于 紅， 林 茜， 李 琪*

(1. 中國海洋大學，海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2. 青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266237)

單細胞 RNA 測序(single cell RNA sequencing，scRNA-seq)是對單個細胞內RNA 進行高通量測序的一種技術。自2009 年問世以來[1]，該技術不斷更新迭代，已被證明是生命科學領域中的革命性技術，廣泛應用于發(fā)育生物學、神經(jīng)生物學、免疫學、微生物學等研究領域[2-5]，并在藥物研發(fā)、疾病治療等方向展現(xiàn)出廣闊的應用前景[6]，成為揭示單個細胞內RNA 轉錄本的異質性和復雜性，挖掘生物體不同細胞類型及其功能的有效技術手段。目前，單細胞RNA 測序技術已向多維度、空間化方向發(fā)展，成為研究復雜生命現(xiàn)象的利器。

近年來，隨著測序成本的不斷降低，測序技術的穩(wěn)定性不斷提高，scRNA-seq 技術的應用迅速擴展到非模式物種的研究中，包括農(nóng)作物、畜禽、水產(chǎn)動物等，為非模式物種的細胞異質性和功能研究帶來了變革性的進展[7-9]。近幾年，scRNA-seq 技術在水產(chǎn)動物中的應用日益廣泛，并取得眾多成果，人們對水產(chǎn)動物的認知也逐步轉移到了細胞水平。本文就scRNA-seq 技術在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中的應用及相關研究成果進行簡要綜述，探討scRNA-seq 在水產(chǎn)動物應用中的難點及潛在應用前景，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細胞功能解析等研究提供依據(jù)。

1 單細胞RNA 測序技術概況

1.1 單細胞RNA 技術的發(fā)展

單細胞轉錄組學是基于高通量測序原理測定基因表達的組學技術。Eberwine 等[10]第一次使用體內反轉錄和體外轉錄的方法對單個細胞的單個基因的表達進行測定，為后續(xù)微陣列全轉錄組分析技術的開發(fā)與應用奠定了基礎[11]，促進了單細胞測序技術的出現(xiàn)。單細胞測序技術出現(xiàn)于2009 年，Tang 等[1]將高通量DNA 測序與微陣列全轉錄組分析技術結合，通過單細胞RNA 測序生成第一個單細胞轉錄組。隨后單細胞RNA 測序技術取得了飛速發(fā)展，近年來相繼出現(xiàn)Smart-seq、MARS-seq (massively parallel single-cell RNA sequencing)、 Drop-seq (droplet microfluidics-based platform)、10×Chromium 等高通量單細胞轉錄組測序技術，為構建單細胞基因表達圖譜提供了重要的技術支持[7,12]。

隨著技術的不斷成熟，單細胞RNA 測序技術逐步走向商業(yè)化[13]，測序成本不斷下降，測序深度和細胞分辨率逐漸提升。10×Genomics、BD Biosciences、Illumina 等公司相繼推出了單細胞測序平臺。其中10×Genomics 的應用最為廣泛。該平臺開發(fā)的10×Chromium 具有較高的一致性和靈敏度[14]，具有細胞捕獲高效、測序周期短、成本低且操作簡便等優(yōu)點[10-11]。該技術利用分選、擴增、建庫接合一體的方式加強自動化水平從而使得操作更為便捷， “雙十字” 的通道可一次性捕捉500～80 000 個細胞，相比于其他平臺30%左右甚至3%的細胞捕獲率，該技術中油包水的微液滴體系單細胞捕獲率可達65%[12,15]。

