雷 薇， 李加敏， 方 鵬， 徐嘉玲， 羅天倫， 徐路遙， 彭 墨

(江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，江西 南昌 330045)

水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和漁業(yè)資源的匱乏導致魚粉供不應求，為降低飼料成本和緩解水產(chǎn)飼料生產(chǎn)的壓力，人們將目光聚焦于來源廣泛且蛋白質(zhì)含量高的植物原料。植物原料中的抗營養(yǎng)因子和膽固醇缺失往往降低其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的有效利用。因此，尋找合適的飼料添加劑以促進水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生長、代謝和抗氧化能力，成為水產(chǎn)動物集約化養(yǎng)殖的必然選擇[1-2]。

膽汁酸(bile acids，BAs)是由肝臟膽固醇分解代謝產(chǎn)生的最終產(chǎn)物，可以將脂質(zhì)乳化成小的乳糜顆粒，擴大脂質(zhì)與消化酶的接觸面積，進而起到加速脂肪分解，緩解肝臟脂肪異常沉積的作用[3]。研究表明，膽汁酸可以提高仔豬[4]和仔雞[5]的生長性能和免疫力，調(diào)節(jié)小鼠[6]的肝臟脂肪代謝，顯著提升鱖(Siniperca chuatsi)[7]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[8]和烏鱧(Channa argus)[9]的生長性能。添加適量膽汁酸可以降低大口黑鱸(Micropterus salmoides)[10]、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)[11]、草魚(Ctenopharyngodon idella)[12]和珍珠龍膽石斑魚[Epinephelus fuscoguttatus(♀) ×E.lanceolatus(♂)][13]由高脂飼料誘導的肝脂異常沉積。同時，膽汁酸適量添加可顯著提高鱖[7]和寬體舌鰨(Cynoglossus robutus)[14]魚體的抗氧化能力，增加大口黑鱸[10]的腸黏膜厚度，改變草魚和珍珠龍膽石斑魚的膽汁酸圖譜[12-13]。因此，飼料中添加膽汁酸對養(yǎng)殖魚類的生長、代謝和抗氧化等具有積極的調(diào)控作用。

黃鱔(Monopterus albus)是一種典型的肉食性淡水養(yǎng)殖魚類之一，其肉質(zhì)細膩，且具有豐富的營養(yǎng)價值。黃鱔貪食，生長中極易出現(xiàn)花白肝等脂肪異常沉積、肝腸功能障礙等現(xiàn)象[15]，是黃鱔養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)亟待解決的重要問題。

魚粉作為黃鱔飼料的主要蛋白原料，是導致其養(yǎng)殖成本高的主要原因。用植物性蛋白源替代魚粉，會造成飼料中膽固醇(膽汁酸合成的前體物質(zhì))的含量減少。因此，本實驗旨在通過向黃鱔飼料中添加膽汁酸，探究其對黃鱔生長性能、體組成、血清生化和肝腸健康的影響，同時確定黃鱔飼料中膽汁酸的適宜添加量，為黃鱔的健康養(yǎng)殖積累基礎數(shù)據(jù)和提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

采用單因素試驗設計，以魚粉為主要蛋白質(zhì)源，α 淀粉作為主要糖源，魚油、豆油按1∶1 (重量比)混合作為飼料的主要脂肪源，設計粗蛋白水平約為42%、粗脂肪水平約為7.9%的5組不同膽汁酸添加量的等氮等脂飼料。5 組飼料的膽汁酸添 加 量 分 別0、125、250、375 和500 mg/kg，并分別命名為CON、BA125、BA250、BA375 和BA500 組。基礎飼料配方組成及營養(yǎng)成分見表1。實驗中所用的其他原料均購自深圳市澳華集團股份有限公司。所有飼料原料均粉碎并通過60 目篩，然后均勻加入混合后的魚油和大豆油(1∶1，重量比)并充分混合，最終成品于自封袋中密封，保存于-20 °C 冰箱備用。

