李肖凡， 王榮月， 黃 沖， 湯金偉， 劉 娟， 黎睿君

(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023)

仿刺參(Apostichopus japonicus)在分類學(xué)上隸屬于楯手目(Aspidochirotida)刺參科(Stichopodidae)仿刺參屬(Apostichopus)，其經(jīng)濟(jì)價值和保健價值很高[1]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模和密度的不斷增大，水產(chǎn)養(yǎng)殖病害頻發(fā)[2]。免疫增強(qiáng)劑可以提高水產(chǎn)動物免疫力[3]，其中殼寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)被證實是一種安全有效的免疫增強(qiáng)劑。COS 是由幾丁質(zhì)脫乙?；蟮玫降漠a(chǎn)物，廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲等的外殼及真菌細(xì)胞壁中，其代謝產(chǎn)物不具有毒性，具有可生物降解，抗病原微生物等活性，同時，因其優(yōu)良性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療[4]、植物抗病[5]和動物養(yǎng)殖中[6]。COS 在水產(chǎn)動物中的作用及對生長性能的研究已被廣泛開展。飼料中添加COS，可提高錦鯉(Cyprinuscarpio)和卵圓鯧鲹(Trachinotus ovatus)的生長、免疫力和對病原菌的抗病能力[7-8]。飼料中添加0%～1%不同含量的COS 飼喂8 周，均能改善雜交石斑魚的生長、腸道健康和對哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)的抗病性[9]。Wang 等[10]研究表明，COS具有觸發(fā)草魚(Ctenopharyngodon idella)體液免疫的潛在作用，同時也可促進(jìn)天然IgM 的分泌。劉美思等[11]研究表明，COS 可有效提高仿刺參幼參的生長性能和免疫酶活性。然而長期飼喂免疫增強(qiáng)劑，可能會使機(jī)體產(chǎn)生免疫疲勞或免疫抑制現(xiàn)象[12]。有研究表明，在連續(xù)飼喂仿刺參殼寡糖28 d后，各免疫指標(biāo)呈先升高后降低的趨勢[13]。進(jìn)行間隔飼喂的情況下，仿刺參的免疫指標(biāo)和對照組相比顯著增強(qiáng)[14]。

因此免疫增強(qiáng)劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中飼喂頻率的探索非常重要。有許多研究通過熒光定位方式，探究殼寡糖在機(jī)體內(nèi)的吸收動力學(xué)[15-16]。張朋朋等[17]通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)檢測方法，檢測到48 h 后殼三糖在Sprague Dawley(SD)大鼠尿液、糞便中的排泄率分別為7.15%和72.80%。Ouyang 等[18]研究表明，12 h 內(nèi)，主要集中在團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)腸道中的COS 逐漸被吸收和代謝。因此，不同物種吸收分布時間有一定差異性。關(guān)于殼寡糖在仿刺參體內(nèi)的吸收動力學(xué)研究較少。

本實驗室前期通過熒光定位實驗研究，明確添加0.5%殼寡糖飼喂仿刺參3 d 后，絕大多數(shù)COS 能夠被吸收代謝。因此，本實驗以仿刺參為研究對象，驗證3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率對仿刺參生長、非特異性免疫力、抗病力以及腸道和呼吸樹組織學(xué)的影響，以期為殼寡糖在仿刺參的健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料及養(yǎng)殖管理

殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品，脫乙酰度＞ 95%，聚合度2～10，平均相對分子質(zhì)量＜1 500 u，由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供?；A(chǔ)飼料由海泥與配合飼料以2∶1 (質(zhì)量比)的比例混合過篩，殼寡糖飼料由基礎(chǔ)飼料添加0.5%的殼寡糖混合均勻，兩種飼料分別制粒，晾曬完成后，-20 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

