高 磊， 孔 寧， 劉冉陽， 趙俊彥， 邢 鎮(zhèn)， 張子楊， 趙 寶，李慶嵩， 付 強， 王文彪， 李 磊， 王玲玲*， 宋林生

(1. 大連海洋大學(xué)，遼寧省海洋動物免疫學(xué)與疫病防控重點實驗室，遼寧省海洋動物免疫學(xué)重點實驗室，遼寧 大連 116023；2. 大連玉洋集團股份有限公司，遼寧 大連 116499)

長牡蠣(Crassostrea gigas)是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類，2018 年全國養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)124.11 萬t，占當(dāng)年全國牡蠣總產(chǎn)量的24.15%[1]，已成為我國北方重要的海水養(yǎng)殖品種，也是世界范圍內(nèi)養(yǎng)殖最廣泛的水產(chǎn)動物之一。然而，近十年來養(yǎng)殖長牡蠣的夏季大規(guī)模死亡現(xiàn)象時有發(fā)生。例如，2016 年大連養(yǎng)殖長牡蠣夏季死亡率為50%以上[2]，2019 年山東乳山養(yǎng)殖長牡蠣夏季死亡率達(dá)50%～90%[3]。長牡蠣夏季大規(guī)模死亡的有效防控已成為保障其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)綠色高質(zhì)量發(fā)展的重要方向。

目前研究認(rèn)為，養(yǎng)殖長牡蠣夏季大規(guī)模死亡是高溫、降雨、病原微生物、餌料藻豐度和繁殖行為等多種因素共同作用的結(jié)果[4]。例如，高溫被認(rèn)為是最重要的非生物脅迫因素之一，研究發(fā)現(xiàn)，長牡蠣夏季大規(guī)模死亡常發(fā)生在溫度較高的法國南部，而在溫度較低的法國北部則較少發(fā)生[5]。19～20 °C 是養(yǎng)殖長牡蠣夏季大規(guī)模死亡風(fēng)險發(fā)生的臨界溫度，當(dāng)夏季溫度超過19 °C 時，通過與皰疹病毒等病原脅迫的復(fù)合作用，導(dǎo)致大規(guī)模死亡的風(fēng)險迅速上升[6]。夏季降水也是養(yǎng)殖長牡蠣面臨的另一個重要非生物脅迫，其造成的鹽度降低、徑流輸入增加和水層交換易影響長牡蠣的環(huán)境滲透壓和食物組成等[7-8]。監(jiān)測長牡蠣養(yǎng)殖海區(qū)關(guān)鍵環(huán)境因子和機體健康相關(guān)指標(biāo)的變化規(guī)律，解析環(huán)境脅迫對長牡蠣糖原和免疫等指標(biāo)的影響，將有助于及時了解大規(guī)模死亡的發(fā)生風(fēng)險并進(jìn)行防控[9]。

