何偉 劉麗萍 卓靜薇 張小冬 楊通 馮巨濱

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（廣州 510260）

長期以來，肺癌的發(fā)病率和病死率在各種惡性腫瘤中一直排在前列，盡管不斷有新的治療方法用于肺癌的治療，但患者的5 年生存率仍然不到15%［1］。因此，迫切需要進(jìn)行更全面深入的研究來提高患者的預(yù)后。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟而復(fù)雜的生物學(xué)過程，其中趨化因子發(fā)揮了十分關(guān)鍵的作用［2］。

趨化因子是一個(gè)包含各種可分泌蛋白質(zhì)的大家族，它們通過與靶細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，調(diào)節(jié)各種與細(xì)胞歸巢、遷移相關(guān)的病理或生理過程［3］。在生理情況下，趨化因子和受體主要表達(dá)于免疫細(xì)胞、內(nèi)皮或上皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等表面，其主要作用就是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［4］。近來，越來越多的研究顯示：腫瘤細(xì)胞也能夠過表達(dá)趨化因子或受體，以自分泌的方式促進(jìn)腫瘤的存活、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［5］。另外，高表達(dá)趨化因子的腫瘤細(xì)胞還能夠通過配受體相互作用招募表達(dá)相應(yīng)受體的抑制性免疫細(xì)胞進(jìn)入微環(huán)境，從而形成抑制性免疫微環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［6］。其中，CCR5 是研究最為廣泛的趨化因子之一。CCR5，也稱為CD195，是G 蛋白偶聯(lián)受體超家族成員之一，其主要的配體有3 個(gè)，即：CC 趨化因子配體3（CCL3）、CCL4、CCL5［7］。CCR5 與配體結(jié)合主要參與人類免疫缺陷病毒（HIV）感染，細(xì)胞增殖、遷移、血管生成和細(xì)胞存活等病理或生理過程［7］。近來許多研究顯示，腫瘤細(xì)胞可高表達(dá)CCR5 或其配體［3］，從而激活PI3K/AKT、NF-κB、ERK/MEK 和HIF-α 等信號(hào)通路，獲得無限增殖和永生化特性［7］。另外，癌細(xì)胞也可以利用CCR5 信號(hào)通路，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）、髓系起源抑制細(xì)胞（MDSCs）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）等免疫抑制細(xì)胞異常遷移進(jìn)入腫瘤微環(huán)境（TME），形成有利于癌細(xì)胞存活的環(huán)境［7-8］。然而，趨化因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用才剛剛引起關(guān)注，很多問題尚未明確［9］。

本項(xiàng)目旨在檢測Maraviroc 拮抗CCR5 信號(hào)通路，對(duì)Lewis 小鼠肺腺癌細(xì)胞存活和增殖的影響，重點(diǎn)關(guān)注腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）和Treg 細(xì)胞的數(shù)量和比例的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和抗體 CCK-8 試劑盒購自Dojindo公司。Maraviroc 由MedChem 公司提供。TSAPLus熒光雙染試劑盒、即用型DAPI 染色液、熒光猝滅劑、抗熒光淬滅封片劑以及AnnexinⅤ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。Alexa Fluor 488 和Alexa Fluor 594 聯(lián)結(jié)的重組兔抗小鼠CD4 和CD8 單抗、正常山羊血清和兔抗小鼠Foxp3 單抗購自Abcam 公司。兔抗小鼠CCR5 多抗來源于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠二抗購自基因科技有限公司。Trizol RNA分離試劑購自MRC（Molecular Research Center， Inc）。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶由Promega提供。ChamQ SYBR qPCR Master Mix 購自Vazyme Biotech 公司。Caspase 8（Cas8）基因引物序列如下［10］：正向：5'-TGAAGGACAGAAAAGGAACAA-3'；反向：5'-CTTGTTCACCGTGGGATAGATA-3'

1.2 動(dòng)物和細(xì)胞株 Lewis 小鼠肺癌細(xì)胞株由廣州呼吸疾病研究所劉明教授惠贈(zèng)，在添加10%胎牛血清（Gibco），100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基（Hyclone）中，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。4 周齡雄性C57BL/6 小鼠購買自廣州銳格生物科技有限公司，飼養(yǎng)于廣州永諾醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得廣州永諾醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南。