養(yǎng)殖實驗在大連海洋大學(xué)黃海校區(qū)進(jìn)行。健康仿刺參購自大連寶發(fā)海珍品有限公司，暫養(yǎng)1 周，養(yǎng)殖期間水溫16～18 °C，pH 值為8.00±0.15，鹽度為30，水體24 h 充氧，每日18 時飽食投喂體重4%的基礎(chǔ)飼料，早上9 時吸除殘餌和糞便，并換總水量1/3 的海水。本研究獲得了大連海洋大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，實驗過程中操作人員嚴(yán)格遵守大連海洋大學(xué)倫理規(guī)范，并按照大連海洋大學(xué)倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.2 實驗方法與樣品采集

將204 頭仿刺參[平均體重(18.51±0.28) g] 隨機(jī)分為2 組，每組設(shè)3 個平行，每個平行34 頭。對照組每日飽食飼喂基礎(chǔ)飼料，實驗組每3 天飽食投喂1 次殼寡糖飼料，其余時間飽食投喂基礎(chǔ)飼料，持續(xù)8 周。

養(yǎng)殖實驗結(jié)束后，禁食24 h，每個平行隨機(jī)抽取3 頭仿刺參作為混合樣本，進(jìn)行免疫指標(biāo)測定。收集體腔液，以體積比1∶1 加入抗凝劑(0.48 mol/L NaCl、0.019 mol/L KCl、0.02 mol/L EGTA、0.068 mol/L Tris-HCl，pH 7.6)，一部分將體腔細(xì)胞濃度稀釋至2×106個/mL 后，直接用于吞噬活性和呼吸爆發(fā)測定。另一部分用超聲破碎儀(22 kHz，25×6 s，0 °C)破碎后，4 000 r/min，4 °C，離心10 min，所得上清液-80 °C 保存，用于免疫酶和抗氧化酶的測定。收集腸道和呼吸樹，分別稱重，以質(zhì)量比1∶9 的比例加入預(yù)冷PBS(磷酸鹽緩沖液，pH 7.6)進(jìn)行勻漿。隨后將勻漿液移入1.5 mL 離心管中，4 °C，7 000 r/min，離心20 min，所得上清液于-80 °C 保存，用于免疫酶、抗氧化酶和消化酶活性測定。同時，每個平行隨機(jī)抽取3 頭海參，收集腸道和呼吸樹，用4%多聚甲醛固定液固定48 h，用于組織切片制作。每個平行另隨機(jī)抽取3 頭海參，迅速取腸道組織置于無酶離心管中，放入液氮速凍，-80 °C 保存，用于RNA 提取及相關(guān)基因測定。

1.3 生長性能

相關(guān)生長指標(biāo)計算公式：

式中，N0為初始頭數(shù)，Nt為終末頭數(shù)，W0為初始體重(g)，Wt為終末體重(g)，t為實驗天數(shù)(d)，Wv為內(nèi)臟重(g)，Wi為腸道重(g)，Wb為體壁重(g)。

1.4 體腔細(xì)胞吞噬活性和呼吸爆發(fā)

吞噬活性和呼吸爆發(fā)參考文獻(xiàn)，分別采用中性紅方法和氮藍(lán)四唑(NBT)還原法測定[19]。

1.5 酶活性測定

采用考馬斯亮藍(lán)法測定組織勻漿液蛋白質(zhì)濃度[20]，用于后續(xù)腸道和呼吸樹組織酶活性計算。體腔細(xì)胞、腸道和呼吸樹的非特異性免疫酶和抗氧化酶指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的檢測試劑盒和酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國)測定。非特異性免疫指標(biāo)包括酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)和總一氧化氮合酶(T-NOS)的活性?？寡趸笜?biāo)包括超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量。嚴(yán)格按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行試驗操作，參照試劑盒說明書中的計算公式換算成相應(yīng)含量或酶活性。其次，測定腸道的消化酶。采用福林酚法[21]、3,5-二硝基水楊酸顯色法[21]和橄欖油乳化液法[22]，分別檢測腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。

