龔師銳， 王 同， 宋樂(lè)齡， 楊 揚(yáng),2，鐘朝岳， 陶宇浩， 劉曉春,3*

(1. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，水產(chǎn)動(dòng)物疫病防控與健康養(yǎng)殖全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶海水魚(yú)種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 ；570000；3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室 (珠海)，廣東 珠海 519080)

鞍帶石斑魚(yú)(Epinephelus lanceolatus)俗稱龍躉，隸屬于鱸形目(Perciformes)石斑魚(yú)科(Epinephelinae)，廣泛分布于印度和西太平洋的熱帶及亞熱帶水域，是重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類[1]。鞍帶石斑魚(yú)是石斑魚(yú)種類中體型最大的物種，其最大體長(zhǎng)270 cm，體重可達(dá)400 kg。由于其壽命長(zhǎng)、先雌后雄、性成熟晚和產(chǎn)卵聚集性的生物學(xué)特征，其野生種群極易受到捕撈壓力和棲息地變化的影響[2-3]。自20 世紀(jì)90 年代中期以來(lái)，由于過(guò)度捕撈，鞍帶石斑魚(yú)一直被列入世界自然保護(hù)聯(lián)盟紅色名單，并在澳大利亞、南非、印度等國(guó)受到保護(hù)(https: //www.iucnredlist.Org/)。此外，由于其在市場(chǎng)上高昂的價(jià)格和快速生長(zhǎng)的優(yōu)良性狀，已成為亞太地區(qū)最受歡迎的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一[4]，并作為各類雜交石斑魚(yú)的親本用以改良石斑魚(yú)生長(zhǎng)性狀，創(chuàng)制出多種優(yōu)良雜交組合，如棕點(diǎn)石斑魚(yú)(E.fuscoguttatus)♀×鞍帶石斑魚(yú)♂(虎龍雜交斑)[5]、云紋石斑魚(yú)(E.moara)♀×鞍帶石斑魚(yú)♂(云龍石斑魚(yú))[6]、斜帶石斑魚(yú)(E.coioides)♀×鞍帶石斑魚(yú)♂(青龍雜交斑)[7]等，其中虎龍雜交斑(GS-02-005-2016)和云龍石斑魚(yú)(GS-02-002-2018)已獲得新品種證書(shū)，并深受養(yǎng)殖戶和市場(chǎng)喜愛(ài)。

微衛(wèi)星分子標(biāo)記，即簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)，在基因組中含量豐富、具有高度的多態(tài)性，作為第2 代分子標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物雜交優(yōu)勢(shì)的預(yù)測(cè)、群體的雜合度和種質(zhì)資源保護(hù)等研究中[8]。關(guān)于微衛(wèi)星分子標(biāo)記在石斑魚(yú)種質(zhì)資源中的應(yīng)用也有相關(guān)報(bào)道。于2011 年開(kāi)展的南海斜帶石斑魚(yú)野生群體和人工繁殖群體的微衛(wèi)星分析的結(jié)果表明，斜帶石斑魚(yú)野生群體和人工繁殖群體遺傳多樣性仍比較豐富，且人工繁殖群體沒(méi)有出現(xiàn)明顯的遺傳分化和種質(zhì)退化的現(xiàn)象[9]。另外一項(xiàng)于2012 年對(duì)中國(guó)東南沿海7 個(gè)赤點(diǎn)石斑魚(yú)(E.akaara)養(yǎng)殖群體遺傳變異的研究發(fā)現(xiàn)，不同養(yǎng)殖場(chǎng)間的種群存在著豐富的遺傳多樣性，具有明顯的地理區(qū)域分布特征[10]。