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) CCK-8實(shí)驗(yàn)如之前所述［11］。收獲生長至70%匯合的Lewis 細(xì)胞，按1.0 × 104個(gè)/孔接種到96 孔板中培養(yǎng)12 h，然后去除上清液，加入含有5 μmol/L Maraviroc 或DMSO（對(duì)照組）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168 h。每孔設(shè)2 個(gè)復(fù)孔。在結(jié)束培養(yǎng)前4 h，去除上清液，加入含有10 μL CCK-8 溶液的110 μL 培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4 h。最后，用酶聯(lián)免疫測定儀在450 nm 處檢測每個(gè)孔的光密度（OD），并計(jì)算2 個(gè)復(fù)孔的平均OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 凋亡檢測 按前述方法收獲細(xì)胞并接種到96孔板中培養(yǎng)12 h，然后除去上清，加入含有5 μmol/L的Maraviroc 或DMSO 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)144 h 后，收獲細(xì)胞進(jìn)行Annexin V 和PI 染色。使用MoFlo免疫細(xì)胞儀系統(tǒng)（Dako）進(jìn)行流式分析，并使用FlowJo 軟件（TreeStar）分析數(shù)據(jù)。每孔設(shè)2 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 RT-PCR 分析Cas8 基因表達(dá) 如前所述，將接種至96 孔板中的細(xì)胞用Maraviroc 或DMSO 處理144 h 后，收集細(xì)胞，分離總RNA，將含有2 μg 總RNA 和1 μg 引物的10 μL 無RNase 水加熱至75℃5 min，然后立即在冰上冷卻5 min。隨后加入反應(yīng)緩沖液、dNTPs、無RNase 水和逆轉(zhuǎn)錄酶，將終體積為25 μL 的反應(yīng)混合物在42 ℃下孵育60 min。在RT-PCR儀（ABI StepOnePlus）上定量分析Cas8基因的mRNA 水平。GAPDH 作為內(nèi)參照。每孔設(shè)2 個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 同基因小鼠肺癌模型的建立 將1.0 × 106個(gè)Lewis 細(xì)胞皮下接種至每只小鼠的右側(cè)腹。保證所有小鼠只出現(xiàn)一個(gè)皮下腫瘤。一旦腫瘤直徑達(dá)到0.5 cm，將小鼠隨機(jī)分為兩組（每組4 只）。實(shí)驗(yàn)組每2 d 腹腔內(nèi)注射Maraviroc（30 mg/kg），對(duì)照組接受等體積的無菌PBS。每3 d 測量一次腫瘤大小，并根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤體積：體積=（長×寬2）/2。在第12 天處死所有小鼠，取出腫瘤塊，在室溫下置于4%緩沖的多聚甲醛中固定30 min，然后石蠟包埋。

