蔣四強(qiáng)，陳 功，李雄波，王澤亮，范智義，李 婷，李 恒，張其圣，鄧維琴,*

（1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司，四川 成都 611130；2.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；3.四川東坡中國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620030）

黃豆醬是我國(guó)著名傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品之一，主要由米曲霉制成的黃豆曲與一定比例鹽水均勻混合后長(zhǎng)期發(fā)酵制得，具有醬香醇厚、酯香濃郁、咸甜適中的特點(diǎn)[1]。黃豆醬的發(fā)酵過程主要由制曲過程中微生物主導(dǎo)，其中以米曲霉為主，微生物通過代謝產(chǎn)生的多種酶系在一系列生化作用下生成多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[2]。米曲霉具有較強(qiáng)產(chǎn)淀粉酶及蛋白酶的能力，在發(fā)酵過程中能充分將原料中的淀粉和蛋白質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)行分解，利于風(fēng)味物質(zhì)的生成，因此廣泛應(yīng)用于豆瓣、醬油、豆豉等傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中。但由于米曲霉單菌制得的黃豆曲中微生物種類較少，導(dǎo)致曲中酶系單一，不利于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生?；炀鷱?qiáng)化發(fā)酵是改善黃豆醬風(fēng)味品質(zhì)的有效方法，其可豐富發(fā)酵微生物的種類，產(chǎn)生更多酶系分解原料，進(jìn)一步促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的形成。紅曲霉具有較強(qiáng)的糖化力和酯化力，而米曲霉相應(yīng)能力較弱，紅曲霉制曲后混合發(fā)酵豐富了體系中微生物和酶系種類，不僅利于原料的分解利用[3]，還能夠加快發(fā)酵速率，有助于提升產(chǎn)品的色澤、香氣和口感。

紅曲霉因具有較強(qiáng)的糖化力、酯化力和產(chǎn)紅色素能力，在酒類發(fā)酵中應(yīng)用比較廣泛，Zhao Chi等[4]利用紅曲霉發(fā)酵糯米酒，研究發(fā)現(xiàn)紅曲霉在發(fā)酵早期占主導(dǎo)地位，并與酯類和醇類等風(fēng)味物質(zhì)具有較強(qiáng)的相關(guān)性，糯米酒顏色也得到明顯改善；同時(shí)，在酒類釀造前期加入紅曲對(duì)酒體品質(zhì)影響最顯著。除此之外，Li Meng等[5]在運(yùn)用紅曲霉和米曲霉混合發(fā)酵苦蕎的研究中發(fā)現(xiàn)2-庚酮、3-甲基-1-丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丙醇等主要揮發(fā)性香氣成分顯著增加。有學(xué)者在發(fā)酵醬油的研究中發(fā)現(xiàn)，相較于單菌發(fā)酵，先單菌制曲、再混合的成曲中各酶活力更佳，使發(fā)酵醬油中醇類、酚類以及雜環(huán)類風(fēng)味化合物含量得到顯著提升，并且在發(fā)酵后期通過加入紅曲米進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，使特征風(fēng)味化合物含量增加1 倍[6]。Chen Zhiyao等[7]發(fā)現(xiàn)酯類、醛類、吡嗪類、含硫化合物等是紅曲霉混合強(qiáng)化發(fā)酵醬油中含量增加明顯的風(fēng)味化合物，且強(qiáng)化發(fā)酵后醬油的花香、焦香、果味和焦糖香得到顯著提升。

由此可見，通過紅曲霉強(qiáng)化發(fā)酵可以有效改善發(fā)酵豆制品的風(fēng)味品質(zhì)，可使主要特征香氣物質(zhì)含量得到顯著提升。但目前紅曲霉強(qiáng)化發(fā)酵工藝廣泛應(yīng)用于醬油和酒類等發(fā)酵制品中，在黃豆醬中應(yīng)用較少。因此，本研究通過改變黃豆醬發(fā)酵所用黃豆曲種類，利用紅曲霉制成黃豆曲與米曲霉黃豆曲進(jìn)行混合強(qiáng)化發(fā)酵，探究紅曲霉強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)黃豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以及菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期為黃豆醬品質(zhì)優(yōu)化提供理論支撐和方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