2021 年6 月下旬至7 月下旬，大連北黃海長牡蠣養(yǎng)殖海區(qū)出現(xiàn)持續(xù)降雨和高溫天氣，其中，降雨主要集中在6 月20 日—7 月20 日，降水量共計193 mm，較常年同期增加67 mm；高溫天氣主要集中在7 月中下旬，其中7 月下旬平均氣溫26.3 °C，較常年同期升高1.8 °C (數(shù)據(jù)源自大連市氣象局)。進(jìn)入7 月下旬后，大連莊河市王家島海域養(yǎng)殖長牡蠣開始出現(xiàn)區(qū)域性死亡，死亡率達(dá)10%～30%。本實驗對7 月下旬大連莊河市王家島海域的環(huán)境因子變化進(jìn)行了調(diào)研，包括水質(zhì)因子、餌料藻和病原微生物等，檢測了長牡蠣糖原和免疫等指標(biāo)的變化規(guī)律，分析了環(huán)境脅迫可能對長牡蠣健康狀態(tài)的影響，為夏季大規(guī)模死亡防控提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究分別于2021 年7 月24 日和7 月29 日，在遼寧省大連莊河市王家島鎮(zhèn)大連玉洋集團股份有限公司長牡蠣浮筏養(yǎng)殖海區(qū)，進(jìn)行了養(yǎng)殖調(diào)查和樣品采集，包括原位水質(zhì)監(jiān)測、海水樣品采集、微生物樣品采集、長牡蠣組織及活體長牡蠣樣品采集等。根據(jù)天氣情況和養(yǎng)殖調(diào)研，7 月24 日進(jìn)行第1 次調(diào)查采樣(1T)時長牡蠣養(yǎng)殖受高溫和降雨的復(fù)合環(huán)境脅迫作用明顯，7 月29 日進(jìn)行第2次調(diào)查采樣(2T)時養(yǎng)殖過程主要受高溫脅迫影響。具體樣品采集過程：每次調(diào)查采樣時隨機選取3處長牡蠣養(yǎng)殖海域，采集3 L 未處理表層海水，在常溫條件下于4 h 內(nèi)帶回實驗室用于浮游微藻計數(shù)分析；采集3 L 表層海水加入0.1%碳酸鎂懸濁液后立即過濾至0.7 μm GF/F 濾膜，錫紙包裹濾膜后于干冰環(huán)境保存，于4 h 內(nèi)帶回實驗室用于葉綠素(Chl.a)含量分析；采集3 L 表層海水經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，于0～4 °C 下4 h 內(nèi)帶回實驗室用于水質(zhì)分析，濾膜于干冰環(huán)境保存，于4 h內(nèi)帶回實驗室用于細(xì)菌豐度分析。每次調(diào)查隨機采集18 只2 齡長牡蠣，平均體重(118.09±32.48) g，其中9 只長牡蠣于0～4 °C 條件下于4 h 內(nèi)帶回實驗室用于體內(nèi)微生物分析和腸道內(nèi)容物分析，另外9 只長牡蠣沖洗干凈外殼后，取鰓、血淋巴、肝胰腺和閉殼肌的組織樣品直接凍存或使用TRIzol 試劑保存，于4 h 內(nèi)干冰環(huán)境中帶回實驗室用于長牡蠣相關(guān)指標(biāo)分析，其中以7 月24 日和7 月29 日采集的長牡蠣組織樣品分別為1T 和2T 處理組，以5—7 月實驗室暫養(yǎng)的相同來源的長牡蠣個體為對照組(C)。本研究獲得了大連海洋大學(xué)實驗動物管理和使用倫理委員會批準(zhǔn)，實驗過程中操作人員嚴(yán)格遵守大連海洋大學(xué)倫理規(guī)范，并按照大連海洋大學(xué)倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.2 水質(zhì)分析

利用YSI 多參數(shù)水質(zhì)測定儀(美國)對表層海水溫度、溶解氧(DO)含量、pH 和鹽度(S)進(jìn)行原位監(jiān)測。依據(jù)GB 17378.4—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范》[10]，分別利用次溴酸鹽氧化法、萘乙二胺分光光度法、鋅-鎘還原法、磷鉬藍(lán)分光光度法和硅鉬藍(lán)法，對表層海水樣品的銨鹽(NH4+)、亞硝酸鹽(NO2-)、硝酸鹽(NO3-)、磷酸鹽(PO4-)和硅酸鹽(SiO3-)濃度進(jìn)行分析。

1.3 浮游微藻分析與鑒定

將GF/F 濾膜轉(zhuǎn)移至含有10 mL 90%丙酮溶液的離心管中，在4 °C 下靜置24 h 后使用分光光度法分析Chl.a濃度[11]。取1 L 未過濾的表層海水樣品加入10 mL Lugo 氏溶液固定濃縮后用于浮游微藻鑒定和計數(shù)[12]。