表1 實驗飼料的組成及營養(yǎng)成分Tab. 1 Ingredients and proximate chemical composition of the experimental diets %

1.2 養(yǎng)殖管理

本實驗所選的黃鱔購自江西余干黃鱔養(yǎng)殖場。篩選1 200 尾初始平均體重為(23.00±0.03) g 的健康黃鱔，首先采用網(wǎng)箱進行養(yǎng)殖，禁食24 h 后將其分為5 組，每組4 個網(wǎng)箱(規(guī)格為2.0 m×1.0 m×2.0 m)，每個網(wǎng)箱60 尾。養(yǎng)殖期間，每天17：00—18.00 飽食投喂，養(yǎng)殖周期為56 d。整個實驗期間觀察并記錄黃鱔的攝食量和水質(zhì)情況。養(yǎng)殖水溫20.9～29.5 °C， 溶 解 氧 含 量≥5 mg/L， pH 為6.5～7.4，氨氮含量≤2.0 mg/L，亞硝酸鹽濃度≤0.10 mg/L。

1.3 樣本采集

實驗結束后，禁食24 h。稱重和計數(shù)后記錄每個網(wǎng)箱中的黃鱔數(shù)量和總重，采用MS-222 麻醉后，每個網(wǎng)箱取3 尾魚，分別稱量體重、體長，進行靜脈采血，之后解剖獲取肝臟和內(nèi)臟團進行稱重，取其肝臟、腸道存于2 mL 凍存管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 °C 超低溫冰箱中保存。取肝臟和腸道組織存于4%多聚甲醛溶液。本研究獲得了江西農(nóng)業(yè)大學實驗動物管理和使用倫理委員會批準，實驗過程中操作人員嚴格遵守江西農(nóng)業(yè)大學倫理規(guī)范，并按照江西農(nóng)業(yè)大學倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.4 測定指標及方法

生長性能 生長性能相關計算公式：

式中，Wt和W0分別為終末均重(g, final body weight, FBW)和初始均重(g, initial body weight, IBW)，Nt和N0分別為養(yǎng)殖后的終末尾數(shù)和初始尾數(shù)，L為魚體長(cm, body length)，Wl為肝臟重(g, liver weight)，Wv為內(nèi)臟重(g, visceral weight)，F(xiàn)C 為飼料消耗總量(g, total amount of the feed consumed)。

飼料和全魚營養(yǎng)成分測定 按照AOAC的標準方法測定實驗飼料和全魚的營養(yǎng)成分[16]：將樣品在105 °C 烘箱中烘干至恒重得到水分含量；用凱式定氮法測定樣品的粗蛋白含量；用索式抽提法測定樣品中粗脂肪的含量；將樣品在550 °C的馬弗爐中灼燒6 h 至恒重得到灰分含量。

血清生理生化指標測定 總膽汁酸(total bile acids，TBA)、血 尿 氮(blood urea nitrogen，BUN)、總膽固醇(Total cholesterol，CHOL)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamicpyruvic transaminase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，AST)的測定使用貝克曼AU480 生化分析儀以及配套的試劑盒。D 乳酸(lactate dehydrogenase, D-LA)的測定使用上海優(yōu)選品牌酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒。二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)的測定使用上海撫生實業(yè)有限公司酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒。

腸道消化酶和組織生化指標測定 腸道消化相關的胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，與腸道抗氧化能力相關的谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)，均通過南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定，方法參考說明書。

基因表達量測定(RT-PCR 法) 腸道總RNA 使用Trizol 試劑(TaKaRa，日本)提取，使用NanoDrop2000 超微量分光光度計(Thermo Fisher，美國)測定總RNA 濃度。隨后使用Prime-ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)合成cDNA，并用DEPC (diethyl pyrocarbonate)水進行稀釋后置于-20 °C 保存?zhèn)溆?。定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應使用實時定量PCR 儀(Bio-rad - CFX96)進行實驗，反應體積為10 μL，其中引物0.4 μL，cDNA 0.5 μL、SYBR Green qPCR Mix (High ROX) (艾德萊生物科技有限公司，北京) 5.0 μL、無菌非酶水4.1 μL。定量聚合酶鏈式反應程序設置為95 °C 預變性2 min，95 °C 變性15 s，55～60 °C 退火72 min，72 °C延伸10 s，40 個循環(huán)之后形成熔解曲線。采用2-ΔΔCt方法計算基因表達[16]。分析擴增效率后選擇18S rRNA 作為本研究內(nèi)參基因。引物序列如表2所示。