物種的遺傳多樣性是其生存和進(jìn)化關(guān)鍵因素，遺傳多樣性越高，物種適應(yīng)環(huán)境變化的能力越強(qiáng)[11]。2008 年，相關(guān)研究利用RAPD (隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài) DNA，randomly amplified polymorphic DNA )技術(shù)對(duì)海南近海野生鞍帶石斑魚(yú)群體的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該野生群體仍然保持著較豐富的遺傳多樣性[12]。在此之后，關(guān)于鞍帶石斑魚(yú)種質(zhì)資源方面的研究再無(wú)相關(guān)報(bào)道。在前期的實(shí)驗(yàn)調(diào)查過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的養(yǎng)殖公司未對(duì)鞍帶石斑魚(yú)繁育親本進(jìn)行電子標(biāo)記，且由于養(yǎng)殖年限較久，在養(yǎng)殖過(guò)程中經(jīng)常搬塘混養(yǎng)，導(dǎo)致親本混雜較為嚴(yán)重，多種來(lái)源的鞍帶石斑魚(yú)混雜養(yǎng)殖，因此開(kāi)展鞍帶石斑魚(yú)繁育群體的遺傳多樣性調(diào)查更為必要。本研究采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)來(lái)自廣東、海南和福建3 個(gè)省份、5 個(gè)地理位置的鞍帶石斑魚(yú)繁育群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，為鞍帶石斑魚(yú)繁育群體種質(zhì)資源保護(hù)和遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)倫理聲明

本研究獲得了中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SYSU-IACUC-2022-B0131)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作人員嚴(yán)格遵守中山大學(xué)倫理規(guī)范，并按照中山大學(xué)倫理委員會(huì)制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

由于采樣地點(diǎn)各良種場(chǎng)鞍帶石斑魚(yú)親本養(yǎng)殖年限較久且長(zhǎng)期搬塘混養(yǎng)未作標(biāo)記，多種來(lái)源親本混雜，在前期的調(diào)研中，采樣群體多為野生捕撈親本，少數(shù)由養(yǎng)殖群體篩選而來(lái)，因此本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)養(yǎng)殖群體的采樣地點(diǎn)進(jìn)行記錄，未對(duì)原始產(chǎn)地進(jìn)行溯源。實(shí)驗(yàn)選用的150 個(gè)鞍帶石斑魚(yú)尾鰭樣品分別取自海南省東方市(感城鎮(zhèn)，GC，n=31)、海南省瓊海市(長(zhǎng)坡鎮(zhèn)，CP，n=30)、廣東省惠州市(澳頭鎮(zhèn)，AT，n=30)、福建省廈門(mén)市(湖里區(qū)，HL，n=30)和福建省廈門(mén)市(翔安區(qū)，XA，n=29)，均為繁育群體。剪取每尾魚(yú)的鰭條保存于95%無(wú)水乙醇中，隨后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室在-20 °C 冰箱保存。每個(gè)群體的采樣位置見(jiàn)圖1，詳細(xì)采集時(shí)間、地點(diǎn)和數(shù)量見(jiàn)表1。

表1 5 個(gè)養(yǎng)殖群體鞍帶石斑魚(yú)群體的采樣信息Tab. 1 Sample information of five breeding populations of E. lanceolatus

圖1 5 個(gè)鞍帶石斑魚(yú)繁育群體采樣點(diǎn)Fig. 1 Sampling sites of five breeding populations of E. lanceolatus

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

樣品DNA 的提取 參考 TIANGEN 海洋動(dòng)物組織基因組 DNA 提取試劑盒(離心柱型) (DP324)[天根生物科技(北京)有限公司] 說(shuō)明書(shū)步驟，對(duì)150 個(gè)鞍帶石斑魚(yú)尾鰭樣品進(jìn)行了基因組DNA提取。提取好的DNA 樣品使用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific，美國(guó)) 分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度；同時(shí)使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取DNA 的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。

群體擴(kuò)增 用于鞍帶石斑魚(yú)群體擴(kuò)增的引物來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星引物(表2)，引物合成在生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系如表3。PCR 反應(yīng)程序設(shè)置：95 °C預(yù)變性3 min；95 °C 變性20 s、59.5 °C 退火20 s、72 °C延伸15 s，總共35 個(gè)循環(huán)；最后72 °C 延伸5 min。PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行SSR 分型檢測(cè)。DNA 于-20 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