黃豆、面粉和食鹽均購自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。米曲霉（郫釀M003）和紅曲霉（PM001）由四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司泡菜調(diào)味品與功能微生物研究中心進(jìn)行篩選和鑒定，并均保藏于廣東微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)分別為60927和60615。

1.1.2 曲精（郫釀M003）

將麩皮、豆粉和水按照一定比例均勻混合后，平鋪于培養(yǎng)篩上，放入自主研發(fā)的種曲機(jī)中，滅菌之后，接入種曲，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)干燥、真空上料、篩分和旋風(fēng)分離后得到曲精M003。

1.1.3 主要培養(yǎng)基和試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；4-甲基-2-戊醇（色譜純）阿法埃莎（中國(guó)）化學(xué)有限公司；無水乙醇、乳酸（均為分析純）成都科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-TQ8040三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 日本島津儀器公司；多功能自動(dòng)進(jìn)樣器 德國(guó)哲思泰公司；DB-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）美國(guó)安捷倫公司；15 mL頂空進(jìn)樣瓶、固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）裝置（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS萃取頭）美國(guó)Supelco公司；ESJ200-4A型分析天平 沈陽龍騰電子有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Sorval公司；VORTEX-2型旋渦混合器 美國(guó)Genentech公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉的活化

將紅曲霉接種于含10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇和2%乳酸的PDA平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，直到長(zhǎng)出肉眼可見的紅色菌落。通過平板劃線將紅色菌落重新接種于含醇和酸的PDA平板上，重復(fù)劃線2 次，最后將紅曲霉單菌落接種于PDA斜面，30 ℃培養(yǎng)長(zhǎng)出明顯紅色菌落后于4 ℃保存，供后續(xù)使用。

1.3.2 黃豆曲及黃豆醬的制作

1.3.2.1 紅曲霉黃豆曲的制作

稱取黃豆200 g置于70 ℃左右的溫水中浸泡4 h，瀝干后裝于2 L錐形瓶中，用8 層紗布封口后于121 ℃滅菌20 min；滅菌后將錐形瓶放入55～60 ℃烘箱中，將紗布烘干后取出，待黃豆溫度冷卻至常溫；向黃豆中加入15%的滅菌面粉（以黃豆干質(zhì)量計(jì)）；每個(gè)紅曲霉斜面中加入4 mL無菌水制成懸液，待面粉和黃豆均勻混合后加入紅曲霉懸液（每100 g黃豆加1 mL懸液），均勻混合，置于30 ℃培養(yǎng)箱制曲72 h后取出，置于無菌采樣袋中，于4 ℃短期保存，供后續(xù)使用。

1.3.2.2 米曲霉黃豆曲的制作

采用紅曲霉黃豆曲相同的前處理，將冷卻好的黃豆與15%的面粉和0.03%曲精M003均勻混合（以干黃豆質(zhì)量計(jì)，曲精與面粉提前混勻），平鋪于培養(yǎng)篩上，置于30 ℃培養(yǎng)箱制曲48 h后取出備用。

1.3.2.3 不同比例成曲黃豆醬的制作

分別稱取一定質(zhì)量黃豆曲，按照m（成曲）∶m（水）∶m（鹽）＝1∶1∶0.24均勻混合后，裝入發(fā)酵罐于40 ℃恒溫發(fā)酵40 d，每2 d攪拌1 次，并在0、2、4、6、8、10、20、40 d采樣，-20 ℃貯存，用于后續(xù)測(cè)定。樣品編號(hào)A0、A2、A4、A8、A10、A20、A40分別表示發(fā)酵0、2、4、6、8、10、20、40 d的黃豆醬A，其他黃豆醬編號(hào)以此類推。強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬質(zhì)量比例如表1所示。

表1 黃豆曲混合發(fā)酵條件Table 1 Conditions for pure and mixed culture fermentation of soybean koji

1.3.2.4 高通量測(cè)序

菌體富集：稱取30 g黃豆醬于200 mL燒杯中，用300 mL無菌水分批次稀釋黃豆醬，并用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，將水層倒入已滅菌?0 mL離心管中，2 500 r/min低速離心2 min，去除大分子雜質(zhì)，然后80 000 r/min離心10 min，倒掉水層，收集離心管底部菌體。