表2 黃鱔實時定量PCR 引物Tab. 2 Quantitative primer of M. albus

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用 “平均值±標準差(mean±SD，n=4)” 表示，采用SPSS 12.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，若組間差異顯著(P＜0.05) ，則作Duncan 氏多重比較分析。所有原始數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2017 軟件處理，然后分別用Microsoft Word 2017 和Graph-Pad Prism 5 軟件繪制成圖表。

2 結果

2.1 飼料中添加膽汁酸對黃鱔生長性能的影響

由表3 可知，隨著飼料膽汁酸添加量的增加，黃鱔FBW、WGR 和SGR 呈先升后降趨勢，BA250和BA375 組FBW、WGR 和SGR 顯著高于CON和BA500 組(P＜0.05)。FCR 隨膽汁酸添加量的增加呈先降后升趨勢，BA250 組的FCR 顯著低于CON 組 和BA500 組(P＜0.05)， 但 與BA125 和BA375 組之間無顯著差異(P＞0.05)。膽汁酸的添加對黃鱔的HSI 和VSI 無顯著影響(P＞0.05)，但BA250 組CF 顯著高于CON、BA375 和BA500 組(P＜0.05)。

表3 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔生長性能的影響Tab. 3 Effects of dietary bile acids on the growth performance of M. albus

2.2 黃鱔飼料適宜膽汁酸添加量

以特定生長率為評價指標，經(jīng)一元二次回歸分析：y=-3.0×10-6x2+1.7×10-3x+1 362.3×10-3(R2=0.930 7)，得知膽汁酸最適添加量為283.3 mg/kg；以飼料轉(zhuǎn)化率為評價指標，經(jīng)一元二次回歸分析：y=7.0×10-6x2-3.5×10-3x+1 962.3×10-3(R2 = 0.984 7)，得出膽汁酸最適添加量為250.0 mg/kg。據(jù)此，初始體重為(23.00±0.03) g 的黃鱔飼料中膽汁酸適宜添加量為250.0～283.3 mg/kg。

2.3 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔體成分的影響

由表4 可知，隨飼料中膽汁酸添加量的增加，全魚粗蛋白呈先升后降趨勢(P＜0.05)，在BA250組達到最高值。肝臟的粗脂肪隨飼料膽汁酸添加量的增加呈先降后升趨勢(P＜0.05)。全魚水分、粗脂肪、灰分和肌肉粗脂肪在各組間均無顯著差異(P＞0.05)。

表4 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔全魚體成分、肝臟和肌肉粗脂肪含量(濕重)的影響Tab. 4 Effects of dietary bile acids on the body composition and total lipid content (wet weight) in liver and muscle of M. albus %

2.4 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔血清生理生化指標和腸道通透性指標的影響

由表5 可知，LDL-C 濃度在BA500 組顯著高于其余各組(P＜0.05)。ALT 含量在添加膽汁酸的各個處理組中均顯著低于CON 組，而AST 含量隨膽汁酸添加量的增加呈先降后升的趨勢(P＜0.05)。腸道通透性指標的結果顯示，隨膽汁酸添加量的增加，D-LA 含量呈降低趨勢(P＜0.05)。而DAO 呈先降后升趨勢(P＜0.05)，在BA250 組中含量最低。TBA、BUN 和T-CHO 各組間均無顯著差異(P＞0.05)。

表5 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔血清生理生化指標和腸道通透性指標的影響Tab. 5 Effects of dietary bile acids on the serum physiological and biochemical indexes and intestinal permeability indexes of M. albus