1.2 單細胞RNA 測序的步驟

樣品制備和測序文庫構建 樣品制備是單細胞RNA 測序技術中至關重要的步驟，細胞懸液的制備質量直接影響后續(xù)測序效果[16]。單細胞RNA 測序根據(jù)樣品制備方法的不同可以分為兩種：單細胞RNA 測序(scRNA-seq)和單細胞核RNA測 序(single nuclei RNA sequencing, snRNA-seq)。scRNA-seq 需要將目標組織解離為單細胞懸液，對細胞的存活率有較高的要求，一般用于新鮮組織樣本的制備。snRNA-seq 是對目標組織進行細胞核抽提[17]，對細胞核的完整性有較高的要求，一般用于冷凍組織樣本的制備。這兩種樣品制備方法各有優(yōu)劣，scRNA-seq 僅適用于新鮮組織樣本，且不適用于含大細胞(直徑大于40 μm)的樣本類型，此外在解離過程中會誘導應激基因的表達。snRNA-seq 冷凍樣本可以彌補細胞解離時激活基因表達的問題[18]，適用樣本類型豐富，但是無法捕捉細胞質中的mRNA。有研究對scRNAseq 和snRNA-seq 結果進行比較評估[18-19]，證實二者雖然在核內小部分基因之間具有差異性[20]，但是在讀數(shù)的結構與排列，多重態(tài)的靈敏度以及測序范圍等方面保持較高的一致性，因此可以根據(jù)研究對象組織特點選擇合適的樣本制備方法[21]。

樣品制備后的細胞分選分為非特異性分選和特異性分選。非特異性分選是隨機將樣本中的細胞捕獲進行直接測序，例如微流控技術[22]利用微米級的微管道來實現(xiàn)精準分選細胞；特異性分選是將樣本中特定的細胞挑選出來再測序，如流式細胞術通過檢測細胞的特異性熒光信息達到分選細胞的目的[23]。相較于特異性分選所需特異性標記具有局限性、測序通量較低且干擾信號較多等問題，非特異性的細胞捕獲方法應用更為廣泛[24]。

10×Genomics 測序技術中，利用微流控、油包水和barcode 標記等非特異性分選技術，實現(xiàn)高通量的單細胞分離和捕獲(圖1)。文庫的構建利用微流體裝置生成液滴，帶有條形碼的微珠和細胞一起包裹進液滴，形成油包水結構(GEM)。GEMs形成后進行反轉錄反應，每個細胞的cDNA 文庫都帶有自己獨特的分子標識(unique molecular identifier，UMI)。然后將所有細胞的cDNA 文庫混合構建測序文庫，上機測序[25]。

圖1 單細胞RNA 測序流程圖[25](a)樣品制備，(b)文庫構建，(c)數(shù)據(jù)處理，(d)數(shù)據(jù)分析。Fig. 1 Schematic diagram of single cell RNA sequencing[25](a) sample preparation, (b) library construction, (c) data processing, (d) data analysis.

數(shù)據(jù)分析 高通量測序后產(chǎn)生大量短讀序列，質量控制和過濾后將原始數(shù)據(jù)中相同barcode的片段進行聚類，將有效序列片段映射到參考基因組，進而確定每個基因的表達水平，獲得每個細胞的基因表達矩陣。再根據(jù)基因數(shù)、mRNA 分子數(shù)、線粒體基因占比等參數(shù)進行質控，去除質量差的細胞進行標準化和歸一化，便于下游的分析(圖1)。數(shù)據(jù)分析中一般采用降維聚類圖將基因表達相似的細胞聚集在一起，進行細胞分群，利用maker 基因對細胞群進行類型鑒定，并進行后續(xù)的擬時序分析、細胞通訊分析、細胞周期分析等。

2 單細胞RNA 測序技術在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物上的應用

該應用主要集中在魚類、甲殼類和貝類(表1)，所用組織包括頭腎、淋巴、肝胰臟、鰓、性腺組織以及血液、胚胎等。較多的研究聚焦于細胞圖譜的繪制、描述圖譜特征、解析前人未曾研究或未知的細胞圖譜。隨著分析策略的不斷開發(fā)，研究者借助擬時分析、細胞通訊分析等方法，使得解析組織、胚胎分化發(fā)育過程也成為水產(chǎn)動物單細胞研究的方向之一。另外，單細胞RNA 測序技術也應用于水產(chǎn)動物的免疫機制和環(huán)境響應機制研究中，憑借著單細胞分辨率，單細胞RNA 測序技術具有精準揭示響應病毒感染或環(huán)境脅迫的主要細胞類型及其分子機制的絕對優(yōu)勢。

表1 單細胞RNA 測序技術在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物上應用Tab. 1 Applications of single-cell RNA sequencing in aquaculture animals