測(cè)序：將收集到的菌體送至上海派森諾生物醫(yī)藥科技有限公司，提取總DNA后，使用引物338F（5’-3’：ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和806R（5’-3’：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。真菌使用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)引物ITS5（5’-3’：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和ITS1（5’-3’：GCTGCGTTCTTCATCGATGC）擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，進(jìn)行熒光定量處理，使用Illumina MiSeq進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

1.3.3.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量測(cè)定

參照李雄波[8]的方法進(jìn)行測(cè)定。樣品前處理：精確稱取粉碎后的樣品2.000 g于固相萃取瓶中，加入2 mL飽和氯化鈉溶液，最后加入10 μL 0.5 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液（4-甲基-2-戊醇）并混勻。利用NIST 17數(shù)據(jù)庫（相似度大于80%）和人工圖譜共同對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定，采用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行半定量分析，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量按式（1）計(jì)算：

式中：A1為目標(biāo)物質(zhì)峰面積；ρ為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為內(nèi)標(biāo)添加體積/mL；A2為內(nèi)標(biāo)峰面積；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.3.2 香氣活力值（odor activity value，OAV）

OAV參照秦炳偉等[9]的方法測(cè)定，按式（2）計(jì)算：

式中：Mi為i化合物的含量/（mg/kg）；Ci為i化合物在水中嗅覺閾值/（mg/kg）。

風(fēng)味閾值采用水相中風(fēng)味物質(zhì)的氣味閾值進(jìn)行計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在派森諾基因云平臺(tái)（https://www.genescloud.cn）完成對(duì)高通量數(shù)據(jù)的分析，運(yùn)用Excel 2019、Origin 2021和SIMCA 14.1軟件對(duì)風(fēng)味數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)黃豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的影響

由圖1可知，單菌制曲發(fā)酵及混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成和含量有明顯差異，黃豆醬A、B、C、D、E中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量分別為32.87、8.67、13.39、17.89、14.00 μg/g。米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量均低于其他4 種黃豆醬。

由表2可知，黃豆醬中包含35 種含量較高的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，主要包括芳香化合物1 種、醇類10 種、酚類2 種、醚類2 種、酸類3 種、醛酮類13 種、烯類1 種以及酯類3 種。紅曲霉單菌制曲發(fā)酵及其強(qiáng)化發(fā)酵的黃豆醬以醇類、芳香物質(zhì)、醛酮類為主，其中醇類物質(zhì)含量遠(yuǎn)高于米曲霉單菌制曲發(fā)酵的黃豆醬B，與張曉等[10]的研究結(jié)果相符。OAV表征某物質(zhì)對(duì)整體香氣的作用程度，一般認(rèn)為OAV大于1，表示該物質(zhì)對(duì)香味有較大貢獻(xiàn)。由表3可知，黃豆醬中一共檢出39 種對(duì)香味具有重要作用的風(fēng)味化合物，主要為芳香族化合物、醇類、酚類、酸類、醛酮類以及酯類化合物。

表2 黃豆醬主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 2 Content of major volatile flavor substances of soybean paste

表3 黃豆醬主要呈香揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)OAVTable 3 OAVs of main aromatic volatile flavor substances in soybean paste

醇類化合物是黃豆醬中含量較高的化合物，可賦予黃豆醬一定的花香和果香，同時(shí)也是酯化反應(yīng)的重要前體物質(zhì)[11]。1-辛烯-3-醇、芳樟醇、苯乙醇、異戊醇是主要醇類物質(zhì)，其中苯乙醇被鑒定為黃豆醬中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物[12]，而1-辛烯-3-醇為脂肪族不飽和醇，具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香，是一種天然香料[13]，使黃豆醬的口感更加柔和，兩者在紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A中含量較高，其次為混合強(qiáng)化發(fā)酵的黃豆醬D、E、C，在米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B中含量最低。

酸類物質(zhì)是黃豆醬風(fēng)味的重要組成成分，適宜的酸類物質(zhì)可以使黃豆醬香氣更協(xié)調(diào)，并且可通過酯化反應(yīng)促進(jìn)酯類物質(zhì)的生成，但過多的酸類物質(zhì)則會(huì)使黃豆醬出現(xiàn)酸腐味，影響黃豆醬的品質(zhì)[14]?；旌蠌?qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C中酸類物質(zhì)含量最高（1.39 μg/g），米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B中酸類化合物含量最低，僅為0.41 μg/g。乙酸、異丁酸和異戊酸是主要的酸類化合物，在混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C中含量較高，分別為0.48、0.12、0.74 μg/g，與蒲靜等[15]的研究結(jié)果一致。通過分析OAV可知異戊酸和異丁酸對(duì)黃豆醬整體香氣有重要作用，因此混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C風(fēng)味豐富度及協(xié)調(diào)性可能優(yōu)于其他黃豆醬。