1.6 腸道、呼吸樹組織學(xué)切片

固定后的樣品經(jīng)梯度酒精脫水、透明、浸蠟和包埋，在室溫下切成5 μm 切片。經(jīng)脫蠟，蘇木精-伊紅(H.E)染色后，中性樹脂封片。腸道每組選取5 張不連續(xù)的切片，每張切片隨機(jī)選取8 個位點，測量各組織層的厚度。呼吸樹隨機(jī)選擇有代表性的切片進(jìn)行觀察并拍照。利用Image Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行腸道切片定量。

1.7 實時熒光定量PCR

仿刺參腸道總RNA 提取參照莫納試劑盒說明書(Monad)。使用酶標(biāo)儀測定提取的RNA 濃度，用1%瓊脂糖凝膠檢測RNA 質(zhì)量。提取的總RNA 用Prime ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將上述提取到的RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時熒光定量PCR 實驗使用實時定量PCR 儀(Eppendorf)對仿刺參腸道免疫相關(guān)基因Aj-tlr3、Aj-c3、Aj-lyz、Aj-sod、Aj-relmRNA 的相對表達(dá)水平進(jìn)行檢測(表1)，引物均于生工生物工程(上海)股份有限公司合成，本實驗中所選用的定量引物參考文 獻(xiàn)[23-24]。實 驗 體 系 為SYBR?Premix ExTaqTM(Monad) 10 μL，cDNA (100 ng/μL) 2 μL，ddH2O 7.2 μL，引 物F (10 μmol/L) 0.4 μL；引 物R (10 μmol/L) 0.4 μL。基本反應(yīng)程序為95 °C 預(yù)變性10 min；95 °C變性10 s，60 °C 退火10 s，72 °C 延伸20 s，40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

表1 內(nèi)參和目的基因定量引物Tab. 1 Primers of internal reference and target genes

1.8 攻毒實驗

養(yǎng)殖實驗結(jié)束后，實驗組和對照組分別隨機(jī)選取15 頭仿刺參，進(jìn)行病原菌攻毒實驗。病原菌為燦爛弧菌(Vibrio splendidus) (登錄號：AM422807)，來自大連市海珍品疾病防控重點實驗室。攻毒前經(jīng)過活化和復(fù)壯，測定LD50為108CFU/mL。將菌液密度調(diào)至2×108CFU/mL，采用腹腔注射法，向仿刺參體內(nèi)注射菌液0.1 mL。于水槽中養(yǎng)殖，觀察14 d 內(nèi)的死亡情況。攻毒期間兩組仿刺參分別以養(yǎng)殖實驗時的飼喂方式進(jìn)行投喂。

1.9 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，分別通過Excel 2019、SPSS 22.0 和Origin 2019 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析與繪圖。采用獨(dú)立樣本T檢驗比較組間差異性，以P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 間隔投喂殼寡糖對仿刺參生長性能的影響

經(jīng)過8 周的養(yǎng)殖實驗，仿刺參的初始體重、終末體重、增重率、特定生長率、臟壁比、腸壁比、存活率見表2。3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率對仿刺參增重率、特定生長率、存活率無顯著影響(P＞0.05)。與對照組相比，間隔投喂殼寡糖可極顯著提高仿刺參的臟壁比和腸壁比(P＜0.01)。

表2 間隔投喂殼寡糖對仿刺參生長性能的影響Tab. 2 Effects of COS feeding frequency once every 3 days on growth performance of A. japonicus

2.2 間隔投喂殼寡糖對仿刺參體腔細(xì)胞吞噬活性和呼吸爆發(fā)的影響

間隔投喂殼寡糖對仿刺參體腔細(xì)胞吞噬活性和呼吸爆發(fā)的影響見表3。與對照組相比，3 天1次的殼寡糖飼喂頻率可顯著提高仿刺參體腔細(xì)胞的吞噬活性和呼吸爆發(fā)能力(P＜0.05)。

