孫聞婧， 陳傳悅,2， 梁澤瑋， 廖 智，嚴(yán)小軍,2， 張曉林*

(1. 浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江 舟山 316022；2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)是我國重要的海產(chǎn)貝類養(yǎng)殖品種，個體大，肉肥味美，營養(yǎng)價值高[1]。其主要分布于我國黃、渤海和東海沿岸，以浙江省資源量最大。位于浙江北部的嵊泗縣枸杞島是我國最大的厚殼貽貝養(yǎng)殖區(qū)，該海域厚殼貽貝養(yǎng)殖面積約1 500 hm2，產(chǎn)量高達(dá)20 余萬t[2-3]。然而，隨著日益增長的市場需求和經(jīng)濟利益的驅(qū)使，為了提高產(chǎn)量，厚殼貽貝的養(yǎng)殖密度不斷增加，海域資源無法滿足貽貝快速生長的需求，再加上季節(jié)變化等自然因素的影響，養(yǎng)殖海區(qū)經(jīng)常出現(xiàn)食物嚴(yán)重缺乏的現(xiàn)象，導(dǎo)致厚殼貽貝遭受短期或長期饑餓的脅迫[4-5]。已有相關(guān)研究顯示厚殼貽貝在饑餓脅迫下足絲蛋白合成減少，導(dǎo)致附著強度減弱[6]，此外，長期饑餓脅迫也會導(dǎo)致肥滿度下降，空殼率增加，肉質(zhì)降低，嚴(yán)重影響貽貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益和高品質(zhì)發(fā)展。因此，探究厚殼貽貝饑餓下的生理生化響應(yīng)和分子適應(yīng)機制對合理規(guī)劃貽貝養(yǎng)殖密度，有效利用海區(qū)餌料資源，促進厚殼貽貝養(yǎng)殖業(yè)的健康高效發(fā)展提供參考。

有研究發(fā)現(xiàn)，饑餓脅迫對水生生物的生長發(fā)育和代謝均有一定影響，饑餓會引起水生生物的卵細(xì)胞和精子數(shù)量降低，嚴(yán)重影響性腺的發(fā)育和成熟，如日本大鮑(Haliotis gigantea)在攝食水平較低的情況下，隨著性腺成熟度的降低，卵子數(shù)目也會顯著下降[7]。雄性斑馬魚(Danio rerio)的性腺組織結(jié)構(gòu)在饑餓脅迫下嚴(yán)重受損，精子發(fā)生受阻，精原細(xì)胞和精母細(xì)胞比例增加，成熟精子比例顯著降低[8]。此外，饑餓也會導(dǎo)致動物組織的生理狀態(tài)的改變，如光倒刺鲃(Spinibarbus hollandi)在饑餓脅迫下細(xì)胞分裂處于完全停滯狀態(tài)，盡可能地維持當(dāng)下的狀態(tài)而減少過多的能量損耗[9]。虹鱒(Oncorhynchus mykiss)肝臟中的己糖激酶活性在饑餓14 d 后顯著降低[10]。草魚(Ctenopharyngodon idella)在長期饑餓下其丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活性均極顯著下降[11]。異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)在饑餓期間與葡萄糖異生有關(guān)的酶(PEPCK、FBPase 和G6Pase)的表達(dá)量均上調(diào)[12]。目前關(guān)于饑餓脅迫對水生生物的影響研究主要集中在魚類，而對具有重要經(jīng)濟價值貝類的研究較缺乏。因此，探究饑餓脅迫下貽貝的代謝變化對于解析貝類等軟體動物對饑餓脅迫的生理響應(yīng)和調(diào)控機制具有積極的指導(dǎo)意義。