醛酮類化合物賦予黃豆醬青草氣味、果實(shí)氣味、堅(jiān)果氣味及脂肪氣味，香氣濃烈，對(duì)甜瓣子風(fēng)味有較大影響[16]。4-甲基-2-戊酮、二異丁基酮和異戊醛是黃豆醬中含量較高醛酮類物質(zhì)，紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A和混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C、D、E的醛酮類化合物含量均高于米曲霉單菌制曲發(fā)酵的黃豆醬B，且對(duì)黃豆醬的整體香氣的構(gòu)成有一定作用。此外，3-辛酮、4-壬酮、壬醛等物質(zhì)對(duì)香氣組成作用明顯，但上述醛酮類化合物對(duì)米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B整體香氣的作用較小。

酯類化合物是形成黃豆醬風(fēng)味的重要組成成分，賦予黃豆醬獨(dú)特的酯香。米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B中酯類化合物含量最高（1.79 μg/g），而紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A和混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C、D、E中酯類化合物含量較低，其中苯甲酸甲酯具有濃郁的冬青油香，對(duì)整體香氣具有重要作用，這與于茜雅等[17]的研究結(jié)果相符。由于酯類化合物可通過酯化反應(yīng)產(chǎn)生，反應(yīng)過程中會(huì)消耗酸類及醇類化合物，這可能是導(dǎo)致米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B中醇類和酸類含量較低的原因之一。

黃豆醬中的芳香烴主要為對(duì)異丙基甲苯，雖然含量較低，但對(duì)黃豆醬香氣仍具有一定的貢獻(xiàn)。愈創(chuàng)木酚具有水果香、煙熏香，在米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B中含量較高，該物質(zhì)對(duì)發(fā)酵豆制品醬香的形成具有重要作用[18]。

綜上所述，米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B的酯香較其他黃豆醬更濃郁，但其他風(fēng)味化合物含量較低，風(fēng)味特征不明顯。通過使用紅曲霉強(qiáng)化發(fā)酵，黃豆醬中芳香烴、醇類、醛酮類以及酸類物質(zhì)含量較米曲霉單菌制曲發(fā)酵（黃豆醬B）得到顯著提升。其中紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A和混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C、D、E含有較高的醇類、醛酮類和酸類物質(zhì)，但混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C較其他強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬的酸類和酯類物質(zhì)含量更高，因此，混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C可能風(fēng)味更協(xié)調(diào)，具有較好的風(fēng)味品質(zhì)。

2.2 黃豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析（principal component analysis，PCA）

為了進(jìn)一步了解紅曲霉強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)黃豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，對(duì)39 種主要呈香風(fēng)味化合物進(jìn)行PCA，如圖2A所示。PC1和PC2累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到84.6%，可代表大部分風(fēng)味物質(zhì)的信息。黃豆醬A、B、C、D、E分布在4 個(gè)不同象限，說明5 種黃豆醬中風(fēng)味化合物存在較大差異。結(jié)合圖2B可知，異戊醇、正己醇、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、2-乙基己醇、2-壬醇、苯酚、壬醛、檜烯等與PC1具有較高的正相關(guān)性，是紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A中主要差異化合物；糠醇、3-甲硫基丙醇、2-甲基苯酚、辛醇以及2-辛烯-1-醇與PC1具有較高的負(fù)相關(guān)性，是混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C中的主要差異化合物；而反-2-辛烯醛、1-辛烯-3-酮、2-己酮和麥芽醇、苯甲酸甲酯異戊醛等分別為米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B和混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬D中的主要差異化合物。強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬E中的差異化合物主要為4-壬酮、2-壬酮。

圖2 PCA的得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.2 Score (A) and loading (B) plots of PCA

