張云瀚,張欣,李明明,曹建新,王守偉*

1(昆明理工大學 食品科學與工程學院,云南 昆明,650500)2(中國肉類食品綜合研究中心,北京,100068)

干腌火腿以其獨特的質地和風味在世界各地廣受歡迎,而干腌火腿在不同年份之間有明顯的差異[1-2]。蛋白質降解是干腌火腿中非常重要的組成部分,現有研究表明,蛋白質的變化會對最終產品產生顯著影響,其中NaCl含量、水分含量、pH值和溫度是最突出的因素[3]。蛋白質降解是在內源酶(如組織蛋白酶、鈣蛋白酶、二肽酶和三肽酶等)共同作用下[4],由內肽酶啟動,導致蛋白質分解為蛋白質片段和多肽。這些多肽可被外肽酶進一步水解,產生更小的肽和游離氨基酸,這些小肽因其特殊的氨基酸排列順序和部分特殊結構而呈現出一定的生物活性,例如血管緊張素轉換酶抑制活性、抗氧化活性、抑菌活性、二肽基肽酶IV抑制活性等體內降壓、降血糖或抗炎活性[5-10]。

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是一類具有天然生物活性的多肽,自1972年,BOMAN等[11]通過誘導惜古比天蠶分離出的第一例抗菌肽-天蠶素(cecropins)開始,目前已經發(fā)現了3 000余種抗菌肽。抗菌肽來源廣泛,主要包括動物源、植物源和微生物源這3種,而動物源抗菌肽主要源自昆蟲、哺乳動物和海洋生物等[12],在食品領域中,抗菌肽更多來自于牛奶[13]、蝦[14]、辣椒籽[15]等,肉源的抗菌肽相對較少[16],并且大多存在于肉制品中[17-18]。鄭錦曉[19]研究了3種中國傳統(tǒng)干腌火腿中粗多肽抗菌活性,在宣威火腿中篩分出了抗菌肽并鑒定了其結構;CASTELLANO等[20]對西班牙干腌火腿進行提取分離,獲得了一個對李斯特菌有效的抗菌肽RHGYM。研究者們大多數是通過抗菌活性逐步分離純化,最終得到一個或多個具備優(yōu)良性能的抗菌肽,較為單一。從火腿蛋白降解方面對抑菌性能進行分析不失是對火腿抗菌肽方面的補充,蔡音音通過此方法對魚蝦進行研究,并通過建構模型對抗菌肽進行預測[21]。本研究將以不同成熟期的西式干腌火腿作為研究對象,以蛋白降解指數和多肽氨基酸組成為因素,火腿粗肽的抑菌能力為指標,初步探究火腿蛋白降解與火腿粗肽抑菌能力的關系,為后續(xù)深入分析西式干腌火腿中抗菌肽性能與蛋白降解之間的關系提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干腌火腿,北京金美添公司,分別選取成熟時間為24月和30月火腿樣品,從每個成熟期隨機選取3條火腿,用無菌刀取其股二頭肌(biceps femoris, BF)和半膜肌(semimembranosus, SM)部分各500 g,成熟期24月、30月對應的股二頭肌和半膜肌樣品分別記為24BF、24SM、30BF和30SM,真空封存4 ℃冷藏備用。

硫酸、Na2HPO4、NaH2PO4、甲醇、乙醇、消化片、鹽酸、硼酸、三氯乙酸、異丙醇、鄰苯二甲醛、十二烷基硫酸鈉、四硼酸鈉、β-巰基乙醇、胰酪蛋白胨,國藥集團化學試劑有限公司;LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、BHI肉湯培養(yǎng)基、瓊脂,北京索萊寶公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水分含量與水分活度測定

水分活度測定:將去除表面氧化層的火腿樣品取2 cm,切碎,平放在智能水分活度儀樣品槽中進行分析。

水分含量測定:根據HARKOUSS等[3]的方法,將2～3 g樣品在105 ℃的恒溫箱中干燥至恒重。水分含量表示為水與總物質(TM)質量的比值,kgH2O/kgTM。