性腺組織是貽貝生殖發(fā)育最為關(guān)鍵的器官，也是貽貝體內(nèi)最大的可食用部分，性腺的肥滿度直接關(guān)系到貽貝的品質(zhì)和繁育。貽貝短期饑餓下的代謝變化和分子響應(yīng)已有研究。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，貽貝在短期饑餓下首先通過消耗自身儲存的葡萄糖提供能量，然后激活細(xì)胞自噬途徑加強能量的回收能力，從而提高貽貝體內(nèi)平衡和穩(wěn)定[4]。長期饑餓脅迫下的生存代謝和分子調(diào)控機制尚不清楚。因此，探究長期饑餓脅迫對貽貝代謝和基因表達(dá)調(diào)控的影響有利于揭示其饑餓脅迫下的分子適應(yīng)機制，以提供有效的應(yīng)對饑餓策略，從而提高貽貝產(chǎn)品的品質(zhì)和經(jīng)濟價值。

本研究以厚殼貽貝為對象，在實驗室條件下進行長達(dá)90 d 的饑餓處理，處理結(jié)束后首先統(tǒng)計厚殼貽貝在饑餓90 d 的存活率，然后取其性腺組織進行能量代謝相關(guān)酶[己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)等] 活性的測定，以明確饑餓狀態(tài)下其能量代謝的變化，最后通過Illumina Hiseq X10 高通量測序技術(shù)分析饑餓處理下性腺組織的轉(zhuǎn)錄組變化，以期揭示厚殼貽貝饑餓脅迫下的基因表達(dá)差異及其調(diào)控通路的改變，闡明其饑餓脅迫下的分子調(diào)控機制。本實驗的結(jié)果可為厚殼貽貝適應(yīng)饑餓脅迫的能量分配機制與生理對策提供參考數(shù)據(jù)，同時也為合理有效地規(guī)劃貽貝養(yǎng)殖密度、促進貽貝產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展提供思路。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

成年2 齡厚殼貽貝采集自舟山市嵊泗縣枸杞島養(yǎng)殖基地，體長(10±2) cm，于充分曝氣的人工海水中暫養(yǎng)1 周，控制溫度為(18±2) °C，鹽度28±1，每天換水1 次。貽貝隨機分為兩組：饑餓組和對照組，每組200 只。對照組每日正常喂養(yǎng)螺旋藻2 次，換水1 次，饑餓組在實驗期間不進行任何投喂，僅每日換水1 次[13]。實驗90 d 后參考Liu 等[14]采用混樣的方法消除個體間的差異進行取樣，饑餓組和對照組各取6 個性腺組織樣品，每2 個樣品等量混合為一管，液氮速凍后置于-80°C 冰箱保存?zhèn)溆茫拷M3 個生物學(xué)重復(fù)。本研究獲得了浙江海洋大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(審批號：2023030)，實驗過程中操作人員嚴(yán)格遵守浙江海洋大學(xué)動物倫理委員會倫理規(guī)范，并按照浙江海洋大學(xué)動物倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.2 存活率的計算

觀察貽貝貝殼是否張開，若發(fā)現(xiàn)貝殼張開，用手指觸碰貽貝無閉合反應(yīng)，判定為已經(jīng)死亡。為準(zhǔn)確記錄實驗過程中饑餓組和對照組貽貝的存活率，本次使用樣本數(shù)兩組各200 只。按下式計算貽貝存活率(RS，%)：

式中，n1為初始貽貝數(shù)(只)，n2為死亡數(shù)(只)[15]。

1.3 酶活性測定

取饑餓組和對照組貽貝性腺組織，加入預(yù)冷的PBS 緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)，經(jīng)冰浴勻漿后，4 °C 1 000×g離心10 min，取上清液用于酶活性檢測，使用BCA 試劑盒(TaKaRa，貨號：T9300A)測定其中的蛋白濃度。HK、SDH、PFK、MDH和PEPCK 活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，具體測定方法參照試劑盒說明書進行。

1.4 總RNA 提取、文庫構(gòu)建和測序

從-80 °C 的冰箱中取出保存的性腺組織，剪碎，研缽提前預(yù)冷，加入液氮和組織一并研磨成粉末狀。根據(jù)Total RNA Extractor (Trizol)試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)使用說明，對所取性腺樣品進行總RNA 提取。用超微量核酸蛋白定量儀檢測RNA 濃度，瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性以及基因組污染情況。并且通過Agilent 2100 bioanalyzer 對RNA 樣品進行質(zhì)控，檢測RNA 完整性。