2.5 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔腸道消化能力的影響

由表6 可知，飼料中添加膽汁酸對黃鱔腸道的淀粉酶和胰蛋白酶活性無顯著影響(P＞0.05)。在BA250 組中，腸道脂肪酶活性顯著低于其他組(P＜0.05)，且其他組之間均無顯著差異(P＞0.05)。

表6 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔腸道消化酶活性的影響Tab. 6 Effects of dietary bile acids on the intestinal digestive enzymes activity of M. albus

2.6 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔腸道抗氧化能力的影響

由表7 可知，隨著膽汁酸添加量的增加，黃鱔腸道的T-SOD 和GSH-Px 活性均呈先升后降的趨勢，在BA250 組中黃鱔腸道T-SOD 的活性顯著高于BA375 和BA500 組(P＜0.05)。MDA 的含量隨著膽汁酸添加量的增加呈現(xiàn)先降后升的趨勢(P＜0.05)，BA250 組 顯 著 低 于CON 和BA375 組(P＜0.05)。

表7 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔腸道抗氧化酶活性的影響Tab. 7 Effects of dietary bile acids on the intestinal antioxidant enzyme activity of M. albus

2.7 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔肝臟抗氧化酶活性的影響

由表8 可知，隨著膽汁酸添加量的增加，肝臟T-SOD 活 性 呈 上 升 趨 勢(P＜0.05)，BA375 和BA500 組 顯 著 高 于CON 和BA125 組(P＜0.05)。BA250 和BA500 組GSH-Px 活性顯著高于CON組(P＜0.05)。BA250 組CAT 活性最高，BA500 組最低(P＜0.05)。

表8 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔肝臟抗氧化酶活性的影響Tab. 8 Effects of dietary bile acids on the liver antioxidant enzyme activity of M. albus

2.8 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔肝臟組織學結構的影響

肝臟H.E 染色結果顯示，CON 組肝細胞腫大，部分肝細胞壁模糊(圖版Ⅰ)。BA125 和BA250 組肝臟組織學結構較為完整，細胞核數(shù)量增多。BA375 組肝細胞出現(xiàn)空泡化和破裂。BA500 組肝細胞空泡化嚴重，無核和破裂細胞增多。肝臟油紅O 染色結果顯示，隨飼料膽汁酸添加量增加，肝臟脂滴數(shù)量呈先降后升趨勢，且在BA250 組最少(圖版Ⅱ)。

2.9 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔肝臟脂肪代謝的影響

隨飼料膽汁酸添加量的增加，肝臟acc和dgat2 的mRNA 表達 水 平 呈 降 低 趨 勢(P＜0.05)，cpt1 的mRNA 表達水平呈先升后降的趨勢(P＜0.05)，pparα的mRNA 表達水平在BA375 時最高(P＜0.05) (圖1)。

圖1 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔肝臟脂肪代謝相關基因的影響柱上不同字母代表組間存在顯著差異，P＜0.05，下同。Fig. 1 Effects of dietary bile acids on lipid metabolismrelated genes in liver of M. albus The different letters on the column represent significant differences between groups, P＜0.05, the same below.

圖版 Ⅰ 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔肝臟組織形態(tài)的影響(H.E 染色) (×40)1～5 分別表示0、125、250、375 和500 mg/kg 膽汁酸組，下同。a.細胞核消失或縮小，b.細胞膜破裂，c.細胞空泡。Plate Ⅰ Effects of dietary bile acids on liver morphology of M. albus (×40)1-5 are CON, BA125, BA250, BA375 and BA500 groups, respectively, the same below. a. the disappearance or shrinkage of the nucleus, b. cell membrane rupture, c. cellular vacuole .