1.4 細(xì)菌豐度分析

分別利用EZNATMWater DNA Kit 和EZNATMSoil DNA Kit (OMEGA Bio-Tek，美國)提取表層海水樣品和長牡蠣鰓組織樣品DNA。使用Nano-Drop 2000 分光光度計(丹麥)檢測提取的DNA 質(zhì)量合格后用于熒光定量PCR (qRT-PCR)分析。建立細(xì)菌總數(shù)和弧菌(Vibrio)的絕對定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線，構(gòu)建待測基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，測序驗證后測定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度，計算拷貝數(shù)后梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，作為模板進(jìn)行qRT-PCR 檢測。對于牡蠣皰疹病毒(OSHV-1)拷貝數(shù)檢測，定義Ct＜30 為陽性。在對表層海水樣品的細(xì)菌豐度進(jìn)行分析時，以7月24 日和7 月29 日采集的表層海水樣品分別為1T 和2T 處理組，以2021 年6 月21 日(夏季環(huán)境脅迫發(fā)生前)采集的相同海域的表層海水樣品作為對照組(C)。細(xì)菌豐度分析所用引物見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息Tab. 1 Primer information

1.5 組織糖原和葡萄糖含量分析

取長牡蠣肝胰腺和閉殼肌組織各0.1 g 置于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，冰水浴條件下用勻漿機制成組織勻漿(10%，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))，在4 °C、2 500 r/min 下離心10 min，取上清液進(jìn)行檢測。使用生化檢測試劑盒(編號：BC0345，北京索萊寶科技有限公司)測定糖原含量，使用生化檢測試劑盒(編號：F006-1-1，南京建成生物工程研究所)測定葡萄糖含量。

1.6 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)分析

取長牡蠣鰓組織0.1 g 置于PBS 中，冰水浴條件下用勻漿機制成組織勻漿(10%，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))，在4 °C、2 500 r/min 下離心10 min，取上清液檢測。使用南京建成生物工程研究所生化檢測試劑盒(試劑盒編號：A003-1-2、A015-1-2、A001-3-2、A007-1-1、A006-2-1、A084-1-1)分別測定丙二醛(MDA)含量，總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性和還原型谷胱甘肽(GSH)含量。

1.7 免疫相關(guān)指標(biāo)分析

采用TRIzol 法提取長牡蠣血淋巴細(xì)胞總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性，利用NanoDrop 2000 檢測RNA 濃度和純度，反轉(zhuǎn)RNA合成cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 分析(表1)，以延伸因子基因(EF)作為內(nèi)參基因，利用2-△△CT算法分析免疫相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)量[13]。

1.8 腸道內(nèi)容物分析

解剖采集的活體長牡蠣樣品，用無菌海水將軟體部沖洗干凈，去除外套膜、鰓和閉殼肌組織，保留肝胰腺等主要組織，延縱向進(jìn)行解剖，觀察長牡蠣的腸道食物和糞便等殘留情況。實驗以正常攝食和饑餓2 d 的長牡蠣個體作為對照進(jìn)行分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

本研究中實驗樣品均設(shè)置3 個平行。利用SPSS 26 軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 水質(zhì)因子變化

大連莊河市王家島長牡蠣養(yǎng)殖海域7 月下旬水質(zhì)因子分析結(jié)果顯示，2 次調(diào)查的海區(qū)表層水溫分別為25.3 和24.9 °C，養(yǎng)殖籠下緣(約水下5 m)的水溫分別為24.1 和23.1 °C，較表層低1～2°C。第2 次調(diào)查的DO 為5.83 mg/L，低于第1 次調(diào)查的7.24 mg/L。兩次調(diào)查的S 分別為26.41 和27.87，第2 次調(diào)查的S 較第1 次調(diào)查水平有所升高。表層海水pH 相對穩(wěn)定，兩次調(diào)查的檢測結(jié)果分別為7.69 和7.75 (表2)。