表3 間隔投喂殼寡糖對仿刺參體腔細(xì)胞吞噬活性和呼吸爆發(fā)的影響Tab. 3 Effects of COS feeding frequency once every 3 days on phagocytic activity and respiratory outburst of coelomocytes of A. japonicus

2.3 間隔投喂殼寡糖對仿刺參非特異性免疫酶活性的影響

間隔投喂殼寡糖對仿刺參體腔細(xì)胞、腸道、呼吸樹非特異性免疫酶活性的影響見表4。3 天1次的殼寡糖飼喂頻率對仿刺參體腔細(xì)胞、腸道、呼吸樹ACP、AKP、LZM、T-NOS 活性有不同程度的影響。與對照組相比，該方式飼喂殼寡糖顯著提高了體腔細(xì)胞的ACP 活性(P＜0.05)，極顯著提高了腸道的ACP 活性(P＜0.01)，較對照組分別提高62.83%和42.12%，但對呼吸樹的ACP 活性無顯著影響(P＞0.05)。3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率極顯著提高了體腔細(xì)胞和腸道的AKP 活性(P＜0.01)，顯著提高了呼吸樹的AKP 活性(P＜0.05)，分別提高了20.88%、70.06%和50.05%。同時，該飼喂方式能顯著提高體腔細(xì)胞的LZM 活性(P＜0.05)，極顯著提高了腸道和呼吸樹的LZM 活性(P＜0.01)，分別提高58.27%、156.00%和30.84%。該方式能顯著提高體腔細(xì)胞的T-NOS 活性(P＜0.05)，極顯著提高腸道的T-NOS 活性(P＜0.01)，較對照組分別提高24.27%和43.65%。

表4 間隔投喂殼寡糖對仿刺參體腔細(xì)胞、腸道、呼吸樹非特異性免疫酶的影響Tab. 4 Effects of COS feeding frequency once every 3 days on non-specific immunoenzyme activities in coelomocytes,intestine and respiratory tree of A. japonicus

2.4 間隔投喂殼寡糖對仿刺參抗氧化酶的影響

間隔投喂殼寡糖對仿刺參體腔細(xì)胞、腸道、呼吸樹抗氧化酶活性的影響見表5。3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率對仿刺參體腔細(xì)胞、腸道、呼吸樹的SOD、CAT、T-AOC 活性和MDA 含量有不同程度的影響。與對照組相比，間隔飼喂殼寡糖極顯著提高了仿刺參體腔細(xì)胞CAT 活性(P＜0.01)，較對照組提高了208%，而對SOD 和T-AOC 活性、MDA 含量無顯著影響(P＞0.05)。

表5 間隔投喂殼寡糖對仿刺參體腔細(xì)胞、腸道、呼吸樹抗氧化酶的影響Tab. 5 Effects of COS feeding frequency once every 3 days on antioxidant enzyme activities in coelomocytes,intestine and respiratory tree of A. japonicus

2.5 間隔投喂殼寡糖對仿刺參腸道消化酶活性的影響

間隔投喂殼寡糖對仿刺參腸道消化酶活性的影響見表6。與對照組相比，該方式飼喂殼寡糖極顯著提高了仿刺參腸道蛋白酶活性(P＜0.01)，顯著提高了仿刺參腸道脂肪酶活性(P＜0.05)，分別提高了27.92%和11.41%，對仿刺參腸道淀粉酶活性有提高，但無顯著差異(P＞0.05)。

圖版 Ⅰ 間隔投喂殼寡糖對仿刺參腸道組織學(xué)的影響1～3 分別為對照組前、中、后腸，4～6 分別為實驗組前、中、后腸，H.皺襞高度，W.皺襞寬度，M.黏膜層，SM.黏膜下層，MC.肌肉層，S.漿膜層，下同。Plate Ⅰ Effects of COS feeding frequency once every 3 days on the intestinal histology of A. japonicus 1-3. foregut, midgut and hindgut of the control group, respectively; 4-6. foregut, midgut and hindgut of treatment group. H. fold height, W. fold width,M. mucosa, SM. submucosa, MC. muscularis, S. serosa, the same below.