1.2.2 蛋白降解指數(proteolysis index, PI)的測定

總氮(total nitrogen, TN)測定:參考國標GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》,稱取火腿樣品1.000 g至消化管中,再加入兩片消化片和10 mL硫酸于消化爐進行消化。當消化爐溫度達到420 ℃之后,繼續(xù)消化1 h,冷卻取出后采用自動凱氏定氮儀進行總氮含量的測定。

非蛋白氮(nonprotein nitrogen, NPN)測定:準確稱取1 g火腿樣品,加入質量分數15%的三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液溶解樣品并定容至50.0 mL,混勻后靜置20 min,過濾。吸取5.0 mL濾液,移入消化管中,消化及測定方法同總氮測定方法。PI的計算如公式(1)所示:

(1)

1.2.3 干腌火腿粗肽的提取

磷酸鹽提取法:參考刑路娟[7]的實驗方法,并略作修改:取干腌火腿樣品50 g,組織搗碎后加入200 mL異丙醇,浸提2 h,紗布過濾,室溫蒸發(fā)剩余異丙醇;加入200 mL pH=7.4磷酸緩沖液(0.02 mol/L),用無菌均質機600 r/min拍打4 min,于4 ℃靜置1 h后,12 000×g離心20 min,取上清液過濾,再加入2倍體積乙醇溶液,4 ℃靜置10 h后,12 000×g離心10 min,最后取上清液用0.45 μm濾膜過濾,旋蒸濃縮,冷凍干燥、稱量,-20 ℃冰箱中保存。

鹽酸提取法:參考CASTELLANO等[20]實驗方法,并略作修改:取干腌火腿樣品50 g,打碎后分別加入200 mL異丙醇,浸提2 h后紗布過濾,室溫蒸發(fā)剩余異丙醇;加入200 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液,用無菌均質機,600 r/min拍打4 min,于4 ℃靜置1 h后,12 000×g離心20 min,取上清液過濾,再加入2倍體積乙醇溶液,4 ℃靜置10 h后,12 000×g離心10 min,最后取上清液用0.45 μm濾膜過濾,旋蒸濃縮,冷凍干燥、稱量,-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 磷酸法提取實驗條件優(yōu)化

樣品預處理條件相同,以乙醇添加量(1.5、2、2.5、3倍)和乙醇沉淀時間(4、10、20 h)為變量,以大腸桿菌抑菌率、單增李斯特菌抑菌率為評價指標進行單因素條件優(yōu)化試驗,得到較佳的干腌火腿粗肽提取工藝參數。

1.2.5 肽含量的測定

參考CHURCH等[22]的方法,并略作修改。配制質量濃度為1 mg/mL的粗肽液,取40 mg鄰苯二甲醛溶于1.0 mL甲醇,依次加入25 mL 100 mmol/L硼砂,2.5 mL 20%(質量分數)十二烷基硫酸鈉和100 μL β-巰基乙醇,用超純水定容至50.0 mL,配制成鄰苯二甲醛混合液;取100 μL待測樣品與2.0 mL鄰苯二甲醛混合液混合,在室溫下反應2 min,用酶標儀測定其在340 nm下的吸光值。并以胰酪蛋白胨作為標準蛋白,配制等梯度濃度的溶液,測定其吸光值,繪制胰酪蛋白胨標準曲線后計算粗肽的含量。

1.2.6 大腸桿菌抑菌率測定

參考鄭錦曉[19]的實驗方法并略作修改。將菌種培養(yǎng)至對數生長期并用無菌生理鹽水進行稀釋,濃度調整為1×105CFU/mL,按照1∶4(體積比),吸取細菌培養(yǎng)液100 μL至400 μL無菌PBS中,為對照組。實驗管中分別加入100 μL細菌培養(yǎng)液,400 μL無菌多肽溶液,500 μL LB肉湯培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)(37 ℃,150 r/min,1 h)。隨后對菌液進行梯度稀釋,取1 mL菌液與20 mL的LB營養(yǎng)瓊脂混勻,傾注在培養(yǎng)皿上,等待凝固后倒置37 ℃培養(yǎng)24 h,計算菌落總數。抑菌率的計算如公式(2)所示:

(2)

式中:N1,對照管細菌菌落總數,CFU;N0,實驗管細菌菌落總數,CFU。

1.2.7 單增李斯特菌抑菌率測定

參考鄭錦曉[19]的實驗方法并略作修改。將菌種培養(yǎng)至對數生長期并用無菌生理鹽水進行稀釋,濃度調整為1×105CFU/mL,按照1∶4(體積比),吸取細菌培養(yǎng)液100 μL至400 μL無菌PBS中,為對照組。實驗管中分別加入100 μL細菌培養(yǎng)液,400 μL無菌多肽溶液,500 μL BHI肉湯培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)(37 ℃,150 r/min,1 h)。隨后對菌液進行梯度稀釋,取1 mL菌液與20 mL的BHI營養(yǎng)瓊脂混勻,傾注在培養(yǎng)皿上,等待凝固后倒置37 ℃培養(yǎng)24 h,計算菌落總數。抑菌率計算公式參考公式(2)。

1.2.8 西式干腌火腿粗肽的氨基酸組成分析

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》的方法,稱取50 mg肽樣于水解管中,加入15 mL 6 mol/L鹽酸后,放入-20 ℃冰箱冷凍20 min,重復抽真空-充入N23次后,在充N2狀態(tài)下擰緊螺絲蓋。將已封口的水解管放在(110±1) ℃的電熱鼓風恒溫箱內,水解22 h后,取出,冷卻至室溫后,將水解液過濾至50 mL容量瓶內,用少量超純水多次沖洗水解管,水洗液移入同一50 mL容量瓶內,最后用超純水定容至刻度,振蕩混勻。準確吸取1.0 mL濾液移入試管中,用平行蒸發(fā)儀在50 ℃加熱環(huán)境下減壓干燥,干燥后殘留物用1～2 mL水溶解,再減壓干燥,最后蒸干。用1.0 mL pH 2.2、0.2 mol/L檸檬酸鈉緩沖液溶解,振蕩混勻,過0.22 μm濾膜后,轉移至液相瓶,用氨基酸分析儀進行測定分析。

1.3 數據處理及分析

實驗數據采用Excel進行處理,并采用Origin 2022b和SIMCA 14.1軟件進行分析。所有實驗均設置3個平行,結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 西式干腌火腿水分活度與水分含量分析

由圖1所示,不同成熟期的火腿樣品的水分含量和水分活度較為接近。隨著成熟時期不斷延長,30月火腿樣品的水分含量和水分活度與24月火腿樣品沒有明顯差異(P>0.05),這是因為干腌火腿中的水分在鹽漬階段迅速降低后,在成熟階段下降逐漸平緩導致的[23-24]。同時,在相同的成熟階段,火腿的BF肌肉水水分活度顯著大于SM肌肉(P<0.05),該結論與江玉霞[25]、RVIZ-RAMREZ等[26]的結果一致。分析該差異產生的原因,可能是由于SM表面沒有皮下脂肪和豬皮的覆蓋,直接暴露在空氣中,導致水分下降速率高于BF。

圖1 不同成熟期干腌火腿的水分含量和水分活度Fig.1 The moisture content and water activity of different ripen periods dry-cured ham

2.2 西式干腌火腿蛋白降解程度分析

由圖2可知,火腿樣品的PI隨著成熟時期的增加變化的并不明顯(P>0.05),這和HARKOUSS[3, 27]的結論相似,隨著成熟時間的增加,火腿的PI值增加逐漸平緩。此外,圖2中數據表明,所有時期的BF的PI值均高于SM(P<0.05)。這可能是因為BF肌肉中水分含量高于SM,內源蛋白酶的活性相對較高,從而導致BF肌肉的蛋白降解水平高于SM肌肉[3, 26-27]。