由北京諾禾致源科技股份有限公司完成cDNA 文庫構(gòu)建以及測序，建庫用試劑盒為NEBNext?Ultra? RNA Library Prep Kit for Illumina?。文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0 Fluorometer 軟件進行初步定量，稀釋文庫至1.5 ng/μL，隨后使用Agilent 2 100 bioanalyzer 對文庫的insert size 進行檢測，insert size 符合預(yù)期后，qRT-PCR 對文庫有效濃度進行準(zhǔn)確定量(文庫有效濃度高于2 nmol/L)，以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機數(shù)據(jù)量的需求pooling 后進行Illumina 測序。測序平臺使用Illumina Hiseq ×10 (Illumina，美國)，S4 套組組件。測序片段被高通量測序儀測得的圖像數(shù)據(jù)經(jīng)CASAVA 堿基識別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(reads)，文件為fastq 格式，其中主要包含測序片段的序列信息以及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)處理和注釋

測序獲得的原始數(shù)據(jù)去除帶接頭的、無法確定堿基信息的以及低質(zhì)量的reads，以保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量和可靠性。使用HISAT2 軟件將clean reads 與厚殼貽貝參考基因組進行快速精確比對，獲取Reads 在參考基因組上的定位信息。參考基因和基因組注釋文件下載自NCBI 網(wǎng)站(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_011752425.2/)。所獲得的clean reads 用StringTie 軟件進行組裝拼接。將貽貝參考基因組轉(zhuǎn)錄本序列分別與GO、KEGG、KO 和PPI 等數(shù)據(jù)庫進行比對注釋，從而全面獲得注釋信息。

1.6 差異表達(dá)基因

使用subread 軟件中的Feature Counts 工具對基因進行定量分析。根據(jù)基因比對在參考基因組上的位置信息，從而統(tǒng)計每個基因(包括新預(yù)測基因)從起始到終止范圍內(nèi)覆蓋的reads 數(shù)。分別過濾掉比對質(zhì)量值低于10 的reads，非成對比對上的reads，比對到基因組多個區(qū)域的reads。通過DESeq2 軟 件 在P＜0.05 且|log2(Fold Change)|≥1、Padj≤0.05 條件下進行饑餓脅迫的差異顯著性分析[16]。采用Cluster Profiler 軟件對差異基因集進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，以Padj＜0.05 作為顯著性富集的閾值。

1.7 實時熒光定量PCR 驗證

隨機選取14 個顯著差異表達(dá)的基因進行熒光定量PCR 驗證，包括5 個上調(diào)和9 個下調(diào)基因。熒光定量PCR 引物設(shè)計和合成均由上海生工生物工程股份有限公司完成。基因名稱和引物序列見表1，β-actin 作為內(nèi)參基因。每個基因進行3 次平行實驗，采用2-ΔΔCt相對定量法計算基因的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab. 1 Primer sequences used in qRT-PCR

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。使用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析，并使用單因素方差分析(One-Way ANOVA)中的Duncan 氏進行多重比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長期饑餓下貽貝的存活率

與對照組相比，饑餓組貽貝的存活率隨饑餓時間的延長呈不斷下降趨勢。在實驗的0～8 d，兩組貽貝存活率均為100%，饑餓組從實驗第9 天開始出現(xiàn)死亡，且實驗第9～35 天饑餓組貽貝存活率顯著下降(P＜0.05)，最低值達(dá)到87%。在實驗第36～90 天，饑餓組貽貝存活率變化不顯著(P＞0.05)，第60 天時饑餓組存活率達(dá)到最低86%，隨后保持不變直至實驗結(jié)束。對照組存活率呈下降趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)，在實驗第60 天時，存活率達(dá)到最低值96%后保持穩(wěn)定(圖1)。

圖1 不同饑餓時間下饑餓組和對照組厚殼貽貝的存活率Fig. 1 Survival rate of M. coruscus in starvation and control group at different starvation times