2.10 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔腸道組織學結構的影響

腸道形態(tài)學指標如圖版Ⅲ和圖2 所示，各組腸道結構完整，腸絨毛整齊，腸黏膜光滑。但隨飼料膽汁酸添加量的增加，腸道絨毛寬度和固有層寬度呈先升后降趨勢(P＜0.05)，腸絨毛寬度在BA375 組達到最高，固有層寬度在BA250 組達到最高。BA500 組絨毛寬度顯著低于CON 組(P＜0.05)；BA500 組腸道絨毛高度顯著低于其余各組，而其他各組之間均無顯著差異(P＞0.05)。

圖2 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔腸道結構的影響Fig. 2 Effects of dietary bile acids on intestinal structure of M. albus

2.11 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔腸道屏障相關基因表達的影響

如圖3 所示，隨飼料膽汁酸添加量的增加，zo1、zo2 和occludin的mRNA 表達水平均呈先升后降趨勢(P＜0.05)，zo1、zo2 和occludin的mRNA表達水平分別在BA375 組、BA250 組和BA125組達到最高。

圖3 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔腸道屏障相關基因表達的影響Fig. 3 Effects of dietary bile acids on the expression of genes related to intestinal barrier of M. albus

3 討論

3.1 膽汁酸對黃鱔生長性能的影響

膽汁酸是在肝臟中由膽固醇產(chǎn)生，可提高脂肪消化效率，促進膽固醇和有毒代謝物的排泄[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加適量的膽汁酸可顯著改善黃鱔的生長性能。在鱖[7]、虹鱒[8]、烏鱧[9]和草魚[12]的研究中均有相似的結果?？赡艿脑蚴悄懼岽龠M魚體對脂肪的代謝吸收。同時本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中膽汁酸含量過量時，黃鱔的增重率和終末均重有下降的趨勢，且飼料轉(zhuǎn)化率顯著升高。這與在尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[17]中的研究結果一致?？赡苁沁^量的膽汁酸造成了膽固醇積累、肝細胞毒性等負面影響，進而導致生長性能降低。適量的膽汁酸可起到促進魚類生長的作用，而過量的膽汁酸可能會造成毒性并抑制魚類的生長。在本研究中，飼料中添加膽汁酸并未顯著影響胰蛋白酶和淀粉酶的活性，甚至降低了脂肪酶的活性。添加膽汁酸并未影響大黃魚(Larimichthys crocea)[18]腸道主要消化酶活性；提高了烏鱧[9]和豹紋鰓棘鱸(Plectropomus leopardus)[19]腸道脂肪酶和胰蛋白酶的活性；提高了寬體舌鰨[14]腸道脂肪酶和淀粉酶活性，但不影響其蛋白水解酶活性。因此，膽汁酸添加對魚類消化酶造成的影響并不一致，這可能與魚類的種類、大小、養(yǎng)殖條件和飼料組成有關。

圖版 Ⅲ 飼料中膽汁酸添加量對黃鱔腸道組織形態(tài)的影響(H.E 染色) (×5)LW.固有層寬度，VH.絨毛高度，VW.絨毛寬度，GC.杯狀細胞。Plate Ⅲ Effects of dietary bile acids on intestinal morphology of M. albus (×5)LW. lamina propria width, VH. villus height, VW. villus width, GC. goblet cell.

本研究以特定生長率和飼料轉(zhuǎn)化率為評價指標，采用一元二次回歸分析，得出黃鱔飼料膽汁酸的適宜添加量為250.0～283.3 mg/kg。目前，在不同魚類的研究中，飼料中添加的膽汁酸是否能有效地促進魚類的生長結論并不一致。飼料中添加適量的膽汁酸對大多數(shù)魚類生長性能有積極的促進作用，如大口黑鱸在膽汁酸(鵝去氧膽酸)添加量為900 mg/kg 時生長性能最佳[10]；鱖[7]在膽汁酸(豬去氧膽酸占70.9%，豬膽酸占8.0%，鵝去氧膽酸占20.2%)添加量為900 mg/kg 時生長性能顯著提升；而大黃魚在膽汁酸(混合膽汁酸)添加量為300 mg/kg 時生長性能最佳[20]。但對一些魚類的研究表明，飼料中添加膽汁酸并不能顯著改善生長性能，如紅鰭東方鲀[11]。因此，膽汁酸的添加效果需根據(jù)魚的種類而異。