2.3 黃豆醬發(fā)酵過程中微生物多樣性分析

Chao1和Shannon指數(shù)分別代表微生物物種的豐富度和多樣性，物種群落越豐富，Chao1指數(shù)越大；物種群落多樣性越高，Shannon指數(shù)越大。如表4所示，所有黃豆醬樣本中覆蓋率均在0.999以上，表明在此測(cè)序深度下所得的基因序列可基本覆蓋樣本中所有的微生物物種，所得數(shù)據(jù)可較為真實(shí)地反映樣本中微生物群落的組成情況。黃豆醬發(fā)酵過程中細(xì)菌的Chao1和Shannon指數(shù)分別分布在40.396～216.284和1.325 46～3.005 41；真菌的Chao1和Shannon指數(shù)分別分布在5.000～15.033和0.013 45～1.153 44。各發(fā)酵階段不同黃豆醬中細(xì)菌Chao1和Shannon指數(shù)均大于真菌，說明黃豆醬中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性遠(yuǎn)高于真菌群落，與任文博等[19]的研究結(jié)果一致。但不同黃豆醬在發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性有明顯區(qū)別，米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B的Chao1指數(shù)高于其他黃豆醬，但Shannon指數(shù)低于紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A及混合強(qiáng)化發(fā)酵的黃豆醬，其中混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C和D的Shannon指數(shù)最高，分別為2.783 61和3.005 41。說明米曲霉發(fā)酵黃豆醬在細(xì)菌豐富度上存在優(yōu)勢(shì)，但多樣性不及強(qiáng)化發(fā)酵的黃豆醬。米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B真菌豐富度高于強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬，而明顯低于強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬，其中混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C中真菌Shannon指數(shù)達(dá)到1.153 44，高于米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B（1.052 64）。

表4 α多樣性指數(shù)Table 4 Alpha diversity indexes

由此可見，相比于米曲霉制曲發(fā)酵，紅曲霉強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬在細(xì)菌和真菌多樣性方面具有較為明顯的優(yōu)勢(shì)。Mao Jingjing等[20]研究表明，發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌群落與多種風(fēng)味化合物之間存在著極顯著的正相關(guān)關(guān)系，強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬中相對(duì)較高的細(xì)菌和真菌多樣性可能會(huì)對(duì)豐富黃豆醬風(fēng)味物質(zhì)組成發(fā)揮一定的積極作用，這可能是導(dǎo)致米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B風(fēng)味物質(zhì)含量和種類不及強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬的原因之一，同時(shí)也說明紅曲霉對(duì)黃豆醬的菌群結(jié)構(gòu)有一定的影響。

2.4 黃豆醬發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

黃豆醬發(fā)酵過程中門水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成如圖3A所示。厚壁菌門（Firmicutes）為黃豆醬發(fā)酵過程中絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌門，其相對(duì)豐度在95.33%以上。在屬水平上，不同黃豆醬中細(xì)菌組成相似，芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）是主要優(yōu)勢(shì)菌屬，但在不同黃豆醬中菌群的相對(duì)豐度存在較大差異（圖3B）。在發(fā)酵初期，Bacillus是黃豆醬B發(fā)酵過程中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，其相對(duì)豐度在71.25%以上。Bacillus也是紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A和混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C、D、E發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)菌屬；但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，Staphylococcus相對(duì)豐度逐漸上升，在發(fā)酵中后期成為優(yōu)勢(shì)菌屬，在發(fā)酵40 d的紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A中其相對(duì)豐度達(dá)到93.08%。在傳統(tǒng)豆醬[21]和醬渣[22]中，Staphylococcus也是發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。有研究發(fā)現(xiàn)，Staphylococcus可以有效促進(jìn)氨基酸代謝類風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)可以降低脂質(zhì)氧化類的形成速率[23]。紅曲霉單菌發(fā)酵黃豆醬A和混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C、D、E中存在較低相對(duì)豐度的Leuconostoc（0.90%～8.65%），且貫穿整個(gè)發(fā)酵過程。Wang Dahong等[24]發(fā)現(xiàn)Leuconostoc在豆制品發(fā)酵中有利于酯類、酮類以及酸類等風(fēng)味化合物的生成，對(duì)提升黃豆醬的風(fēng)味品質(zhì)有一定作用。但隨著Staphylococcus相對(duì)豐度的上升，Leuconostoc相對(duì)豐度逐漸下降，推測(cè)兩者之間可能存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。由此可見，用紅曲霉制曲強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)黃豆醬中的細(xì)菌多樣性及相對(duì)豐度有一定的影響，從而影響黃豆醬的品質(zhì)。