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計及參考基因組比對

通過對對照組和饑餓組的厚殼貽貝性腺組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，分別平均獲得46 519 559 和46 310 607 條原始數(shù)據(jù)。堿基質(zhì)量及組成分析顯示，GC 含量區(qū)間為36.49%～37.45%，各樣品Q20堿基百分比均超過97.6%，Q30 堿基百分比超過92.76%。對原始數(shù)據(jù)過濾，即去除含有帶接頭的、低質(zhì)量的序列，分別平均獲得43 496 069 和46 310 607條的clean reads。將clean reads 與參考基因組進行精確比對，獲取reads 在參考基因組上的定位信息后，對照組和饑餓組各獲得平均為26 810 506 和31 596 762 的唯一比對上的數(shù)據(jù)(表2)。所有樣本轉(zhuǎn)錄組測序的原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI 的SRA 數(shù)據(jù)庫(https: //submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/sra)，登錄號為PRJNA930147。

表2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計情況Tab. 2 Data statistics of transcriptome

2.3 差異表達(dá)基因分析

通 過 DESeq2 軟 件 在P＜0.05 且|log2(Fold Change)|≥1、Padj≤0.05 條件下進行基因的差異表達(dá)分析[16]，饑餓組和對照組相比較，共有4 130 個顯著差異表達(dá)基因，其中顯著上調(diào)的基因有2 082 個，顯著下調(diào)的基因有2 048 個(圖2)。顯著上調(diào)表達(dá)的基因主要有C 型凝集素、過氧化物酶、熱休克蛋白70、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶以及wnt等。顯著下調(diào)的基因主要包括微小染色體維持蛋白(mcm)家族、DNA 連接酶、6-磷酸葡萄糖酶、mtorc1 以及復(fù)制蛋白A 等。

圖2 饑餓組和對照組差異表達(dá)基因火山圖火山圖中的點代表有顯著表達(dá)差異的基因，紅色點代表上調(diào)差異表達(dá)基因，綠色點代表下調(diào)差異表達(dá)基因，藍(lán)色點代表非差異表達(dá)基因。Fig. 2 Volcano plot of differentially expressed genes between starvation and control groups Each dot in the volcano plot represents a gene, where red dots represent up-regulated differentially expressed genes, green dots represent downregulated differentially expressed genes, and blue dots represent non-differentially expressed genes.

2.4 差異表達(dá)基因GO 功能注釋和富集分析

GO 功能注釋結(jié)果表明，共有13 383 個基因注釋到847 個GO term 中，其中包括：生物過程481 個、細(xì)胞組分98 個、分子功能268 個。通過差異基因的富集分析，差異基因最顯著富集的GO 功能主要包括蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞器部分、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器部分、非膜性細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器、酸酐水解酶活性、水解酶活性、脫氧核糖核酸代謝過程、細(xì)胞器組織、應(yīng)激反應(yīng)等(圖3)。

圖3 厚殼貽貝性腺組織差異表達(dá)基因的GO 功能富集分析結(jié)果1. 水解酶活性，2. DNA 催化作用，3.酸 酐水解 酶活性，4.ATP 依賴性微管運動活動，5.微管，6. 微管動力活性，7. 運動活性，8.腫瘤壞死因子受體，9. 腫瘤壞死因子受體結(jié)合，10. 細(xì)胞因子受體結(jié)合，11. 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器部分，12. 蛋白質(zhì)復(fù)合物，13. 細(xì)胞器部分，14. 蛋白酶體核心復(fù)合物，15. 細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器，16. 非膜性細(xì)胞器，17. 染色體部分，18. 內(nèi)肽酶復(fù)合物，19. 蛋白酶體復(fù)合物，20. 染色體，21. 脫氧核糖核酸代謝過程，22. 應(yīng)激反應(yīng)，23. 微管過程，24. 細(xì)胞器組織，25. 微管運動，26. 細(xì)胞或亞細(xì)胞成分的運動，27. 染色體組織，28. 免疫反應(yīng)，29. DNA 復(fù)制，30. 免疫系統(tǒng)過程。Fig. 3 GO functional enrichment statistics chart of differentially expressed genes of gonad tissue 1. hydrolase activity, 2. catalytic activity, acting on DNA, 3. hydrolase activity, acting on acid anhydrides, 4. ATP-dependent microtubule motor activity, 5. microtubule, 6. microtubule motor activity, 7. motor activity,8. tumor necrosis factor receptor, 9. tumor necrosis factor receptor binding, 10. cytokine receptor binding, 11. intracellular organelle part, 12.protein-containing complex, 13. organelle part, 14. proteasome core complex, 15. intracellular non-membrane-bounded organelle, 16. nonmembrane-bounded organelle, 17. chromosomal part, 18. endopeptidase complex, 19. proteasome complex, 20. chromosome, 21. DNA metabolic process, 22. response to stress, 23. microtubule-based process, 24.organelle organization, 25. microtubule-based movement, 26. movement of cell or subcellular component, 27. chromosome organization, 28.immune response, 29. DNA replication, 30. immune system process.