1.7 免疫熒光染色 將石蠟包埋組織制成5 μm切片，然后脫蠟至水。按操作指南依次進(jìn)行抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，用PBS 洗滌3 次，5 min/次。切片甩干后，滴加正常山羊血清封閉30 min。對(duì)于CCR5 和CD4 或CD8 雙染，以1∶1 000 稀釋加入CCR5 多抗以覆蓋組織切片，4℃ 孵育過夜。PBS 清洗3 次。然后滴加50 μL HRP 標(biāo)記的抗兔二抗，RT 下孵育50 min。3 次清洗后，滴加50 μL TSA555（CD4 和CCR5 染色）或TSA488（CD8 和CCR5 染色）工作液，RT 避光孵育10 min，然后清洗3 次。為了去除已結(jié)合的一抗、二抗，將組織切片置于充滿檸檬酸鈉緩沖液的修復(fù)盒中，微波加熱至95 ℃，持續(xù)15 min。為進(jìn)行第2 個(gè)一抗染色，以1∶200 稀釋加入Alexa-Fluo 聯(lián)結(jié)的CD4 或CD8 單抗，并如前所述進(jìn)行孵育。然后PBS 清洗3 次，進(jìn)行DAPI 細(xì)胞核復(fù)染和熒光猝滅。清洗甩干切片后封片。最后用BK6000-FL 熒光顯微鏡（重慶奧泰克）觀察免疫熒光。對(duì)于CCR5 和Foxp3雙染，將1∶1 000 稀釋的CCR5 多抗用作第1 個(gè)一抗，以HRP 標(biāo)記的抗兔抗體用作二抗。TSA-488染色工作液作為熒光顯示劑。如前所述去除結(jié)合的一抗和二抗后，1∶500 稀釋的抗Foxp3 單抗和HRP 標(biāo)記的抗兔抗體分別用作第2 個(gè)一抗和二抗。TSA-555 溶液為熒光顯示劑。其他步驟如前所述。采用Image J 軟件（1.53t，美國國立衛(wèi)生研究院） 隨機(jī)選擇3 個(gè)200 倍放大視野測量陽性信號(hào)強(qiáng)度或面積。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。GraphPad Prism v.5.01 軟件用于繪圖和統(tǒng)計(jì)分析。采用雙側(cè)非配對(duì)Studentt檢驗(yàn)對(duì)兩個(gè)均值進(jìn)行比較。使用雙向方差分析比較相對(duì)細(xì)胞活力和腫瘤體積，然后進(jìn)行Bonferroni 多重比較分析。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外阻斷CCR5 信號(hào)可能通過誘導(dǎo)凋亡來抑制Lewis 細(xì)胞的增殖 為了探討CCR5 拮抗劑對(duì)Lewis 細(xì)胞生長的體外影響，建立了Maraviroc 和Lewis 細(xì)胞共培養(yǎng)體系，數(shù)據(jù)表明：與對(duì)照組相比，從共培養(yǎng)后72 h 開始，Maraviroc 可明顯（P＜ 0.05）抑制Lewis 細(xì)胞的生長（圖1A）。接下來通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。Annexin V 陽性細(xì)胞的百分比被用作評(píng)估凋亡的指標(biāo)。見圖1B 和1C，在共培養(yǎng)144 h 后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡增加了近3 倍（P＜ 0.001）。隨后基因表達(dá)分析顯示：Cas8 基因的表達(dá)增加了近3 倍（圖1D）。表明拮抗CCR5 可能通過增強(qiáng)凋亡誘導(dǎo)基因（如Cas8）的表達(dá)從而增強(qiáng)細(xì)胞凋亡來抑制Lewis 細(xì)胞的生長。

圖1 拮抗CCR5 信號(hào)可能通過誘導(dǎo)凋亡來抑制Lewis 細(xì)胞的體外增殖Fig.1 CCR5 blockade markedly inhibited the in vitro proliferation of Lewis lung cancer cells presumably by apoptosis induction

2.2 拮抗CCR5 信號(hào)在體內(nèi)抑制Lewis 細(xì)胞的生長 為了闡明Maraviroc 對(duì)Lewis 細(xì)胞體內(nèi)生長的影響，建立了肺癌同基因小鼠模型。見圖2B，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤生長明顯慢于對(duì)照組（P＜ 0.001）。在第12 天，測量瘤塊體積顯示：實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均體積明顯大于對(duì)照組（圖2A，P＜ 0.001）。表明Maraviroc 可抑制Lewis 細(xì)胞的體內(nèi)生長。

圖2 拮抗CCR5 抑制Lewis 細(xì)胞的體內(nèi)生長Fig.2 CCR5 blockade retarded the in vivo growth of Lewis lung cancer cells

2.3 拮抗CCR5 信號(hào)可增加TME 中CD4+和CD8+細(xì)胞的比例而減少Foxp3+細(xì)胞的比例 免疫熒光染色顯示：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組瘤組織中發(fā)現(xiàn)了更高比例的CD4+細(xì)胞（圖3A-B，P= 0.016 4）和CD8+細(xì)胞（圖3C-D，P= 0.011 6）。而Foxp3+細(xì)胞的情況正好相反。對(duì)照組瘤組織中Foxp3+細(xì)胞比例反而比實(shí)驗(yàn)組更高（圖3E-F，P= 0.004）。

圖3 拮抗CCR5 明顯增加腫瘤組織中CD4+和CD8+細(xì)胞比例及減少Foxp3+細(xì)胞比例Fig.3 CCR5 blockade induced more CD4+ and CD8+ cells but less Foxp3+ cells gathering in tumor tissues