2.1 魚類

單細胞轉錄組測序技術在魚類中的應用主要集中在經(jīng)濟物種尼羅羅非魚、半滑舌鰨和大西洋鮭，研究方向包括免疫機制和生殖發(fā)育調控等[26-29, 34-36]。

在免疫機制研究方面，Niu 等[26]首次利用scRNA-seq 繪制了尼羅羅非魚頭腎的免疫細胞轉錄組圖譜，鑒定出B 細胞、T 細胞、非特異性細胞毒性細胞(NCC)和單核/巨噬細胞(Mo/MΦ) 4 種細胞類型，并根據(jù)細胞異質性和基因表達特性將NCC 進一步劃分為4 個亞群，這是硬骨魚中NCC細胞第一次完整描述，為未來研究魚類NCC 的分化及其在低等脊椎動物免疫系統(tǒng)中的功能研究提供了重要信息。該研究還發(fā)現(xiàn)hvcn1 基因作為轉錄因子在NCC 自發(fā)性的細胞異質性中的驅動作用。Wu 等[27]利用scRNA-seq 對尼羅羅非魚頭腎白細胞進行分析，共鑒定出5 種免疫細胞群(B 細胞、T 細胞、顆粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)，其中T 細胞檢測到4 種亞型，該亞群的多樣性為人們探究魚類T 細胞及免疫細胞的成熟和分化提供了新線索。 Wang 等[30]利用scRNA-seq 繪制了斜帶石斑魚腦組織的細胞圖譜，得到5 種細胞類型：神經(jīng)細胞、少突膠質細胞、星形膠質細胞、免疫細胞和內皮細胞，RGNNV 病毒感染后，免疫細胞中的巨噬細胞數(shù)量明顯增加且大多數(shù)促炎因子基因表達發(fā)生顯著變化，神經(jīng)細胞中GLU1 和GLU3 細胞數(shù)量減少最多，被證實是RGNNV 病毒的易感細胞。該研究利用scRNA-seq 技術成功破譯了宿主的病毒易感細胞和免疫反應機制，為解析魚類病原宿主互作反應研究提供了新思路。

在動物的繁殖和配子發(fā)生機制方面，Liu 等[29]利用scRNA-seq 構建了半滑舌鰨卵巢的單細胞轉錄圖譜，鑒定出3 種不同發(fā)育狀態(tài)的生殖細胞及5 種體細胞，細胞通訊分析結果顯示，半滑舌鰨與哺乳動物卵子發(fā)生相似，其生殖細胞與顆粒細胞間存在雙向作用，與膜細胞間僅存在單向作用。單細胞轉錄組分析結果顯示，半滑舌鰨與食蟹猴(Macaca fascicularis)卵子發(fā)生進化的生物過程非常保守。此外，研究者利用單細胞測序技術解析了半滑舌鰨雄魚和偽雄性精子發(fā)生的調控機制[28]，鑒定出5 種生殖細胞和6 種體細胞，發(fā)現(xiàn)偽雄魚的精原細胞中Ca2+信號通路相關基因表達降低，CaSR基因和MAPK 信號因子表達上調，精母細胞中減數(shù)分裂啟動不足，為探索魚類精子發(fā)生機制和脊椎動物生殖系統(tǒng)進化提供了重要線索。

2.2 甲殼類

蝦蟹類是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟品種，蝦類是水生甲殼動物中單細胞測序應用最多的類群，包括凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、日本囊對蝦等，主要涉及環(huán)境脅迫應答機制和免疫調控機制等。先天免疫系統(tǒng)是無脊椎動物的唯一防御系統(tǒng)，無脊椎動物的先天免疫系統(tǒng)一直是研究者關注的重點，但無脊椎動物先天免疫細胞的多樣性和功能在很大程度上是未知的[52]，單細胞測序技術的出現(xiàn)促進了無脊椎動物免疫系統(tǒng)功能研究，近3 年研究者利用單細胞轉錄組測序技術對蝦類的免疫系統(tǒng)進行了深入研究，通過繪制蝦類的淋巴、血細胞在不同機制下細胞表達圖譜，篩選出潛在的標記基因，揭示了蝦類免疫防御系統(tǒng)的組成和功能。