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG 功能注釋和富集分析

KEGG 代謝通路注釋分析顯示，共有8 119個差異表達(dá)基因被分類到128 條KEGG 代謝通路中。本實驗選取了前20 個最顯著富集代謝通路，依次是泛素介導(dǎo)性蛋白酶解、吞噬體、DNA 復(fù)制、剪接體、氨基糖和核苷酸糖代謝、Fanconi 貧血通路、蛋白酶體、核苷酸切除修復(fù)、真核生物的核糖體生物合成、錯配修復(fù)、氨基酸的生物合成、同源重組、甘氨酸和絲氨酸以及蘇氨酸代謝、基底切除修復(fù)、半乳糖代謝、AGE-RAGE 信號通路、甘油脂代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、葉酸合成和葉酸-碳庫代謝通路(圖4)。在饑餓脅迫下，DNA 復(fù)制、錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)等與細(xì)胞分裂有關(guān)的代謝通路顯著富集，相關(guān)基因的表達(dá)量顯著下降。

圖4 厚殼貽貝性腺組織差異表達(dá)基因的KEGG 功能富集分析結(jié)果1. 剪接體，2. 葉酸合成，3. 氨基糖和核苷酸糖代謝，4. 甘油脂代謝，5. 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，6. AGE-RAGE 信號通路，7. 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，8. 氨基酸的生物合成，9. 吞噬體，10. 同源重組，11. 真核生物核糖體合成，12. 半乳糖代謝，13.泛素介導(dǎo)蛋白水解，14. 堿基切除修復(fù)，15. 葉酸-碳庫代謝通路，16. 核酸切除修復(fù)，17. 范可尼貧血通路，18. 錯配修復(fù)，19. 蛋白酶體，20. DNA 復(fù)制。Fig. 4 KEGG functional annotation statistics of differentially expressed genes of gonad tissue 1. spliceosome, 2. folate biosynthesis, 3. amino sugar and nucleotide sugar metabolism, 4. glycolipid metabolism, 5. alanine, aspartate and glutamate metabolism, 6. AGE-RAGE signaling pathway, 7. glycine,serine and threonine metabolism, 8. biosynthesis of amino acids, 9. phagosome, 10. homologous recombination, 11. ribosome biogenesis in eukaryotes, 12. galactose metabolism, 13. ubiquitin mediated proteolysis,14. base excision repair, 15. one carbon pool by folate, 16. nucleotide excision repair, 17. Fanconi anemia pathway, 18. mismatch repair, 19.proteasome, 20. DNA replication.

2.6 熒光定量PCR 驗證

從顯著差異表達(dá)基因中隨機挑選14 個進行qRT-PCR 驗證(圖5)。結(jié)果顯示，被測基因的表達(dá)變化與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析是真實可信的。

圖5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR 及轉(zhuǎn)錄組的比較分析Fig. 5 Comparison of DEGs by qRT-PCR and transcriptome analysis

2.7 貽貝性腺組織中能量代謝相關(guān)酶活性

饑餓脅迫處理對厚殼貽貝性腺組織中HK、PFK、SDH、MDH 和PEPCK 的活性變化見圖6。結(jié)果顯示，與對照組相比，饑餓脅迫90 d 后，厚殼貽貝性腺組織中HK、PFK、MDH 和SDH 活性均顯著降低(P＜0.05)，而7PEPCK 活性顯著升高(P＜0.05)。