3 討論

近年來，在癌癥診療領(lǐng)域出現(xiàn)的進(jìn)展中，趨化因子和受體無疑是最具吸引力的發(fā)現(xiàn)之一。趨化因子及其受體最初被認(rèn)為是許多正常生理過程的介質(zhì)［12］。然而，最近發(fā)現(xiàn)許多腫瘤可異常表達(dá)趨化因子和（或）其受體，利用趨化因子信號(hào)通路支持自身的生長和進(jìn)展［3］。其中，CCL5/CCR5 是研究最廣泛的配體/受體對(duì)之一。

CCL5，也稱為RANTES，是C-C 趨化因子配體5 的縮寫。雖然CCL5 可以與CCR1、CCR3、CCR4和CCR5 結(jié)合，但它對(duì)CCR5 的親和力最高。在過去的十年里，越來越多的研究數(shù)據(jù)表明：CCR5/CCL5 信號(hào)通路參與了腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移。一方面，腫瘤細(xì)胞具有異常升高的CCR5 和（或）CCL5 表達(dá)，以自分泌的方式促進(jìn)腫瘤生存和進(jìn)展［4］。另一方面，趨化因子的異常表達(dá)可以旁分泌的方式將抑制性免疫細(xì)胞募集到TME 中，從而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸［13］。TME 是指腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境，它是一種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，由多種細(xì)胞類型和分子組成，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、免疫細(xì)胞、生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子等［14］。其中，趨化因子和受體是腫瘤細(xì)胞與其他細(xì)胞相互作用的主要信使之一。最近發(fā)現(xiàn)，一些抑制性免疫細(xì)胞，包括Tregs、MDSCs、TAMs 和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）等，可高表達(dá)CCR5，通過與腫瘤細(xì)胞分泌的CCL5 相互作用，異常遷移至TME 中，從而形成免疫抑制環(huán)境，阻止腫瘤細(xì)胞被免疫系統(tǒng)識(shí)別和殺死［6］。

然而，由于趨化因子/受體網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，仍有太多細(xì)節(jié)未知。目前，CCL5/CCR5 信號(hào)軸在腫瘤發(fā)展中的作用仍然存在爭議。它既可以促進(jìn)腫瘤生長，也可能具有抗腫瘤作用。例如在乳腺癌［15］和結(jié)直腸癌［16］中，就分別報(bào)道了CCR5 信號(hào)對(duì)腫瘤生長截然相反的影響。此外，研究人員認(rèn)為：每種腫瘤都有其獨(dú)特的TME。結(jié)直腸癌和胰腺癌細(xì)胞通過分泌CCL5 將大量CCR5+Tregs 募集到TME中，以促進(jìn)腫瘤侵襲和擴(kuò)散［17-18］。而胃癌［19］或惡性黑色素瘤［7］的TME 中則發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CCR5的MDSCs 大量積聚。TAMs［8］和TAFs［20］也可以利用CCL5/CCR5 信號(hào)通路，幫助形成免疫抑制性TME。但人們對(duì)肺癌的TME 卻知之甚少。筆者既往研究［11］表明：CXC 趨化因子受體4（CXCR4）及其特異性配體，CXC 趨化因子配體12（CXCL12），參與了肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成，而有關(guān)TME 的情況尚不清楚。有研究［21］顯示：肺癌分子靶向治療的耐藥可能與TME 有關(guān)，而CCL5 表達(dá)與肺腺癌的低生存率相關(guān)，這表明：肺癌的TME影響了患者的療效，CCL5/CCR5信號(hào)可能通過TME參與肺癌的進(jìn)展［22］?？傊?，在CCR5 靶向治療大規(guī)模用于臨床之前，還需要更多更深入的研究。