在日本囊對蝦中，Koiwai 等[56]根據(jù)單細胞轉錄譜結果鑒定出6 種血細胞類型，將日本囊對蝦血細胞進行了統(tǒng)一分類，并推測了參與血細胞成熟的分化途徑和發(fā)揮關鍵作用的細胞生長因子。Yang 等[54]借助scRNA-seq 確定了凡納濱對蝦血淋巴中3 種主要免疫細胞：原血細胞、單核血細胞和粒細胞，定義了一種新的巨噬細胞樣亞群(單核細胞血細胞2，MH2)，該細胞群能夠吞噬入侵的副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，與哺乳動物巨噬細胞標記基因存在一致性，說明該細胞類群可能是哺乳動物巨噬細胞的祖先細胞。這也提示研究者，一些高度保守的哺乳動物的細胞標記基因可以用于無脊椎動物的細胞類型鑒定。此外，該研究還結合分子細胞生物學驗證，建立了凡納濱對蝦血細胞新的分型方法，解決了長期以來困擾凡納濱對蝦不同分類血細胞功能不清、細胞亞群界限模糊等問題。

環(huán)境脅迫會對蝦類的免疫系統(tǒng)造成影響，血細胞在環(huán)境脅迫下會發(fā)生相應的應答反應，以適應不斷變化的環(huán)境[61]。研究者利用scRNA-seq 繪制了凡納濱對蝦的血細胞圖譜，發(fā)現(xiàn)半顆粒細胞和顆粒細胞是凡納濱對蝦在亞硝酸鹽脅迫下異質性反應的主要細胞類型[51]。Li 等[57]構建了斑節(jié)對蝦肝胰腺和血細胞的單細胞轉錄圖譜，鑒定出7 個細胞類群，在氨脅迫下，對蝦的抗氧化系統(tǒng)和proPO 系統(tǒng)被激活，AMPs、proPO、GST等重要應答基因不僅可以作為對蝦細胞群的標記基因，也在對蝦細胞分化和功能可塑性中發(fā)揮著重要作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦在低溫脅迫下，肝胰腺細胞中兩種細胞類群分別參與信號轉導、感覺器官發(fā)育和代謝過程，為凡納濱對蝦抗寒性的分子機制研究提供了重要線索[51]。

2.3 貝類

為了探究貝類肌肉組織的細胞組成及其特征，Sun 等[9]對蝦夷扇貝閉殼肌的橫紋肌和平滑肌分別進行了單細胞轉錄組測序，鑒定出四大類細胞類型(間充質干細胞、神經(jīng)元細胞、肌肉細胞和淋巴細胞)共20 個細胞亞群，結合BrdU-PCNA 雙免疫熒光檢測、神經(jīng)元特異性染色和電鏡超微結構觀察，查明了扇貝橫紋肌中間充質干細胞和神經(jīng)元的空間分布特征。研究結果不僅揭示了扇貝閉殼肌組織高度的細胞異質性，而且為貝類肌肉和神經(jīng)細胞發(fā)生和功能研究提供了重要信息。研究者利用scRNA-seq 技術對香港牡蠣血細胞進行分析，共鑒定出13 個細胞亞群，分為3 種主要類型：透明細胞、半顆粒細胞和粒細胞，通過各細胞簇的基因表達分析，推斷粒細胞主要參與免疫應答和自噬過程[59]。隨后，研究者利用單細胞轉錄組測序分析香港牡蠣在銅脅迫下血細胞的異質性反應，證實粒細胞是最主要的銅脅迫響應細胞，粒細胞負責銅積累，并將其轉運到其他部位[58]，這為香港牡蠣銅脅迫響應機制研究提供了重要信息，也為單細胞水平的銅污染物檢測提供了標志物信息。