表3 熒光修飾引物PCR 反應(yīng)體系Tab. 3 PCR reaction system with fluorescently modified primers

數(shù)據(jù)分析 對(duì)SSR 分型檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和基因型判讀校正后，使用GenAIEx 6.502 軟件[13]計(jì)算各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)以及Nei 氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離；使用 Cervus 3.0.7 軟件[14]計(jì)算多態(tài)性信息含量(PIC)；使用使用 Arlequin version 3.5.2.2 軟件[15]基于 Pairwise differences 方法計(jì)算各群體的遺傳分化指數(shù)(Fst)，并進(jìn)行分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)；基于 Nei 氏遺傳距離 ，使用 MEGA-X version 10.1.8 軟件[16]構(gòu)建群體間的 UPGMA 進(jìn)化樹(shù)[17]。最后使用Structure Selector[18]基于ΔK[19]分析群體遺傳結(jié)構(gòu)并得到最合適K值，并繪制結(jié)果圖來(lái)評(píng)估5 個(gè)群體間的群體結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 群體內(nèi)遺傳多樣性分析

鞍帶石斑魚(yú)群體內(nèi)遺傳多樣性檢測(cè)結(jié)果顯示，來(lái)自5 個(gè)地理位置的鞍帶石斑魚(yú)繁育群體的Na為6.375～8.380，Ho為0.625～0.775，He為0.684～0.734，PIC為0.633～0.693。其中來(lái)自福建廈門(mén)翔安區(qū)的XA 群體具有最高的遺傳多樣性(He=0.734,PIC=0.693)，來(lái)自海南瓊海長(zhǎng)坡鎮(zhèn)的CP 群體具有最低的遺傳多樣性(He=0.685,PIC=0.633) (表4)。132An30位點(diǎn)引物在不同群體中最多獲得了17 個(gè)等位基因，在8 對(duì)引物中獲得的等位基因數(shù)最多。AD4-T1與AD3-T6 位點(diǎn)引物在不同群體中最多獲得了7 個(gè)等位基因，等位基因數(shù)最少。在5 個(gè)群體中，利用8 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增出的40 組數(shù)據(jù)中，有 33組數(shù)據(jù)具有高多態(tài)性 (PIC＞0.5)，5 個(gè)數(shù)據(jù)具有中等多態(tài)性(0.5＞PIC＞0.25)，2 個(gè)數(shù)據(jù)具有低多態(tài)性(0.25＞PIC)。Hardy-Weinberg 平衡的卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，5 個(gè)種群在8 個(gè)位點(diǎn)上有16 個(gè)表現(xiàn)為極顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡(PHWE＜0.01)， 8 個(gè)表現(xiàn)為顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡(PHWE＜0.05)(表5)，剩余16 個(gè)則不偏離。

表4 8 個(gè)SSR 位點(diǎn)在5 個(gè)鞍帶石斑魚(yú)繁育群體中的統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)信息Tab. 4 Summary of eight pairs of microsatellites in the five groups of E. lanceolatus

表5 鞍帶石斑魚(yú)養(yǎng)殖群體的Hardy-Weinberg 平衡卡方檢驗(yàn)Tab. 5 Hardy-Weinberg equilibrium chi-square test in five groups of E. lanceolatus

2.2 鞍帶石斑魚(yú)群體遺傳分化關(guān)系

對(duì)5 個(gè)鞍帶石斑魚(yú)群體進(jìn)行分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)，結(jié) 果 顯示5.36%的遺傳變異來(lái)自群體間，95.45%來(lái)自所有個(gè)體間，表明群體間的遺傳變異極小(表6)。GC、CP、AT、HL 和XA 群體間的Nei 氏遺傳標(biāo)準(zhǔn)距離(Ds)為0.073 7～0.324 9，屬于種間遺傳[20](0.01＜Ds＜2.0)。遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.015 7～0.085 7，群體處于中等(0.05＜Fst＜0.15)及較小(Fst＜0.05)的遺傳分化(表7)。其中HL 群體與其他4 個(gè)群體均存在中等程度分化；XA 群體與AT 群體存在中等程度分化；其他群體之間僅存在較小程度遺傳分化。