表6 間隔投喂殼寡糖頻率對仿刺參腸道消化酶活性的影響Tab. 6 Effects of COS feeding frequency once every 3 days on the intestinal digestive enzyme activities of A. japonicus U

2.6 殼寡糖對仿刺參組織學(xué)的影響

組織切片顯示，仿刺參腸道由內(nèi)向外依次為黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層(圖版Ⅰ)。與對照組相比，實驗組仿刺參腸道結(jié)構(gòu)更規(guī)則，腸絨毛和肌肉層更完整(圖版Ⅰ)。腸道切片定量數(shù)據(jù)如圖1 所示，與對照組相比，3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率極顯著地提高了仿刺參前腸肌層和漿膜層厚度(P＜0.01)，中腸皺襞高度和寬度(P＜0.01)，后腸皺襞高度和寬度(P＜0.01) (圖1)。

圖1 間隔投喂殼寡糖對仿刺參腸道形態(tài)參數(shù)的影響圖中不同小寫字母表示組間差異顯著(P＜0.05)，不同大寫字母表示組間差異極顯著(P＜0.01)，下同。Fig. 1 Effects of COS feeding frequency once every 3 days on intestinal morphological parameters of A. japonicus Different lowercases stand for significant differences within groups(P＜0.05), and different capital letters stand for mean significant differences within groups (P＜0.01), the same below.

仿刺參呼吸樹呈樹狀分布于體腔中，其管壁由外向內(nèi)依次是體腔上皮層、肌層、血腔、內(nèi)皮層和中央腔[25]。實驗組和對照組相比，形態(tài)上無明顯變化(圖版Ⅱ)。在3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率下，仿刺參呼吸樹體腔上皮層的細(xì)胞排列緊密，肌肉層界限清晰完整，輕微加厚，血腔中含有大量細(xì)胞，內(nèi)皮層細(xì)胞呈脊?fàn)钕蛑醒肭煌蛊穑醒肭惠^大且明顯(圖版Ⅱ)。

2.7 間隔投喂殼寡糖對仿刺參腸道免疫相關(guān)基因的影響

間隔投喂殼寡糖對仿刺參腸道5 個免疫相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響如圖2 所示。3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率極顯著提高了仿刺參腸道中Ajtlr3、Aj-c3、Aj-lyz、Aj-sod、Aj-relmRNA 的相對表達(dá)量(P＜0.01)，分別提高了41.87%、42.95%、22.04%、14.40%和86.51%。

圖2 間隔投喂殼寡糖對仿刺參腸道5 個基因相對表達(dá)量的影響Aj-lyz.溶菌酶，Aj-sod. Cu-Zn 超氧化物歧化酶，Aj-tlr3. Toll 樣受體3，Aj-c3.補(bǔ)體3，Aj-rel. rel 基因。Fig. 2 Effects of COS feeding frequency once every 3 days on relative expression of five genes in intestine of A. japonicus Aj-lyz. lysozyme, Aj-sod. Cu-Zn superoxide dismutase, Aj-tlr3. Toll-like receptor 3, Aj-c3. Complement 3, Aj-rel. rel gene.

2.8 間隔投喂殼寡糖對仿刺參抗病力的影響

燦爛弧菌攻毒后，仿刺參的存活率見圖3。與對照組相比，3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率可以提高仿刺參的存活率，其存活率由53.33%提高至66.67%。

圖3 間隔投喂殼寡糖對注射燦爛弧菌的仿刺參存活率的影響Fig. 3 Effects of COS feeding frequency once every 3 days on the survival rate of A. japonicus after challenge test

圖版 Ⅱ 間隔投喂對仿刺參呼吸樹組織學(xué)的影響1. 對照組呼吸樹，2. 實驗組呼吸樹，A. 體腔上層，B. 內(nèi)皮細(xì)胞，C. 血腔，D. 肌層，E. 細(xì)胞分泌物，F(xiàn). 中央腔。Plate Ⅱ Effects of COS feeding frequency once every 3 days on the histology of the respiratory tree of A. japonicus 1. respiratory tree of the control group, 2. respiratory tree of the treatment group. A. coelothelial cell; B. endothelial cell; C. haemocoel; D. muscular layer; E. secretion of endothelial cell; F. center antrum.