2.4 棘皮動物

棘皮動物中，scRNA-seq 主要應用于海膽和海星的胚胎分化發(fā)育研究，借助擬時分析重構細胞譜系，解析胚胎分化發(fā)育過程。研究者鑒定了紫海膽胚胎發(fā)育過程中的細胞類型，并利用DAPT 和C59 抑制劑發(fā)掘出影響胚胎發(fā)育的重要信號通路：Wnt 和Delta/Notch 通路[49]。隨后，又闡明了海膽從8 細胞期至原腸胚晚期的細胞類型及表達變化，提出了Veg2 譜系的細胞會代替原始生殖細胞(primordial germ cells，PGC)轉化為生殖細胞譜系的假設[50]。此外，F(xiàn)oster 等[48]分析了海星8 細胞期至原腸胚6 個不同胚胎發(fā)育時期的單細胞轉錄組，共鑒定出20 種細胞狀態(tài)，對比紫海膽桑椹期和原腸胚中期的細胞狀態(tài)，揭示了胚泡孔周圍的細胞經(jīng)歷快速的細胞狀態(tài)變化，為海洋生物發(fā)育調控機制的深入研究提供了數(shù)據(jù)支持。

2.5 其他水產(chǎn)動物(海鞘、水母)

除了上述水產(chǎn)動物類群之外，單細胞RNA測序技術還應用于海鞘和水母的研究中，揭示其細胞類群以及胚胎分化發(fā)育調控機制等。Li 等[45]對玻璃海鞘精巢的生殖細胞進行了單細胞RNA 測序，鑒定了6 個不同狀態(tài)的精原細胞群體，揭示了精子發(fā)生過程中的動態(tài)基因表達和轉錄調控，獲得4 種精母細胞亞型和玻璃海鞘減數(shù)分裂的關鍵基因。Zhang 等[47]利用scRNA-seq 構建了薩式海鞘從受精卵到原腸胚的單細胞轉錄組圖譜，共鑒定出47 種細胞類型，通過細胞譜系分析，追蹤各細胞類群的發(fā)生時間。該研究為脊索動物胚胎發(fā)育和細胞譜系分化研究奠定重要基礎。

2.6 水產(chǎn)動物細胞marker 基因的研究現(xiàn)狀

在單細胞轉錄組測序中，利用marker 基因對測序獲得的細胞群進行類型鑒定，是數(shù)據(jù)分析中最核心的環(huán)節(jié)。如何找到合適的marker 基因成為單細胞測序分析中的關鍵問題。人和小鼠的細胞marker 基因信息是目前動物中最多的，其中Cell-Marker 數(shù)據(jù)庫就收錄了人和小鼠656 種組織、2 578 種細胞類型、26 915 個細胞marker 基因[62]。與人和小鼠相比，水產(chǎn)動物的細胞marker 基因還十分有限，尤其是甲殼類和貝類等目前研究瓶頸較多、功能研究尚比較欠缺的物種。除了綜合數(shù)據(jù)庫 ZFIN (the zebrafish information network)之外，Zebrahub 和FishSCT 數(shù)據(jù)庫是斑馬魚的兩個重要單細胞轉錄組數(shù)據(jù)庫，其中歸納了斑馬魚多種細胞類型的marker 基因及潛在的marker 基因，為研究者提供了開放全面的信息資源[63-64]。其中Fish-SCT 是中國科學院大學建立的以斑馬魚為中心的魚類單細胞轉錄組數(shù)據(jù)庫，整理了8 種魚類59 種細胞類型的116 個marker 基因和13 165 個潛在marker 基因以及大量的單細胞表達譜數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)庫不僅給斑馬魚的單細胞轉錄組研究提供了重要基礎信息，也為其他水產(chǎn)動物提供了重要參考信息。目前絕大部分的水產(chǎn)動物都缺乏各自物種的細胞marker 基因數(shù)據(jù)庫或單細胞轉錄組數(shù)據(jù)庫，已知的細胞marker 基因很少，主要是一些高度保守的marker 基因。例如生殖細胞的marker 基因vasa、nanos、dead、end等[65-68]，免 疫 細 胞marker 基 因DLT15、WCL38、CD8 等[69]。因 此，許多水產(chǎn)動物單細胞轉錄組數(shù)據(jù)分析時，常采用脊椎動物的細胞marker 基因進行細胞類型輔助分析，對于一些同源性比較高的marker 基因，研究者可結合普通轉錄組數(shù)據(jù)或者熒光定量PCR、原位雜交等技術進行marker 基因驗證，再進行細胞類型鑒定。目前這種方法對于一些相對保守細胞類型(如T 細胞、B 細胞、巨噬細胞等)的鑒定還是十分有效的，但對一些近期進化的細胞類型鑒定效率較低。