表2 表層海水水質(zhì)因子變化Tab. 2 Water quality variation in surface seawater

2.2 Chl.a 濃度、浮游微藻與腸道內(nèi)容物變化

表層海水Chl.a濃度在兩次調(diào)查期間出現(xiàn)顯著差異(P＜0.05)，由第1 次調(diào)查的1.448 μg/L 升至第2 次 調(diào) 查 的5.505 μg/L，增 加 至3.8 倍(表3)。通過對餌料藻(主要為硅藻和甲藻)的分析發(fā)現(xiàn)，第1 次調(diào)查時硅藻豐度約為3.6×103個/L，優(yōu)勢種為舟形藻(Naviculasp.)；甲藻豐度約為1.3×104個/L，優(yōu)勢種為叉狀角藻(Ceratiumsp.)和夜光藻(Noctilucasp.)。第2 次調(diào)查時硅藻豐度約為3.0×103個/L，優(yōu)勢種為大型硅藻，如圓篩藻(Coscinodiscussp.)和角毛藻(Chaetocerossp.)等；甲藻豐度約為4.0×103個/L，優(yōu)勢種多為小型甲藻(圖版Ⅰ)。長牡蠣腸道內(nèi)容物分析結(jié)果顯示，饑餓2 d 的對照組長牡蠣腸道內(nèi)壁光滑，未見食物和糞便，2次調(diào)查的長牡蠣樣品腸道內(nèi)壁呈淡綠色，且可見糞便(圖版Ⅱ，圖內(nèi)紅圈)。

圖版 I 表層海水中的餌料藻與甲藻鑒定1. 叉狀甲藻，2. 夜光藻，3. 小環(huán)藻，4. 圓篩藻，5. 叉狀甲藻，6. 原甲藻。Plate I Identification of bait algae and dinoflagellates in surface seawater 1. Ceratium, 2. Noctiluca, 3. Cyclotella, 4. Coscinodiscus, 5. Ceratium, 6. Prorocentrum.

表3 表層海水Chl.a 濃度和浮游微藻豐度變化Tab. 3 Variation of Chl.a concentration and planktonic microalgae abundance in surface seawater

2.3 病原微生物變化

通過表層養(yǎng)殖水體浮游細(xì)菌豐度分析發(fā)現(xiàn)，第1 次調(diào)查時水體細(xì)菌總豐度為2.10×109個/L，顯著低于入夏前的對照組水平(3.62×1010個/L)(P＜0.05)，第2 次調(diào)查時水體細(xì)菌總豐度恢復(fù)至接近對照組水平(2.77×1010個/L) (圖1-a)。與水體細(xì)菌總豐度變化不同，在兩次調(diào)查中水體弧菌豐度分別為3.37×108和5.40×108個/L，均顯著高于對照組水平(P＜0.05) (圖1-b)。對長牡蠣鰓組織中細(xì)菌豐度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，第1 次調(diào)查時鰓組織細(xì)菌總豐度為6.73×109個/g，顯著高于室內(nèi)暫養(yǎng)的對照組長牡蠣水平(3.53×108個/g) (P＜0.05)，第2 次調(diào)查時鰓組織細(xì)菌總豐度恢復(fù)至接近對照組水平(3.62×108個/g) (圖1-c)。在兩次調(diào)查中鰓組織弧菌豐度均與對照組水平差異不顯著(圖1-d)。此外，分析了兩次調(diào)查的水體和鰓組織樣品中是否含有OSHV-1，結(jié)果均為陰性。

圖1 表層海水和長牡蠣鰓中細(xì)菌總豐度和弧菌豐度的變化(a) 表層海水中細(xì)菌總豐度，(b) 表層海水中弧菌豐度，(c) 長牡蠣鰓組織中細(xì)菌總豐度，(d) 長牡蠣鰓組織中弧菌豐度；1. 對照處理C，2. 處理組1T，3. 處理組2T，不同字母表示差異顯著(P＜0.05)，下同。Fig. 1 The abundance variation of total bacteria and Vibrio in the surface seawater and the gill of C. gigas(a) total bacterial abundance in the surface seawater, (b) Vibrio abundance in the surface seawater, (c) total bacterial abundance in the gill of C. gigas, (d)Vibrio abundance in the gill of C. gigas; 1. control group, 2. 1T group, 3. 2T group, different letters indicate significant difference (P＜0.05), the same below.