表6 基于5 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分子方差分析結(jié)果Tab. 6 Result of AMOVA based on five microsaltellite markers

表7 鞍帶石斑魚(yú)群體間的遺傳分化指數(shù) Fst(對(duì)角線下)和 Nei 氏遺傳距離(對(duì)角線上)Tab. 7 Matrix of pair-wise Fst values (below diagonal) and Nei’s genetic distance (above diagonal) between E. lanceolatus

2.3 鞍帶石斑魚(yú)群體遺傳結(jié)構(gòu)聚類分析

根據(jù) Nei 氏遺傳距離構(gòu)建的 UPGMA 聚類樹(shù)中(圖2)，GC 和 CP 群 體 聚 為 一 支，再 與 AT 群體聚為一支，然后與XA 群體聚為一支，HL 群體單獨(dú)為一支。結(jié)果與遺傳距離、Fst結(jié)果基本一致。利用Structure 軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析過(guò)程中，ΔK值的最高點(diǎn)為最可能的遺傳聚類值，ΔK峰值出現(xiàn)在集群K=4，表明5 個(gè)鞍帶石斑魚(yú)群體的預(yù)測(cè)自由交配組數(shù)為4，因此，后續(xù)分群選擇K=4 (圖3)?；谏鲜鯯tructure 的分析結(jié)果，當(dāng)K=4 時(shí)，貝葉斯分析法的聚類結(jié)果見(jiàn)圖4，表明5 個(gè)群體之間存在較強(qiáng)的基因交流。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，5 個(gè)群體交叉在一起，沒(méi)有形成明顯的地理格局分布(圖5)。

圖2 鞍帶石斑魚(yú)群體基于 Nei 氏遺傳距離構(gòu)建的UPGMA 聚類圖Fig. 2 UPGMA dendrogram based on Nei's genetic distance among E. lanceolatus

圖3 最佳聚群數(shù)K 與推斷值ΔK 之間的關(guān)系Fig. 3 Relations between the rational groups number K and estimated value ΔK

圖4 基于葉貝斯算法計(jì)算得到的鞍帶石斑魚(yú)繁育群體遺傳結(jié)構(gòu)圖 (K=4)不同顏色表示不同的集群。Fig. 4 Genetic structure Map of E. lanceolatus based on Bayesian algorithm (K=4)Different colors represent different clusters.

圖5 鞍帶石斑魚(yú)繁育群體系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 5 Phylogenetic tree of E. lanceolatus

3 討論

本研究采用實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的8 對(duì)SSR 引物，在5 個(gè)不同地點(diǎn)的鞍帶石斑魚(yú)繁育群體中進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，8 對(duì)SSR 引物擴(kuò)增效果良好，位點(diǎn)多樣性較高，表明這些微衛(wèi)星位點(diǎn)及引物可以用于鞍帶石斑魚(yú)群體的遺傳學(xué)研究。在利用擴(kuò)增后的結(jié)果對(duì)5 個(gè)種群的群體內(nèi)遺傳多樣性進(jìn)行分析的過(guò)程中，Na、Ho、He和PIC數(shù)值越大，說(shuō)明種群內(nèi)等位基因越豐富，遺傳多樣性越高，遺傳變異越大。本研究中，來(lái)自福建廈門(mén)翔安區(qū)的XA群體具有最高的遺傳多樣性(Na=8.125,He=0.734)，海南瓊海長(zhǎng)坡鎮(zhèn)的CP 群體具有最低的遺傳多樣性(Na=6.750,He=0.685)，這可能與CP 群體中有部分個(gè)體由養(yǎng)殖群體篩選而來(lái)導(dǎo)致。