3 前景展望

單細胞轉錄組測序技術的出現(xiàn)為水產(chǎn)動物的細胞異質性圖譜構建、細胞譜系追蹤、免疫響應機制等研究提供了強有力的工具，但目前應用的物種類群還相對較少，尤其在海洋無脊椎動物(如蝦蟹類、貝類等)中的應用還十分有限。目前海洋動物的單細胞測序技術應用仍然面臨著一些問題和挑戰(zhàn)[70]，主要的限制因素有：①細胞和分子基礎研究較少，細胞標記基因的匱乏增加了細胞類群注釋的難度[71]。對于海洋無脊椎非模式物種，由于自身物種的限制，細胞和分子基礎實驗難以開展，細胞標記基因的獲得主要通過與脊椎動物的標記基因進行同源性比較、qPCR 或原位雜交驗證。②海洋動物種類繁多，但參考基因組相對較少且已發(fā)表的基因組質量參差不齊。另外，有的物種基因組(如甲殼類)的簡單序列重復比例較高，使得單細胞測序的短reads 映射基因組不準確。針對這些情況，目前常用的解決方法是利用三代全長轉錄組測序技術構建目標物種的參考轉錄本信息，在此基礎上進行單細胞轉錄組分析。③高質量單細胞懸液或核懸液的制備方法仍需要大量的實驗積累。淡水動物的單細胞制備與哺乳動物類似，而海洋動物由于生存環(huán)境特殊，細胞滲透壓與哺乳動物差異很大，無法參照哺乳動物的方法進行單細胞懸液制備，且海水中鈣鎂離子的濃度也會影響逆轉錄酶的活性，因此單細胞懸液的制備難度較大，需要兼顧細胞活性、滲透壓穩(wěn)定、酶的活性等多方面因素。對于海洋動物而言，核懸液制備可能更容易。

近幾年，隨著單細胞測序技術的不斷進步，單細胞分析也邁入了多組學時代，通過整合單細胞轉錄組學、空間組學、表觀基因組學、代謝組學等多尺度數(shù)據(jù)，多層次、多角度精準解析細胞的異質性，有助于全面描繪細胞的遺傳景觀，并實現(xiàn)細胞的空間分辨[72]。目前單細胞多組學分析已經(jīng)在高等動物中有所應用，例如研究者使用scRNA-seq、單細胞空間代謝組學和免疫熒光結合的方法，解析人腎臟分化中的代謝細胞命運軌跡[73]。scRNA-seq 結合蛋白組學表征30 種細胞類型的狀態(tài)和變化，繪制小鼠肺細胞圖譜[74]。利用單細胞ATAC+單細胞轉錄組+bulk RNA-seq+GWAS解析了人類慢性腎病的發(fā)生發(fā)展機制，鑒定出細胞類型依賴的eQTL，挖掘出腎功能和高血壓調控關鍵基因[75]。單細胞測序技術不斷取得突破，利用單細胞多組學技術從更多維度探索生命過程，為生命科學研究帶來一場新的變革。(圖2)。

圖2 從單細胞組學到多組學及其應用[72]Fig. 2 From single omics to multi-omics and their broad applications[72]

單細胞測序技術的迅猛發(fā)展為水產(chǎn)動物從單個細胞水平解析生命活動的調控機制提供了新的契機。未來研究中單細胞測序技術將在水產(chǎn)動物的組織細胞異質性、重要經(jīng)濟性狀解析、特定細胞類型的物種進化、細胞分化與發(fā)育等研究領域發(fā)揮更大的作用。隨著測序技術的改進和革新，一些高效、低成本、適于水產(chǎn)動物尤其是海洋動物的單細胞解離、測序技術體系將不斷涌現(xiàn)，相信單細胞轉錄組測序及單細胞多組學聯(lián)合分析會在水產(chǎn)動物中得到更廣泛的應用，推動水產(chǎn)動物研究領域的快速發(fā)展。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）