圖3 黃豆醬發(fā)酵過程中門水平（A）及屬水平（B）細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Changes in bacterial floral structure at the phylum (A) and genus level (B) during the fermentation process of soybean paste

2.5 黃豆醬發(fā)酵過程中真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

由圖4可知，子囊菌門（Asomycota）為絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)真菌菌門，相對(duì)豐度在99.78%以上。在屬水平上，不同黃豆醬中真菌組成相似，但相對(duì)豐度差異較大（圖4B）。紅曲屬（Monascus）、米勒酵母屬（Millerozyma）和曲霉屬（Aspergillus）是主要優(yōu)勢(shì)菌屬，其中Monascus出現(xiàn)在紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A和混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬的發(fā)酵前期，Monascus在紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A中相對(duì)豐度達(dá)到99.71%，在混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C、D、E中其相對(duì)豐度分別為28.37%、48.58%和70.30%。發(fā)酵第2天，Monascus相對(duì)豐度開始下降，說明Monascus主要在發(fā)酵前期起作用。Monascus屬于好氧菌，對(duì)鹽不耐受，黃豆醬在含有12%鹽分的密閉條件下進(jìn)行發(fā)酵，受氧氣含量[25]和鹽[26]的影響，Monascus的生長(zhǎng)代謝減緩，導(dǎo)致相對(duì)豐度在發(fā)酵前期開始下降。Millerozyma在紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A發(fā)酵2 d開始出現(xiàn)，到了發(fā)酵后期，Millerozyma取代Monascus成為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度為99.86%，混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C、D、E中其相對(duì)豐度分別為41.40%、50.22%和39.78%，這與蔡琪琪等[27]的研究結(jié)果一致。同時(shí)，Millerozyma對(duì)黃豆醬發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成具有積極作用[28]，其相對(duì)豐度不同可能是導(dǎo)致不同黃豆醬中醇類物質(zhì)含量差異較大的主要原因之一。Millerozyma屬于兼性厭氧菌，能很好地適應(yīng)發(fā)酵罐中的缺氧條件，且有研究發(fā)現(xiàn)，Millerozyma在含鹽量為11%～14%的豆瓣醬中也是優(yōu)勢(shì)菌屬，說明Millerozyma具有一定的耐鹽性，這可能是Millerozyma在發(fā)酵中后期成為優(yōu)勢(shì)菌屬的主要原因。Aspergillus是米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B和混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬C、D、E中的優(yōu)勢(shì)菌屬之一，在發(fā)酵后期其相對(duì)豐度分別為53.21%、58.48%、49.74%和60.13%。研究表明，Aspergillus和Millerozyma共存時(shí)有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成[29]。

圖4 黃豆醬發(fā)酵過程中門水平（A）及屬水平（B）真菌菌群結(jié)構(gòu)變化Fig.4 Changes in the structure of fungal flora at the phylum (A) and genus level (B) during the fermentation process of soybean paste