本研究采用小鼠Lewis 細(xì)胞作為模型，使用CCR5 選擇性抑制劑阻斷CCR5 的內(nèi)在化和由此產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)可延遲Lewis細(xì)胞的生長。隨后FACS 和PCR 證明這可能是靶向CCR5 信號(hào)提高了Cas8 基因的表達(dá)而增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的結(jié)果。因?yàn)樵摶虻谋磉_(dá)和激活是細(xì)胞凋亡的重要啟動(dòng)因子之一。但要注意的是，細(xì)胞凋亡是凋亡誘導(dǎo)和凋亡抑制基因共同作用的結(jié)果。本研究數(shù)據(jù)并沒有提供凋亡抑制基因如Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)情況。接下來，建立了具有免疫活性的同基因小鼠肺癌模型。本研究發(fā)現(xiàn)：拮抗CCR5 延緩了Lewis 癌腫的生長。由于在癌癥患者的腫瘤中發(fā)現(xiàn)Treg 細(xì)胞增加且與預(yù)后相關(guān)［23］，因此比較了腫瘤組織中CD4+、CD8+和Foxp3+細(xì)胞的百分比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在阻斷組中有更多的CD4+和CD8+細(xì)胞，F(xiàn)oxp3+細(xì)胞則更少。考慮到CD4+和CD8+細(xì)胞主要由T淋巴細(xì)胞組成，因此可以推測：阻斷CCR5 信號(hào)增強(qiáng)了T 淋巴細(xì)胞對(duì)TME 的浸潤。同樣，F(xiàn)oxp3+細(xì)胞主要由Treg 細(xì)胞構(gòu)成，這表明：拮抗CCR5 信號(hào)可能抑制了Treg 細(xì)胞在瘤組織中的聚集。綜上所述，可以合理地推測：拮抗CCR5信號(hào)可增加免疫效應(yīng)細(xì)胞而減少免疫抑制細(xì)胞在瘤組織中的聚集，從而重塑腫瘤免疫微環(huán)境，激活抗腫瘤免疫，抑制腫瘤生長。TME 中的CD4+和CD8+細(xì)胞主要由T 淋巴細(xì)胞組成，被稱為TILs，在抗腫瘤免疫中起著關(guān)鍵作用。大多數(shù)Foxp3+細(xì)胞是Tregs，它是最常見的抑制性免疫細(xì)胞，對(duì)抗腫瘤免疫具有很強(qiáng)的抑制作用。正是基于此發(fā)現(xiàn)，推測：CCR5阻斷可能通過削弱TME的免疫抑制來激活抗腫瘤免疫。然而，應(yīng)特別注意幾點(diǎn)：首先，除了T淋巴細(xì)胞外，CD4+細(xì)胞還包括少數(shù)具有免疫抑制作用的Treg。其次，更多的CD4+和CD8+細(xì)胞不一定代表更強(qiáng)的抗腫瘤免疫。Treg 減少并不意味著免疫抑制減弱。因此還需要對(duì)免疫細(xì)胞的功能進(jìn)行研究。最后，除了Tregs，其他細(xì)胞，如TAM，也可能參與癌癥TME 的免疫抑制［24］。為了解決這些問題，還需要進(jìn)行更深入和全面的研究。

在過去的二十年里，由于靶向治療和免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）的出現(xiàn)，肺腺癌患者的預(yù)后顯著改善。但患者的5年生存率仍低于15%［1］?；贑CR5在癌癥發(fā)生和發(fā)展中的重要性，一些CCR5 拮抗劑已被測試用于治療某些類型的癌癥，如胰腺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌等，并獲得了一些令人興奮的臨床前數(shù)據(jù)［6］。目前的研究為CCR5 拮抗劑作為一種新的靶向治療方法在肺腺癌中的未來臨床應(yīng)用提供了支持性的臨床前數(shù)據(jù)。此外，雖然ICIs 免疫療法為包括肺癌在內(nèi)的許多癌癥的治療帶來了突破，但癌細(xì)胞總是能夠進(jìn)化出一些逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊的機(jī)制，即免疫逃避［25］。故此，只有一小部分癌癥患者可以從ICIs 療法中最終受益［26］。幸運(yùn)的是，最近臨床前研究發(fā)現(xiàn)：CCR5 拮抗劑與ICIs 聯(lián)合可協(xié)同抑制胰腺癌［27］和結(jié)直腸癌［28］腫瘤的生長，這強(qiáng)烈提示：CCR5 拮抗劑可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)ICIs 的耐藥性，增強(qiáng)其療效。

綜上所述，本研究表明：拮抗CCR5 信號(hào)可以重塑肺腺癌的免疫微環(huán)境，這將為未來聯(lián)合CCR5拮抗劑和ICIs 治療肺癌的研究提供一個(gè)良好的開端。

【Author contributions】HE Wei and FENG Jubin conceived the experimental design and wrote the manuscript. HE Wei， LIU Liping，ZUO Jingwei， ZHANG Xiaodong and YANG Tong conducted the experiments. LIU Liping， ZUO Jingwei and ZHANG Xiaodong analyzed the obtained data. All authors read and approved the final manuscript.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.