3 討論

3.1 間隔投喂殼寡糖對仿刺參生長的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，在3 天1 次的飼喂頻率下，0.5%殼寡糖能極顯著提高仿刺參的臟壁比和腸壁比(P＜0.01)，但對仿刺參的增重率和特定生長率沒有顯著影響，與Wang 等[23]研究有一定差異。本研究與徐貴珠[26]的研究相似，其在飼料中添加COS 飼喂60 d 后，中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)的肝胰臟重量、腸道重量顯著升高。推測殼寡糖促進(jìn)生長的機(jī)理可能是通過誘導(dǎo)腸道消化酶的表達(dá)，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的分解；誘導(dǎo)消化器官的生長發(fā)育，促進(jìn)小分子物質(zhì)的吸收，進(jìn)而提高生長性能。殼寡糖對不同水產(chǎn)動物生長性能會產(chǎn)生不同的影響[3]，針對不同養(yǎng)殖動物的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.2 間隔投喂殼寡糖對仿刺參體腔細(xì)胞吞噬活性和呼吸爆發(fā)的影響

體腔細(xì)胞的吞噬作用是仿刺參吞噬和清除外來物質(zhì)的重要手段，屬于體內(nèi)防御機(jī)制的第一道防線[27-28]。仿刺參體腔液中變形細(xì)胞和球形細(xì)胞具有吞噬功能，同時，免疫細(xì)胞在激活吞噬狀態(tài)時會產(chǎn)生呼吸爆發(fā)作用，釋放大量的超氧陰離子和強(qiáng)氧化物(·O2-、·OH、O2和H2O2)，具有廣泛殺菌和清除異物的功能[29]。有報道稱，0.5%殼寡糖飼喂1 周可激活仿刺參體腔細(xì)胞吞噬活性，在飼喂4 周內(nèi)呼吸爆發(fā)活性保持在較高水平[13]。1%殼寡糖飼喂仿刺參10 d 后，顯著提高了體腔細(xì)胞的吞噬活性和吞噬過程中呼吸爆發(fā)活性[30]。本研究結(jié)果與其相似，3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率可顯著提高仿刺參體腔細(xì)胞的吞噬活性和呼吸爆發(fā)能力(P＜0.05)。推測水溶性的殼寡糖分子本身也具有一定的免疫原性，能夠與仿刺參體腔細(xì)胞表面受體蛋白相結(jié)合，進(jìn)而激發(fā)信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)一系列免疫反應(yīng)，提高仿刺參體腔細(xì)胞吞噬活性，產(chǎn)生較多的超氧陰離子，從而提高仿刺參的免疫能力。