圖版 II 長牡蠣腸道內(nèi)容物的解剖觀察1. 饑餓2 d 對照組長牡蠣，2. 第1 次調(diào)查采集長牡蠣，3. 第2 次調(diào)查采集長牡蠣。Plate II View of intestinal contents after dissection 1. the oyster in the control group with two-day starvation, 2. the oyster from the 1st survey, 3. the oyster from the 2nd survey.

2.4 組織糖原和葡萄糖含量變化

長牡蠣肝胰腺和閉殼肌組織糖原含量在兩次調(diào)查期間與室內(nèi)暫養(yǎng)的對照組長牡蠣相比呈下降趨勢：肝胰腺糖原含量在兩次調(diào)查時分別為40.96 和31.58 mg/g，第2 次調(diào)查時的肝胰腺糖原含量顯著低于對照組(P＜0.05) (圖2-a)；閉殼肌糖原含量在2 次調(diào)查時分別為6.63 和8.91 mg/g，均顯著低于對照組(P＜0.05) (圖2-b)。肝胰腺葡萄糖含量在第1 次調(diào)查時為26.64 nmol/g，顯著低于對照組(P＜0.05)，在第2 次調(diào)查時恢復(fù)至對照組水平(圖2-c)；閉殼肌葡萄糖含量在兩次調(diào)查中與對照組相比無顯著變化(圖2-d)。

圖2 長牡蠣閉殼肌和肝胰腺中糖原和葡萄糖含量變化(a)肝胰腺糖原含量，(b)閉殼肌糖原含量，(c)肝胰腺葡萄糖含量，(d)閉殼肌葡萄糖含量。Fig. 2 The content variation of glycogen and glucose in the hepatopancreas and adductor muscle of C. gigas(a) glycogen in hepatopancreas, (b) glycogen in adductor muscle, (c) glucose in hepatopancreas, (d) glucose in adductor muscle.

2.5 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化

在兩次調(diào)查過程中，MDA 含量分別為13.74和8.69 nmol/mg prot，與室內(nèi)暫養(yǎng)的對照組長牡蠣和第2 次調(diào)查相比，第1 次調(diào)查的MDA 含量偏高但差異不顯著(圖3-a)。T-AOC 含量分別為0.46和0.77 U/mg prot，較對照組顯著降低(P＜0.05)，且第2 次調(diào)查的T-AOC 較第1 次調(diào)查顯著升高(P＜0.05) (圖3-b)。SOD 活性分別為165.11 和159.95 U/mg prot，與對照組相比差異不顯著(圖3-c)。CAT 活性分別為1.59 和0.79 U/mg prot，與對照組和第1 次調(diào)查相比，第2 次調(diào)查的CAT 活性顯著降低(P＜0.05) (圖3-d)。GSH 含量分別為110.89和74.51 μmol/g prot，與對照組相比差異不顯著(圖3-e)。POD 活性分別為26.21 和14.57 U/mg prot，第1 次調(diào)查的POD 活性較對照組和第2 次調(diào)查數(shù)據(jù)顯著升高(P＜0.05) (圖3-f)。

圖3 長牡蠣鰓中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化(a) MDA 含量，(b) T-AOC 含量，(c) SOD 活性，(d) CAT 活性，(e) GSH 含量，(f) POD 活性。Fig. 3 The variation of the parameters related to oxidative stress in the gill of C. gigas(a) content of MDA, (b) content of T-AOC, (c) SOD activity, (d) CAT activity, (e) content of GSH, (f) POD activity.

