面無光澤,關(guān)節(jié)面較粗糙,軟骨表層不平整,厚度變薄,軟骨細胞數(shù)量減少,軟骨細胞凋亡率明顯提高。針刀組與模型組相比,Lequesne評分顯著降低,軟骨厚度增加,軟骨細胞數(shù)量增多,細胞凋亡率明顯降低,這表明基于經(jīng)筋理論針刀髕周筋結(jié)松解法能夠有效降低KOA軟骨細胞凋亡,為臨床針刀療法治療KOA提供實驗研究依據(jù)。