圖2 不同成熟期干腌火腿的蛋白降解指數Fig.2 The proteolysis index of different ripen periods dry-cured ham

2.3 西式干腌火腿粗肽提取工藝的優(yōu)化與抑菌性比較

2.3.1 不同乙醇添加量與乙醇沉淀時間對火腿粗肽抑菌率的影響

圖3-a中的數據表明,粗肽提取過程中,隨著乙醇用量的增加,粗肽的抑制率呈現先上升后下降的趨勢,圖3-b中乙醇的沉淀時間的影響亦是如此。分析該結果產生的原因,可能由于火腿粗肽的提取過程中,乙醇通過破壞大分子蛋白的水化膜,或者使蛋白質變性,從而降低蛋白質在水中的溶解度,引發(fā)蛋白質的聚集沉淀,達到除去大分子蛋白[28]的效果。但隨著乙醇量和沉淀時間的逐漸增加,部分被包裹在大蛋白里面的生物活性肽,會隨著蛋白的脫除而產生損失,因此采取一個適宜的提取方法有助于抗菌多肽的富集。綜合分析得出,火腿粗肽提取的最佳條件是:2倍乙醇下沉淀10 h后再進行后續(xù)分析。

a-不同乙醇添加量;b-不同沉淀時間

2.3.2 火腿粗肽含量比較

綜合2.2節(jié)蛋白降解程度分析,BF肌肉的PI值總體大于SM肌肉,降解程度更高,提取出來的肽含量更高,所以選用BF肌肉統(tǒng)一進行后續(xù)實驗。不同成熟時期和提取方法提取出的粗肽液的肽含量對比如表1所示。鹽酸提取法時,每100 g 30月、24月成熟期火腿分別能提取10.58 g和11.40 g粗肽,而采用磷酸提取法時,上述樣品分別能提取8.82 g和9.06 g粗肽。對比2個成熟時期的火腿,發(fā)現兩者的差異并不顯著;對比相同成熟時期的肽粉,鹽酸法粗肽的提取量顯著大于磷酸法。采用鄰苯二甲醛多肽含量測定得到肽含量分別為78.88%、72.15%、57.75%和60.82%,計算可得4種多肽的提取率。其中30月鹽酸法提取出的粗肽略高于其他3種。綜合分析得出,鹽酸提取法的多肽提取率顯著大于磷酸提取法,且30月成熟期的火腿多肽提取率顯著大于24月成熟期火腿。

表1 不同成熟時期與提取方法的火腿粗肽的肽含量對比Table 1 Comparison of peptide content in dry-cured ham from different ripen period and methods

2.3.3 火腿粗肽抑制大腸桿菌和單增李斯特菌能力比較

圖4列出了不同成熟時期和不同提取方法條件下西式干腌火腿抑制大腸桿菌和單增李斯特菌的抑菌能力。從圖4可以看出,30月火腿粗肽的抑制能力低于24月火腿粗肽,且磷酸法粗肽的抑菌能力顯著高于鹽酸法(P<0.05)。對比大腸桿菌和單增李斯特菌的抑制能力,粗肽對大腸桿菌的抑制率要遠高于李斯特菌,這可能是因為大腸桿菌結構簡單,多肽能破壞大腸桿菌的細胞結構,在細胞表面形成褶皺,破壞細胞完整性[29];而李斯特菌細胞壁較厚,不易破壞掉,所以抑制能力相對較弱[19]。

圖4 不同成熟時期和方法下火腿粗肽的抑菌能力Fig.4 The antimicrobial activity of ham crude peptide in different ripen period and method

2.4 火腿降解程度與粗肽抑菌性能相關性分析

2.4.1 火腿粗肽氨基酸組成分析

生物活性肽的功能與氨基酸的組成和排列相關[30]。在不同時期和提取方法下火腿粗肽的氨基酸組成如表2所示,磷酸法提取的多肽中谷氨酸的比例明顯大于鹽酸法,同時丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸和脯氨酸在火腿多肽的組成中占比較多,其中丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸都是疏水性氨基酸,這可能是粗肽具有抑菌性的原因[31]。