2.6 免疫相關(guān)指標(biāo)的變化

在2 次調(diào)查過程中，CgIL17-5 的mRNA 相對表達(dá)量分別為21.97 和10.57，均顯著高于室內(nèi)暫養(yǎng)的對照組長牡蠣(P＜0.05)，且第2 次調(diào)查的CgIL17-5 的mRNA 表達(dá)量較第1 次調(diào)查顯著下降(P＜0.05) (圖4-a)。CgCaspase3 的mRNA 表達(dá)量在兩次調(diào)查中呈升高趨勢，但與對照組相比差異不顯著(圖4-b)。CgTNF-1 的mRNA 表達(dá)量在第1次調(diào)查時為7.06，顯著高于對照組(P＜0.05)，在第2 次調(diào)查時為0.14，較第1 次調(diào)查顯著降低(P＜0.05) (圖4-c)。CgTNF-2 的mRNA 表達(dá)量在第1 次調(diào)查時為0.92，與對照組相比差異不顯著，在第2 次調(diào)查時為0.34，較第1 次調(diào)查顯著降低(P＜0.05) (圖4-d)。

圖4 長牡蠣血淋巴細(xì)胞中免疫應(yīng)答相關(guān)基因mRNA 表達(dá)變化(a) CgIL17-5 mRNA 相對表達(dá)量，(b) CgCaspase3 mRNA 相對表達(dá)量，(c) CgTNF-1 mRNA 相對表達(dá)量，(d) CgTNF-2 mRNA 相對表達(dá)量。Fig. 4 The variation of the mRNA expression levels of immune genes in the haemocytes of C. gigas(a) CgIL17-5 mRNA relative expression, (b) CgCaspase3 mRNA relative expression, (c) CgTNF-1 mRNA relative expression, (d) CgTNF-2 mRNA relative expression.

3 討論

環(huán)境脅迫是導(dǎo)致北黃海長牡蠣養(yǎng)殖夏季大規(guī)模死亡發(fā)生的重要原因。本實驗首先分析了夏季北黃海貝類養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境因子的變化水平，包括溫度、DO、鹽度和營養(yǎng)鹽等水質(zhì)因子。在溫度方面，通過對大連莊河市王家島長牡蠣養(yǎng)殖海域的兩次調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，在夏季高溫氣象特征發(fā)生期間，表層海水溫度較正常水平偏高，已形成高溫脅迫，易造成養(yǎng)殖長牡蠣的大規(guī)模死亡[14]。在DO 方面，伴隨表層海水溫度升高，第2 次調(diào)查的表層海水DO 明顯低于第1 次調(diào)查和正常水平，這在夏季高溫期較為常見[14]，但還未形成低氧脅迫。在鹽度方面，受夏季持續(xù)降雨影響，通過直接作用和間接徑流注入的方式使海水鹽度明顯低于正常水平[15]，雖然還未形成長牡蠣滲透壓脅迫，但可能對水體微生物種群結(jié)構(gòu)造成影響。在營養(yǎng)鹽方面，高溫和降雨等夏季環(huán)境脅迫對表層海水營養(yǎng)鹽含量的影響不明顯，營養(yǎng)鹽水平均符合《海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3097—1997)規(guī)定的第二類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[16]，未出現(xiàn)富營養(yǎng)化或貧營養(yǎng)化現(xiàn)象，但與張廣帥等[17]于2018 年的調(diào)查數(shù)據(jù)相比偏高，可能是由不同季節(jié)的養(yǎng)殖活動和藻類影響造成的[18]。因此，在2021 年夏季典型高溫和降雨集中發(fā)生時期，貝類養(yǎng)殖區(qū)主要表現(xiàn)為溫度脅迫和鹽度下降，未出現(xiàn)DO 和營養(yǎng)鹽等其他環(huán)境脅迫。

養(yǎng)殖水體中的浮游微藻是長牡蠣主要的食物來源之一，在本研究的兩次調(diào)查中，Chl.a濃度呈上升趨勢，可能是受降雨后不同水層營養(yǎng)鹽交換加快和高溫期充足光照的影響。通過分析腸道內(nèi)容物，未發(fā)現(xiàn)長牡蠣攝食狀態(tài)異常，腸道內(nèi)容物較少可能是由于在運輸過程中部分食物被消化以及糞便排出造成的。然而，兩次調(diào)查中的浮游硅藻豐度遠(yuǎn)低于2005—2015 年北黃海硅藻豐度的平均水平[19]，提示養(yǎng)殖海區(qū)硅藻等餌料藻嚴(yán)重不足，局部養(yǎng)殖密度過大和養(yǎng)殖模式單一可能是導(dǎo)致長牡蠣養(yǎng)殖海區(qū)餌料藻不足的主要原因[20]。雖然在兩次調(diào)查中硅藻/甲藻豐度比呈上升趨勢，但仍觀察到較多的甲藻包囊，且第2 次調(diào)查時發(fā)現(xiàn)甲藻種群多樣性明顯增加，提示夏季環(huán)境脅迫期間存在甲藻暴發(fā)風(fēng)險。