3.3 間隔投喂殼寡糖對仿刺參非特異性免疫指標(biāo)的影響

棘皮動物缺乏脊椎動物中的特異性免疫，因此非特異性免疫能力在仿刺參的免疫防御中發(fā)揮著極其重要的作用。本研究中，殼寡糖可通過提高仿刺參體腔細(xì)胞、腸道、呼吸樹非特異性免疫酶和抗氧化酶活性，加強(qiáng)腸道相關(guān)免疫基因的表達(dá)，最終提高仿刺參的非特異性免疫能力。ACP和AKP 都是溶酶體酶的標(biāo)志酶，ACP 可通過水解作用將表面帶有磷酸酯的異物破壞，從而加快吞噬細(xì)胞對異物的吞噬和降解速率，AKP 能通過改變病原菌的表面結(jié)構(gòu)，發(fā)揮調(diào)理素的作用[31]。本研究中，殼寡糖間隔投喂可極顯著提高腸道的ACP 活性和體腔細(xì)胞、腸道的AKP 活性(P＜0.01)，這與劉均玲等[32]和蘇鵬等[33]的研究結(jié)果相近。溶菌酶是一種堿性蛋白，不僅能夠通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖部分防御病害，而且還有消化和濾食海洋細(xì)菌的作用[34]。在本研究中，3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率顯著提高了體腔細(xì)胞LZM 活性(P＜0.05)，極顯著提高了腸道和呼吸樹的LZM 活性(P＜0.01)，這與李明波等[35]的研究結(jié)果相近。同時，實驗組腸道Aj-lyz基因表達(dá)量極顯著高于對照組(P＜0.01)，與酶活性測定趨勢一致，說明3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率可通過促進(jìn)溶菌酶活性提高仿刺參的免疫能力。生物體內(nèi)催化NO 生成的NOS 包括神經(jīng)型NOS、誘導(dǎo)型NOS 和內(nèi)皮型NOS，共3 個亞型，其中免疫刺激物能誘導(dǎo)iNOS 產(chǎn)生大量NO，之后產(chǎn)生多種類型的活性氮中間體作為殺菌分子，殺滅細(xì)菌、真菌等病原微生物，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能[36]。本研究中，3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率極顯著提高腸道T-NOS 活性(P＜0.01)，顯著提高體腔細(xì)胞和呼吸樹的T-NOS 活性(P＜0.05)，這與劉美思等[11]的研究結(jié)果相近。綜上所述，該飼喂頻率的殼寡糖能刺激仿刺參的免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能。SOD 和CAT 是抗氧化防御體系中重要的功能酶，可相互關(guān)聯(lián)清除活性氧自由基[37]。本研究中，3 天1 次的殼寡糖飼喂方式極顯著提高了仿刺參體腔細(xì)胞CAT 活性(P＜0.01)，并且極顯著提高仿刺參腸道Aj-sod基因的表達(dá)量(P＜0.01)。因此，3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率對仿刺參的抗氧化能力有一定的促進(jìn)作用。海參免疫因子是宿主抵御病原菌入侵的主要受體。這些免疫因子包括溶菌酶、模式識別蛋白、Toll 樣受體、補(bǔ)體C3 等可能參與海參先天免疫系統(tǒng)的體液因子[38]。Toll 樣受體是I 型整體膜糖蛋白家族，主要作用于信號傳導(dǎo)，在先天免疫中起著關(guān)鍵作用。在仿刺參中，TLR3 在各組織中廣泛表達(dá)，并參與對革蘭氏陰性菌和dsRNA 病毒的免疫應(yīng)答[39]。補(bǔ)體是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在維持內(nèi)部環(huán)境的平衡和細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[40]。腸道是機(jī)體重要的消化和免疫組織，本研究中，間隔飼喂殼寡糖可極顯著提高仿刺參腸道Aj-tlr3、Aj-c3 和Aj-rel基因的相對表達(dá)水平(P＜0.01)，這一結(jié)果與腸道非特異性免疫酶活性的響應(yīng)趨勢基本一致。

3.4 間隔投喂殼寡糖對仿刺參消化酶的影響

水產(chǎn)動物消化酶活性的高低能反映其從飼料中消化利用營養(yǎng)物質(zhì)的能力和效率，進(jìn)而影響水產(chǎn)動物的生長和發(fā)育情況。殼寡糖對不同水產(chǎn)動物腸道和肝胰腺的消化酶活性有著不同的作用效果。本研究中，3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率下，仿刺參腸道蛋白酶活性極顯著高于對照組(P＜0.01)，腸道脂肪酶活性顯著高于對照組(P＜0.05)，說明此時脂肪和蛋白質(zhì)為仿刺參提供更多能量，脂肪酶和蛋白酶活性升高。淀粉酶活性與對照組無顯著差異，說明碳水化合物作為能量物質(zhì)的轉(zhuǎn)換相對較少，因此淀粉酶活性變化不大。飼料中添加殼寡糖可提高紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)[33]、 珍 珠 龍 膽 石 斑 魚 [Epinephelus fuscoguttatus(♀)×E.lanceolatus(♂)][41]、 花 鱸(Lateolabrax japonicus)[42]和克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)[43]的消化酶活性，在本研究中，3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率也顯著提高了仿刺參腸道脂肪酶和蛋白酶活性，因此3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率較為可行。