圖6 饑餓脅迫下貽貝性腺組織中能量代謝相關(guān)酶活性變化PEPCK.磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，HK.己糖激酶，PFK.磷酸果糖激酶，MDH.蘋果酸脫氫酶，SDH.琥珀酸脫氫酶，下同 “*” 代表顯著差異，P＜0.05； “**” 代表極顯著差異，P＜0.01。Fig. 6 Changes of enzyme activities related to energy metabolism in gonad tissue under starvation PEPCK. phosphoenolpyruvate carboxykinase, HK. hexokinase, PFK.phosphofructokinase, MDH. malate dehydrogenase, SDH. succinate dehydrogenase, the same below. "*" represents significant difference,P＜0.05; "**" represents very significant difference, P＜0.01.

3 討論

厚殼貽貝因其營養(yǎng)價值高、養(yǎng)殖周期短、抗病能力強而成為我國沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟貝類之一，特別是在浙江省嵊泗縣，貽貝養(yǎng)殖已成為該地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)[1]。由于貽貝自稚貝包苗開始就全部依靠海域的天然餌料攝食生長，因此，海域餌料的分布不均和寒冷季節(jié)的餌料不足嚴(yán)重影響貽貝的生長和育肥[17]。而目前關(guān)于饑餓脅迫對貽貝影響的研究較少，對貽貝的饑餓耐受力以及適應(yīng)機制并不清楚。貽貝體內(nèi)的性腺是最大的可食用部分，也是育肥和繁殖后代最為關(guān)鍵的組織，饑餓脅迫下性腺的生理變化和分子調(diào)控直接影響到貽貝的品質(zhì)。目前已有研究表明，在短期饑餓狀態(tài)下貽貝通過激活自噬途徑以及能量代謝方面的調(diào)控來調(diào)節(jié)代謝水平和能量分配[4]，以適應(yīng)食物短缺對機體造成的威脅。本項目以厚殼貽貝為研究對象，探究其長期饑餓下的存活狀況并進行性腺組織的轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)合性腺中能量代謝相關(guān)酶活性的變化，全面解析厚殼貽貝在長期饑餓下的生存策略以及能量調(diào)控和代謝響應(yīng)機制。

本研究的結(jié)果顯示，厚殼貽貝在90 d 的饑餓脅迫下存活率為86%，相較于魚類和其他軟體動物類而言，貽貝具有較強的饑餓耐受性。如管角螺(Hemi fusus tuba)在饑餓40 d 后存活率為100%[18]，但隨著饑餓時間的延長，其存活率是否下降并沒有可參考數(shù)據(jù)。仿刺參(Apostichopus japonicus)在饑餓40 天后存活率下降至32%[19]。馬氏珠母貝(Pinctada martensi)在 饑 餓 12 d 后 存 活 率 為89.9%[20]。雪蟹(Chinopecetes opilio)在饑餓119 d時存活率僅為40%[21]。由此可見，貽貝在軟體動物中對長期饑餓具有一定的耐受力，這種饑餓耐受的背后必然存在一定的生理響應(yīng)和分子調(diào)控機制。

為深入解析貽貝長期饑餓下的生理變化和調(diào)控機制，對饑餓90 d 的厚殼貽貝性腺組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序和分析，結(jié)果顯示與細(xì)胞增殖有關(guān)的DNA 復(fù)制通路顯著富集，該通路上的相關(guān)基因表達(dá)量均顯著下降(圖7)。DNA 復(fù)制是細(xì)胞有絲分裂過程中的重要環(huán)節(jié)，有絲分裂細(xì)胞周期是一個受多種因素調(diào)控的復(fù)雜過程，其中細(xì)胞周期蛋白是控制細(xì)胞周期的重要因素，可被細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶激活[22]。如Wee1 作為一種核激酶，可以通過抑制細(xì)胞周期蛋白CDK 的活性來阻止細(xì)胞進行有絲分裂，CDK 則在細(xì)胞分裂過程中維持正常的有絲分裂，發(fā)揮著關(guān)鍵作用[23]。長期饑餓下性腺的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白1 (CDK1)和細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白2(CDK2)的表達(dá)均顯著下調(diào)，由此說明貽貝通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞周期，減少細(xì)胞分裂過程以維持饑餓過程。