3.2 膽汁酸對黃鱔體成分和脂肪代謝的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，適量的膽汁酸添加可顯著降低黃鱔肝臟中粗脂肪含量。飼料添加膽汁酸降低了鱖[7]和紅鰭東方鲀[11]的全魚和肝臟中的粗脂肪含量。飼料膽汁酸添加量從150 mg/kg 提高至450 mg/kg 時顯著降低了大黃魚肝臟的脂肪含量，主要是通過降低脂肪合成基因的表達，以及提高脂質(zhì)氧化基因的表達來實現(xiàn)[20]。此結果與本實驗研究結果相似，acc和dgat2 是魚類中重要的脂肪酸合成基因，cpt1 和pparα在脂肪酸的氧化分解中起重要調(diào)節(jié)作用，膽汁酸的添加可提高cpt1 和pparα基因的表達水平，同時降低acc和dgat2 的表達水平，加速脂肪的氧化分解，進而緩解黃鱔肝臟脂肪沉積。然而，過量的膽汁酸可能會破壞膽汁酸的動態(tài)平衡，并對脂類代謝產(chǎn)生相反的影響。珍珠龍膽石斑魚高脂飼料中補充300～900 mg/kg 膽汁酸可降低其肝臟甘油三酯和脂肪含量，而添加1 200～1 500 mg/kg 膽汁酸則作用相反[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)，飼料中膽汁酸添加量為250 mg/kg時，全魚粗蛋白的含量顯著高于其余各組。在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[21]中也有類似的結果。推測其可能的原因，是魚類增加了對脂肪的吸收利用，從而促進魚體自身的蛋白質(zhì)沉積。

3.3 膽汁酸對黃鱔肝臟健康的影響

血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量是評估肝臟損傷的重要指標。本研究中發(fā)現(xiàn)，添加膽汁酸的處理組的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量顯著低于對照組，且谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量隨膽汁酸添加量的增加呈先降后升趨勢，推測飼料中添加適量膽汁酸可緩解黃鱔肝臟損傷，而飼料中過量膽汁酸的添加可能導致肝臟健康受損。在尼羅羅非魚[17]和凡納濱對蝦[19]中也有相似的結果。

動物細胞的健康與氧化和抗氧化平衡相關，引起機體氧化應激的主要原因之一是機體內(nèi)活性氧(ROS)的異常增加，生成了脂質(zhì)過氧化物[22]。丙二醛的含量反映了機體脂質(zhì)過氧化物的程度，也能間接反映細胞的受損程度[23]。SOD 是生物體內(nèi)至關重要的抗氧化酶之一，可清除機體內(nèi)自由基，從而維護機體免受氧化損傷[24]。草魚飼料中，添加膽汁酸的處理組與未添加的處理組相比，SOD 活性顯著上升[25]。隨著飼料中膽汁酸添加量的增加，黃鱔肝臟中T-SOD 呈逐漸上升的趨勢。適量膽汁酸的添加可提高GSH-Px 和CAT 的活性，在膽汁酸添加量為250 mg/kg 時，二者的活性最高。肝臟中MDA 的含量呈先降低后升高的趨勢，且在BA250 組時的含量最低。在對黃鱔的研究中發(fā)現(xiàn)，膽汁酸在基因水平上正向調(diào)控氧化應激Nrf2-Keap1 通路，可以降低黃鱔腸道氧化應激反應[16]。該結果與對哺乳動物[26]中的結果一致，推測膽汁酸的抗氧化作用可能依賴于通過調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1 信號通路，進而發(fā)揮清除丙二醛和增強魚體抗氧化能力的作用。