因環(huán)境變化導(dǎo)致的病原菌等細(xì)菌豐度和種群結(jié)構(gòu)改變，是造成養(yǎng)殖長牡蠣夏季大規(guī)模死亡發(fā)生的重要生物脅迫因素。在水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，浮游細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)易受環(huán)境影響而發(fā)生變化，水體細(xì)菌豐度變化與養(yǎng)殖動物的疾病發(fā)生存在密切聯(lián)系。在本研究中，夏季高溫和降雨等環(huán)境變化對養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌豐度造成了明顯影響，導(dǎo)致細(xì)菌總豐度顯著降低以及弧菌豐度顯著升高，其中細(xì)菌總豐度在第2 次調(diào)查時恢復(fù)到對照組水平，而弧菌豐度在兩次調(diào)查中均高于對照組水平。自然海區(qū)弧菌豐度在夏季高溫期易出現(xiàn)上升[21-22]，本研究結(jié)果提示，水環(huán)境存在細(xì)菌豐度和種群結(jié)構(gòu)的變化以及潛在病原菌——弧菌的暴發(fā)風(fēng)險，在夏季應(yīng)重點關(guān)注弧菌豐度及弧菌/細(xì)菌總豐度比的變化情況。組織共生微生物廣泛參與宿主的生理、代謝、營養(yǎng)吸收和免疫防御等功能，共生微生物的種群結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)是宿主正常行使生理功能的保障，其異常變化常導(dǎo)致宿主代謝紊亂和免疫應(yīng)激等問題[23-24]。在本研究中，長牡蠣鰓組織細(xì)菌總豐度在第1 次調(diào)查時上升，在第2 次調(diào)查時恢復(fù)至對照組水平，而鰓組織弧菌豐度未發(fā)生明顯變化。研究結(jié)果提示，夏季環(huán)境變化導(dǎo)致長牡蠣共生微生物豐度和組成結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但仍處于可控狀態(tài)，未造成共生微生物紊亂[25]。

能量儲存和代謝水平與長牡蠣的環(huán)境脅迫抗性密切相關(guān)[26]，能量儲存不足等因素易造成長牡蠣抗脅迫能力減弱，導(dǎo)致?lián)p傷或死亡。糖原是動物能量儲存的主要形式之一，常在肝臟和肌肉中發(fā)現(xiàn)，通過分解為葡萄糖來供給能量。在牡蠣中糖原含量隨季節(jié)變化，在繁殖期會因性腺發(fā)育和產(chǎn)卵行為而加速消耗[27]。在本研究中，長牡蠣的肝胰腺和閉殼肌糖原含量均出現(xiàn)下降，一方面可能受高溫和降雨等夏季環(huán)境脅迫的影響[28]，另一方面，繁殖季節(jié)能量需求增加也是導(dǎo)致糖原含量下降的重要原因。葡萄糖是組織糖原的分解產(chǎn)物，能夠直接用于糖酵解并為機體提供ATP[29]。在本研究中，除第1 次調(diào)查時肝胰腺葡萄糖含量出現(xiàn)下降外，其他檢測結(jié)果未發(fā)現(xiàn)組織葡萄糖含量的明顯變化，這可能來自于組織能量供給過程中的穩(wěn)態(tài)需求。研究結(jié)果提示，在夏季出現(xiàn)環(huán)境脅迫和繁殖行為時，應(yīng)特別關(guān)注長牡蠣糖原等能量存儲水平的變化。