PIC是指一個(gè)后代所獲得的某個(gè)等位基因標(biāo)記來(lái)自于它親代的同一個(gè)等位標(biāo)記的可能性大小，平均PIC是衡量等位基因片段多態(tài)性的理想指標(biāo)。當(dāng)PIC大于0.5 時(shí)為高度多態(tài)位點(diǎn)，0.25＜PIC＜0.5時(shí)為中度多態(tài)位點(diǎn)，PIC小于0.25 時(shí)為低度多態(tài)位點(diǎn)[21]。本研究中5 個(gè)群體的平均PIC均大于0.5，整體均值為0.659，表明鞍帶石斑魚(yú)繁育群體的遺傳多樣性仍然比較豐富。Hardy-Weinberg 平衡的卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在5 個(gè)種群的8 個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的40 個(gè)數(shù)據(jù)中，有16 個(gè)表現(xiàn)為極顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡，16 個(gè)不偏離。近年來(lái)鞍帶石斑魚(yú)的野生資源量下降，野生群體數(shù)量減少，而鞍帶石斑魚(yú)繁育群體多由自然捕撈，或者由野生種群經(jīng)人工繁育得到的群體篩選而來(lái)，這很可能是造成位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg 平衡的原因。本研究中，利用Structure 進(jìn)行的群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明群體之間存在較強(qiáng)的基因交流，這也很大程度表明了鞍帶石斑魚(yú)繁育群體可能由自然捕撈而來(lái)或還未經(jīng)多代選育，沒(méi)有形成明顯的群體分化。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，5 個(gè)群體交叉在一起，也沒(méi)有形成明顯的地理格局分布，反映出這些養(yǎng)殖的鞍帶石斑魚(yú)親本來(lái)源可能相同(均由野生捕撈而來(lái)，或者親本未經(jīng)馴化)。

繁育群體的高遺傳多樣性是維持水產(chǎn)生物經(jīng)濟(jì)性能的保障[11]。石斑魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中生產(chǎn)性能降低、病害頻發(fā)，常被懷疑是遺傳多樣性降低而導(dǎo)致。鞍帶石斑魚(yú)作為生長(zhǎng)速率最快的石斑魚(yú)，其經(jīng)濟(jì)性狀明顯，但是由于當(dāng)前鞍帶石斑魚(yú)繁育群體多來(lái)自野生捕撈，且由于鞍帶石斑魚(yú)人工繁育技術(shù)尚不成熟，多靠激素催熟，導(dǎo)致繁殖后代受精率、孵化率及養(yǎng)殖成活率都偏低[22]，在養(yǎng)殖過(guò)程中也面臨病害等各種問(wèn)題。在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，各良種繁育場(chǎng)對(duì)鞍帶石斑魚(yú)的管理存在不足，絕大多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)并未對(duì)鞍帶石斑魚(yú)進(jìn)行電子標(biāo)記，盡管了解部分個(gè)體的銷售源頭，但是繁育親本的具體來(lái)源大多模糊不清，并且由于鞍帶石斑魚(yú)生產(chǎn)期間經(jīng)常搬塘混養(yǎng)，導(dǎo)致多種來(lái)源個(gè)體混雜，難以追蹤個(gè)體具體來(lái)源。盡管本研究結(jié)果表明，鞍帶石斑魚(yú)各繁育群體都保持較高的遺傳多樣性，然而鞍帶石斑魚(yú)親本保種及選育仍是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題，需要不斷加強(qiáng)親本的源頭管控及品種優(yōu)化，關(guān)注種源的遺傳多樣性問(wèn)題。本研究的數(shù)據(jù)和微衛(wèi)星工具能夠?yàn)榧訌?qiáng)鞍帶石斑魚(yú)的種質(zhì)評(píng)價(jià)和管理提供分析方法。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）