3.5 間隔投喂殼寡糖對仿刺參組織學(xué)的影響

本實驗中，3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率提高了仿刺參腸道結(jié)構(gòu)的完整性，并且對仿刺參腸道的絨毛高度和肌層厚度有很好的改善作用。腸道是仿刺參對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，飲食中的物質(zhì)可以被胃腸道細(xì)胞利用，并刺激局部結(jié)構(gòu)的變化[44]。同時，腸道形態(tài)變化能反映和評估腸道的功能和腸道的健康狀態(tài)。腸道絨毛高度及寬度、微絨毛數(shù)量及密度、肌層厚度等是影響動物對營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行吸收的重要因素[45]。本研究中，3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率極顯著提高了前腸肌層和漿膜層厚度(P＜0.01)，以及中腸腸道絨毛高度和寬度(P＜0.01)，腸絨毛排列規(guī)則，發(fā)育形態(tài)較好。說明該飼喂頻率下的殼寡糖有利于仿刺參腸道消化面積的增加，提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)腸道黏液的分泌，從而保護(hù)腸道絨毛的完整性不被破壞。有研究表明，海參可通過呼吸樹吸收溶解在水中的營養(yǎng)物質(zhì)[46]。本研究中，與對照組相比，實驗組仿刺參呼吸樹形態(tài)無顯著變化，因此，3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率不會破壞仿刺參呼吸樹的結(jié)構(gòu)和完整性。

3.6 間隔投喂殼寡糖對仿刺參抗病力的影響

燦爛弧菌是嚴(yán)重威脅仿刺參養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的重要病原菌之一，間隔飼喂殼寡糖可提高仿刺參對燦爛弧菌的抗病力。攻毒后的存活率能直觀地評價動物機(jī)體的免疫抗病能力[47-48]。本實驗中，3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率提高了攻毒后仿刺參的存活率，這同非特異性免疫酶指標(biāo)結(jié)果相似。在攻毒后，實驗組和對照組均在同一天開始出現(xiàn)死亡，3 天1 次的殼寡糖飼喂并未延后死亡開始出現(xiàn)的時間，可能是樣本量較少，未體現(xiàn)出延緩死亡的效果。但在存活率上，實驗組表現(xiàn)更好。有研究證明，殼寡糖能提高吉富羅非魚(GIFTOreochromis niloticus)對 嗜 水 氣 單 胞 菌(Aeromonas hydrophila)的抗病力[49]，增強(qiáng)珍珠龍膽石斑魚抗哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)的能力[50]，增強(qiáng)仿刺參抗?fàn)N爛弧菌的能力[18]，本研究中實驗組能提高攻毒后刺參的存活率，說明3 天1 次的殼寡糖飼喂頻率對仿刺參具有一定的保護(hù)作用。結(jié)合已有研究，推測這種免疫作用極有可能和腸道、體腔細(xì)胞的先天免疫活動有關(guān)[51]，同時通過直接作用于致病菌細(xì)胞膜或通過產(chǎn)生活性氧以抑制其生長[4]。

4 結(jié)論

綜上所述，以3 天1 次的頻率飼喂添加量為0.5%的殼寡糖，能夠提高仿刺參生長、免疫、抗氧化能力，改善其腸道功能及形態(tài)學(xué)特征。因此，養(yǎng)殖中適宜以該方式飼喂仿刺參，以提高其免疫能力。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）