圖7 饑餓脅迫下葡萄糖代謝和DNA 復(fù)制相關(guān)差異表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)圖紅色字體為顯著上調(diào)表達(dá)基因，綠色字體為顯著下調(diào)基因。Fig. 7 Network diagram of differentially expressed genes related to glucose metabolism and DNA replication under starvation stress Significantly up-regulated genes are marked in red, significantly down-regulated genes are in green.

此外，E2F3 在細(xì)胞周期調(diào)控中也到起關(guān)鍵作用[24]，CDC6 和MCM 蛋白等大量編碼DNA 復(fù)制活性基因的轉(zhuǎn)錄受細(xì)胞生長調(diào)節(jié)，并依賴于E2F3[25]，CDC6 是DNA 復(fù)制的重要調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞周期進程從S 期到M 期的轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用[26]。MCM 是一種由6 個亞基組成的DNA 解旋酶，是基因組DNA 復(fù)制所必需的[27]。CDC20 對于細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)也是必不可少的，此外它另一個重要的功能是促進染色單體的分離[28]。本研究顯示，在饑餓脅迫下貽貝性腺中e2f3、cdc20 和mcm5 基因的表達(dá)量均顯著下調(diào)，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進一步顯示，長期饑餓下貽貝性腺中的mcm2、mcm3、mcm4、mcm5、mcm6 和mcm7 的表達(dá)量均顯著下調(diào)，而復(fù)制蛋白A (RPA)在饑餓時也顯著下調(diào)，它是一種普遍存在的ssDNA 結(jié)合蛋白，在許多DNA 加工途徑中起作用，以維持基因組完整性[29]。

有絲分裂是細(xì)胞周期的一部分，其中復(fù)制的姐妹染色單體被分成兩條染色體，本研究中與有絲分裂相關(guān)的基因(ncapd2、ncapg、smc2 和smc4)表達(dá)也均顯著下調(diào)，而NCAPD2、NCAPG、SMC2 和SMC4 參與染色體凝聚[26-27,30]。已有的研究顯示，細(xì)胞增殖可以使水生生物因饑餓而無法生存[31]。而在饑餓脅迫下貽貝下調(diào)的基因多與細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制、有絲分裂等相關(guān)，KEGG 代謝通路富集結(jié)果進一步顯示細(xì)胞周期顯著富集。由此可推斷，當(dāng)貽貝遭受長期饑餓脅迫時，其細(xì)胞生長幾乎處于停滯狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)的DNA 復(fù)制均處于較低的水平，以盡可能地維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，從而減少能量消耗，最大程度延長生命和代謝。