2.6 微生物與風(fēng)味物質(zhì)生成的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步了解黃豆醬發(fā)酵過程中微生物與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的關(guān)系，通過對(duì)優(yōu)勢(shì)微生物和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行同理化處理和相關(guān)性分析，結(jié)果如圖5所示。Aspergillus和Bacillus是米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B中的主要優(yōu)勢(shì)菌屬，其中Bacillus與大多數(shù)醇類和酚類物質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)（0.85＜|r|＜0.96），而與辛酸辛酯、γ-硬脂酸內(nèi)酯具有較強(qiáng)的正相關(guān)性（0.56＜r＜0.84），研究證明，在醬類食品的發(fā)酵過程中，Bacillus的代謝是影響豆醬發(fā)酵后期揮發(fā)性酯類含量的重要因素[29]。而Bacillus在米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B的發(fā)酵過程中相對(duì)豐度較高，這可能是導(dǎo)致其酯類化合物含量高于其他黃豆醬的原因。Aspergillus與4-甲基-2-庚酮、2-甲基-3-己酮和反-2-辛烯醛呈顯著或極顯著正相關(guān)（0.86＜|r|＜0.97）。Staphylococcus、Leuconostoc和Monascus是混合強(qiáng)化發(fā)酵組與米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B的主要差異微生物，其中Staphylococcus與黃豆醬中1-辛烯-3-醇、2,7-二甲基-4,5-辛二醇、鄰苯二甲醚、3-羥基-2-丁酮及1-甲氧基-4-[(Z)-1-丙烯基]苯呈顯著或極顯著正相關(guān)（r＞0.90），這與趙改名等[30]的研究結(jié)果一致。Leuconostoc與4-甲基-2-戊酮呈顯著正相關(guān)（r＞0.90），4-甲基-2-戊酮具有相對(duì)較低的風(fēng)味閾值和較為突出的草木味和果香味。Monascus則與1-辛烯-3-醇、(2R,3R)-2,3-丁二醇、芳樟醇、苯乙醇、愈創(chuàng)木酚、3-羥基-2-丁酮、鄰苯二甲醚、2,7-二甲基-4,5-辛二醇、1-甲氧基-4-[(Z)-1-丙烯基]苯等物質(zhì)呈顯著或極顯著正相關(guān)（r＞0.85），其在紅曲霉發(fā)酵的米酒中也有相似發(fā)現(xiàn)[31]，具有青草味、花香味、玫瑰味、草木香等氣味，這表明Monascus對(duì)黃豆醬中花草香氣的形成具有貢獻(xiàn)作用。由此可以看出，由差異微生物代謝產(chǎn)生的化合物對(duì)黃豆醬整體風(fēng)味具有較大的作用，而這些化合物可能是區(qū)別于米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B風(fēng)味的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。Millerozyma主要與異戊醇呈顯著正相關(guān)（r＝0.92），與2.5節(jié)分析結(jié)果一致，雖然Millerozyma在米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B發(fā)酵后期具有較高的相對(duì)豐度，但在發(fā)酵過程中產(chǎn)生以異戊醇為主的醇類化合物較少，因此，混合強(qiáng)化發(fā)酵的黃豆醬和米曲霉單菌制曲發(fā)酵的黃豆醬B在醇類風(fēng)味上有較大的區(qū)別。Faecalibaculum則主要與1-辛烯-3-醇、(2R,3R)-2,3-丁二醇、芳樟醇、苯乙醇、愈創(chuàng)木酚、鄰苯二甲醚等物質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)（0.85＜|r|＜0.95），說明Bacillus和Faecalibaculum不利于黃豆醬中花草香氣的形成。

圖5 微生物與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between microorganisms and volatile flavor substances

3 結(jié)論

本研究將米曲霉和紅曲霉分別制成黃豆曲，以米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬作為對(duì)照，將兩種黃豆曲混合進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬，研究紅曲霉強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)黃豆醬風(fēng)味化合物以及菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬和混合強(qiáng)化發(fā)酵的黃豆醬中醇類、芳香類、醛酮類以及酸類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量遠(yuǎn)高于米曲霉單菌制曲發(fā)酵的黃豆醬?；旌蠌?qiáng)化發(fā)酵黃豆醬微生物多樣性遠(yuǎn)高于米曲霉單菌制曲發(fā)酵的黃豆醬?；旌蠌?qiáng)化發(fā)酵黃豆醬中Monascus、Millerozyma、Staphylococcus和Leuconostoc相對(duì)豐度顯著高于米曲霉單菌制曲發(fā)酵的黃豆醬，且這些差異微生物與醇類、芳香類、醛酮類風(fēng)味物質(zhì)具有較強(qiáng)的正相關(guān)性。綜上所述，紅曲霉混合強(qiáng)化發(fā)酵通過影響菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)一步影響風(fēng)味化合物的形成，使風(fēng)味化合物的種類及含量相較于米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬更加豐富，其中米曲霉黃豆曲和紅曲霉黃豆曲按照3∶1質(zhì)量比混合強(qiáng)化發(fā)酵黃豆醬風(fēng)味更協(xié)調(diào)，具有更好的風(fēng)味品質(zhì)。因此，在黃豆醬的實(shí)際生產(chǎn)中，可以通過加入紅曲霉強(qiáng)化發(fā)酵提升黃豆醬的風(fēng)味品質(zhì)，達(dá)到改善黃豆醬品質(zhì)的目的。