表2 不同提取方法影響下不同成熟時期干腌火腿粗肽的氨基酸組成分析Table 2 The amino acid composition analysis of different ripen periods dry-cured ham crude peptides in different methods

2.4.2 多元線性回歸分析與偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)影響抑菌能力關鍵因子

為進一步分析干腌火腿蛋白降解與火腿粗肽抑菌能力之間的關系,對火腿的PI、氨基酸組成與抑菌能力做多元線性回歸模型(multiple linear regression model, MLRM)分析。表3列出了多元線性回歸方程的系數與P值,模型R2=0.991 78(P<0.01),回歸效果良好。從表3可以看到,PI和組氨酸的回歸系數達到顯著水平(P<0.05),脯氨酸的回歸系數達到較顯著水平(0.05

表3 多元線性回歸方程的系數與相關性Table 3 Coefficient and correlation of multiple linear regression equations

PLS-DA是一種新的多元統(tǒng)計方法,能將多個自變量通過偏最小二乘回歸降維成幾個綜合變量,并可以準確確定影響分組的關鍵變量[32],差異變量因子(variable importance for the projection, VIP)可以量化自變量與因變量相關的變量的重要性,其中VIP值>1表示重要變量,VIP<0.5視為不重要變量。PLS加載權重圖(PLS-loadings)顯示的是自變量X與因變量Y之間的關系,做出一條連接Y變量和原點的直線,并將其他X和Y變量投影在這條直線上。相互對立的變量是負相關的,與它們附近的變量是正相關的。圖5和圖6分別為PI值、氨基酸組成和抑菌能力的PLS-VIP圖和PLS-loadings圖。從圖5可以看到,VIP>1的為蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、組氨酸、脯氨酸、精氨酸和PI值。從圖6中可以得到,蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、組氨酸、羥脯氨酸、脯氨酸和PI值與抑菌率正相關。綜合分析上述結果,可以推出蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸、脯氨酸和PI值是抑菌能力的正相關重要變量。

圖5 根據PLS模型計算出PI值和氨基酸的VIP值Fig.5 PI and VIP of amino acids were calculated from the PLS model

圖6 根據PLS模型計算出自變量X(氨基酸和PI值)、 因變量Y(抑菌率)的加載權重圖Fig.6 The PLS-Loadings of PI and amino acids were calculated from the PLS regression model

進一步綜合分析MLRM和PLS-DA結果,發(fā)現組氨酸、脯氨酸和蛋白降解指數對抑菌能力呈促進作用,其中組氨酸是堿性氨基酸,大多數抗菌肽的N端以組氨酸、賴氨酸和精氨酸這類堿性氨基酸作為開頭[12, 33];脯氨酸是疏水性氨基酸,抗菌肽中含有大量疏水性和帶正電荷的氨基酸[31],且抗菌肽中富含脯氨酸[12, 19, 34]。

3 結論

本研究以不同成熟時期的西式干腌火腿作為研究對象,分別對水分含量、水分活度、PI進行分析,優(yōu)化得到干腌火腿提取粗肽工藝中乙醇沉淀的條件:乙醇使用量2倍,沉淀時間10 h。通過對比不同時期和不同提取手段下火腿粗肽的抑菌能力,發(fā)現采用磷酸法提取24月成熟期火腿的粗肽抑菌能力最強。進一步結合多元回歸分析和PLS-DA對粗肽的氨基酸組分、蛋白降解指數和抑菌能力進行分析,發(fā)現組氨酸、脯氨酸和蛋白降解程度對抑菌呈顯著正相關,這可能跟抗菌肽中N端大多數為堿性氨基酸,其中含有大量疏水性氨基酸有關。該結果為深入分析西式干腌火腿中抗菌肽性能與蛋白降解之間的關系提供了理論基礎。