環(huán)境和病原脅迫常引發(fā)生物體的抗氧化反應(yīng)，產(chǎn)生氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)能夠有效反映機體的應(yīng)激水平和抗氧化能力。MDA 是過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，其含量可反映機體的活性氧自由基和脂質(zhì)的過氧化水平, 從而間接反映細(xì)胞的受損傷程度[30]。在本研究中，MDA 含量在第1 次調(diào)查時出現(xiàn)升高，在第2 次調(diào)查時恢復(fù)至對照組水平，說明在第1 次調(diào)查時機體受環(huán)境脅迫影響出現(xiàn)輕度氧化應(yīng)激反應(yīng)，這與已有報道一致[31]。T-AOC能夠反映機體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)對外來刺激的代償能力以及機體自由基的代謝狀態(tài)[32]。在本研究中，T-AOC 的變化規(guī)律與MDA 含量變化規(guī)律相反，即在第1 次調(diào)查時降低而在第2 次調(diào)查時升高，其變化規(guī)律說明機體在第1 次調(diào)查時抗氧化酶和非酶促系統(tǒng)代謝水平較弱，而在第2 次調(diào)查時增強。4 種抗氧化酶呈現(xiàn)特異性變化規(guī)律，可能與不同抗氧化酶的功能特性有關(guān)。研究結(jié)果提示，在本研究的夏季高溫和降雨等環(huán)境脅迫發(fā)生時，長牡蠣組織出現(xiàn)了明顯的抗氧化反應(yīng)，并形成了輕度氧化應(yīng)激。

免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡是長牡蠣響應(yīng)病原和環(huán)境脅迫的主要手段之一。CgIL17-5、CgTNF-1 和CgTNF-2 是長牡蠣免疫過程的重要細(xì)胞因子，直接參與機體免疫應(yīng)答和調(diào)控[33]。在本研究中，CgIL17-5 和CgTNF-1 的mRNA 表達(dá)量均在第1次調(diào)查時劇烈升高，在第2 次調(diào)查時回落，說明在第1 次調(diào)查時由于高溫和降雨復(fù)合脅迫的影響導(dǎo)致長牡蠣出現(xiàn)較強的免疫應(yīng)激，而隨著環(huán)境脅迫的緩和，在第2 次調(diào)查時免疫應(yīng)激狀態(tài)有所減弱。CgTNF-2 的mRNA 表達(dá)量在第2 次調(diào)查時下降，具體原因還需結(jié)合其功能特異性進(jìn)一步研究。CgCaspase3 是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶之一，是長牡蠣凋亡過程的重要功能分子。在本研究中，CgCaspase3 的mRNA 表達(dá)量升高，但與對照組相比差異不顯著，說明在夏季環(huán)境脅迫發(fā)生時，長牡蠣機體已啟動凋亡程序，但還未發(fā)生嚴(yán)重的凋亡反應(yīng)[34]。

綜上，通過分析夏季高溫和降雨等典型天氣發(fā)生時期的長牡蠣養(yǎng)殖海區(qū)關(guān)鍵環(huán)境因子和機體健康相關(guān)指標(biāo)的變化規(guī)律，初步探明了夏季北黃海長牡蠣的養(yǎng)殖特征：2021 年北黃海貝類養(yǎng)殖區(qū)在經(jīng)歷6—7 月夏季高溫降雨期后出現(xiàn)水溫升高和鹽度降低現(xiàn)象，硅藻豐度較往年平均水平下降而甲藻多樣性增加，細(xì)菌總豐度較入夏前水平降低而弧菌豐度顯著升高。與室內(nèi)暫養(yǎng)對照組長牡蠣相比，海區(qū)養(yǎng)殖長牡蠣的糖原含量下降，并發(fā)生輕度氧化應(yīng)激。研究結(jié)果有助于進(jìn)一步理解夏季養(yǎng)殖環(huán)境的變化規(guī)律和長牡蠣機體響應(yīng)特征，為預(yù)防夏季大規(guī)模死亡發(fā)生提供理論依據(jù)和參考。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）