此外，在貽貝轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)基因中也篩選到多個與糖酵解和糖異生等能量代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因。糖酵解和糖異生是碳水化合物合成和分解的重要代謝途徑[32]，在饑餓狀態(tài)下，水生動物一般會通過抑制糖酵解和磷酸戊糖相關(guān)酶和激活糖異生相關(guān)酶活性來調(diào)節(jié)糖代謝從而維持血糖平衡[33]。葡萄糖是許多組織所必需的能量來源，為了在長期饑餓中滿足代謝要求并保持穩(wěn)定的葡萄糖水平，水生動物會激活糖原分解或從頭合成葡萄糖的過程(糖異生)[34]。因此，促進非碳水化合物前體從頭合成葡萄糖的糖異生作用對水生動物的葡萄糖動態(tài)平衡至關(guān)重要[35]。饑餓脅迫會引起大多數(shù)水生動物的糖異生的增加和與糖異生相關(guān)的基因的mRNA 水平的上調(diào)。在本研究中，饑餓3 個月的貽貝葡萄糖異生酶PEPCK 的表達(dá)顯著上調(diào)，PEPCK 能催化草酰乙酸脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐际奖?，是糖異生途徑的關(guān)鍵限速酶?？刂芇EPCK 活性對維持正常血糖水平有著重要意義，PEPCK 的上調(diào)意味著饑餓脅迫下貽貝的糖異生速率增加，通過糖異生作用的促進來維持饑餓期間的葡萄糖動態(tài)平衡，類似的結(jié)果在異育銀鯽[11]和中華蛸(Octopus sinensis)[36]中也有報道。此外，饑餓脅迫也會抑制葡萄糖利用率。糖酵解途徑的主要限速酶是PFK 和HK，其中PFK 是衡量碳水化合物利用的重要代謝酶[37]，HK 催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖[38]。本研究中，與對照組相比，饑餓脅迫組的PFK 和HK 活性均顯著下調(diào)，說明貽貝在饑餓狀態(tài)下通過抑制糖酵解來調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。生物在遭受饑餓脅迫時，需要降低能量的消耗來維持基本生存，糖酵解限速酶的下調(diào)意味著與葡萄糖轉(zhuǎn)化相關(guān)的信號通路受到抑制。如虹鱒的葡萄糖激酶編碼基因表達(dá)水平和酶活性在禁食14 d 后下降[9]，與本研究的結(jié)果一致。另外，SDH 和MDH 是三羧酸循環(huán)途徑中調(diào)控脫氫反應(yīng)的關(guān)鍵酶[39]，可在一定程度上反映水生動物的有氧代謝水平[40]，本研究表明，貽貝在饑餓后性腺組織SDH 活性和MDH 活性顯著降低，說明在饑餓狀態(tài)下盡可能減少葡萄糖的消耗以維持血糖濃度，這也是貽貝面對饑餓脅迫時的能量代謝生理響應(yīng)對策[41]。由此可見，貽貝在饑餓狀態(tài)下通過調(diào)節(jié)能量代謝有關(guān)的酶活性來維持血糖水平從而維持基本生存。

綜上所述，貽貝對饑餓脅迫的響應(yīng)是受一系列的生理活動的調(diào)節(jié)和能量代謝的調(diào)控而實現(xiàn)的，與細(xì)胞周期相關(guān)的代謝通路DNA 復(fù)制、能量代謝相關(guān)的基因表達(dá)以及相關(guān)酶活性的改變構(gòu)成了貽貝長期饑餓下的復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖7)，而該代謝網(wǎng)絡(luò)圖上的相關(guān)基因功能的驗證還有待進一步研究。

4 結(jié)論

本實驗探究了長期饑餓下貽貝的存活率和性腺的轉(zhuǎn)錄組變化以及能量代謝相關(guān)酶活性的變化，全面解析貽貝對長期饑餓的生理響應(yīng)策略和分子調(diào)控機制。研究結(jié)果顯示，厚殼貽貝在饑餓90 d時的存活率為86%，相較于魚類和其他軟體動物而言，貽貝具有較強的饑餓耐受性。通過比較饑餓組和對照組的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)貽貝通過調(diào)控能量代謝相關(guān)基因以及DNA 復(fù)制相關(guān)通路來應(yīng)對長期饑餓造成的損傷。轉(zhuǎn)錄組鑒定到一些參與貽貝能量代謝相關(guān)酶的基因(hk、pfk、mdh、sdh、pepck和pc等)，表明貽貝在長期饑餓脅迫下通過調(diào)控相關(guān)的能量代謝酶來滿足代謝要求，并保持穩(wěn)定的葡萄糖水平，從而維持自身生存。此外在饑餓脅迫下，DNA 復(fù)制、錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)等與細(xì)胞分裂有關(guān)的代謝通路顯著富集，相關(guān)基因的表達(dá)量顯著下降，從而減少不必要的能量消耗，最大程度地延長生命和代謝。本研究為深入解析貽貝饑餓脅迫下的生理生化響應(yīng)和分子機制提供重要的理論依據(jù)，同時為揭示其適應(yīng)饑餓脅迫的能量利用和分配策略提供有效的途徑。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）