肝臟是脂肪代謝的重要器官。研究表明，飼料中低濃度的膽汁酸添加對尼羅羅非魚的肝臟形態(tài)無顯著影響，而添加1.35 g/kg 的膽汁酸會導致其肝細胞出現(xiàn)嚴重的核遷移和空泡化現(xiàn)象[17]。飼料中添加300 mg/kg 的膽汁酸可改善大口黑鱸的肝細胞腫大和空泡化，同時降低肝臟的脂滴數(shù)量，改善肝臟脂肪蓄積情況[25]。凡納濱對蝦飼料中添加適量膽汁酸可使肝胰腺小體恢復正常，排列整齊，改善肝胰腺的健康[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量的膽汁酸可降低黃鱔肝細胞的空泡化，恢復肝臟的完整性，同時減少脂肪在肝臟中的蓄積。但過量的膽汁酸(500 mg/kg)會導致肝臟空泡數(shù)目增多，肝細胞破裂，從而導致肝臟損傷。

3.4 膽汁酸對黃鱔腸道健康的影響

本研究結果發(fā)現(xiàn)，黃鱔腸道中T-SOD 和GSH-Px 的活性隨膽汁酸添加量的增加呈先升后降的趨勢。推測飼料中適量膽汁酸的添加可提高黃鱔肝臟和腸道的抗氧化能力，過量的膽汁酸可能不一定會達到綜合抗氧化的效果，且魚體中不同的器官對膽汁酸的耐受性可能不同，因此幾種酶活性呈現(xiàn)不同的變化趨勢。

腸道是魚類消化吸收的主要場所，其腸絨毛決定消化吸收效率。研究表明，飼料中添加適量膽汁酸對魚體會產(chǎn)生積極的影響，添加適量膽汁酸可增加大口黑鱸腸道絨毛長度和杯狀細胞數(shù)量[27]。在本研究中，隨著飼料膽汁酸添加量的增加，腸道的絨毛寬度和固有層寬度呈先升后降的趨勢，在BA250 組時固有層寬度達到最高，而在BA500 組中絨毛寬度顯著低于對照組。同時BA500 組的絨毛高度顯著低于對照組，表明飼料中添加適量膽汁酸(125～375 mg/kg)可能通過改善腸道結構促進魚體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進而促進生長；但高濃度(500 mg/kg)的膽汁酸添加會對黃鱔腸道結構造成損傷，進一步影響腸道健康。

腸道健康與黏膜屏障的完整性密切相關。DAO是主要存在于腸黏膜上皮細胞內(nèi)的代謝酶，D-LA是腸道內(nèi)細菌的代謝產(chǎn)物，正常情況下二者在血清中含量極低。當腸上皮細胞損傷時，腸道黏膜被破壞，通透性增加，往往會導致DAO 和D-LA進入機體血液中，因此二者在血清中的含量通常作為評判腸道屏障功能的重要指標[28]。本實驗結果顯示，隨著飼料中膽汁酸添加量的增加，黃鱔血清中D-LA 的含量呈顯著降低的趨勢。DAO 呈先降后升的趨勢。同時，對腸道屏障具有保護和調(diào)節(jié)功能的緊密連接蛋白基因(zo1、zo2、occludin)的表達水平也呈先升后降的趨勢。綜上，推測膽汁酸適量添加可提高黃鱔腸道屏障的功能，降低腸道的通透性，而過量的膽汁酸可能造成腸道屏障的損傷。該結果與張帆等[29]對小鼠(Mus musculus)的研究結果相似，對于膽汁酸減輕機體的腸道損傷的作用可能與膽汁酸受體有關。膽汁酸受體G 蛋白偶聯(lián)受體5 (TGR5)被膽汁酸激活，TGR5激活后可減輕炎癥反應，抑制NF-κB 信號傳導，通過抑制腸道炎癥反應進而減輕腸道的損傷。

4 結論

飼料中適量添加膽汁酸可增強黃鱔肝臟和腸道抗氧化能力，降低肝臟損傷和肝脂沉積，改善腸道功能，進而提高黃鱔生長性能。以特定生長率和飼料轉(zhuǎn)化率作為評價指標，采用一元二次回歸方程得，初始均重為(23.00±0.03) g 的黃鱔飼料中膽汁酸的適宜添加量為250.0～283.3 mg/kg。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）