0 引言
芋(Colocasiaesculenta)是一種經(jīng)濟作物,芋頭富含纖維、淀粉等營養(yǎng)成分,可藥用、食用,也可用于食品加工,具有較高的經(jīng)濟價值。東寮芋頭(屬檳榔芋)作為廣東省揭陽市的傳統(tǒng)特色農(nóng)產(chǎn)品,主要種植于揭陽市揭東區(qū)東寮村及其周邊地區(qū),由于其個頭大、質(zhì)地細(xì)膩、口感軟糯、甜度高、營養(yǎng)豐富而遠(yuǎn)近聞名,被譽為“芋頭之王”。近幾年,由于東寮芋頭備受市場青睞,呈現(xiàn)供不應(yīng)求的現(xiàn)象。
東寮芋頭雖有廣闊的市場前景,但由于村民連年種植,芋頭疫病和軟腐病等病害頻頻發(fā)生,因此病害防控成為當(dāng)?shù)赜筠r(nóng)的當(dāng)務(wù)之急。加之傳統(tǒng)的東寮芋頭繁殖方式存在周期長、效率低等問題,不僅嚴(yán)重影響了村民的種植效益,也打擊了農(nóng)民的種植積極性。
組培快繁技術(shù)具有繁殖速度快、遺傳穩(wěn)定、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢[1-5]。目前,已有研究表明,可以通過組培快繁技術(shù)實現(xiàn)芋頭的無病毒、快速及高效繁殖[6-12],對提升芋頭產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。研究以揭陽東寮芋頭為試驗對象,就東寮芋頭外植體的消毒、增殖與生根培養(yǎng)、移栽與馴化進行初步研究,以期為揭陽地區(qū)芋頭產(chǎn)業(yè)的高效、良性發(fā)展提供參考。
1材料與方法
1.1試驗材料從揭陽市揭東區(qū)農(nóng)戶家收集種芋以供試驗
1.2材料處理
將收集的種芋半埋放于濕沙中,促使芋頭生芽。當(dāng)芋芽長 3~5cm 時,將其莖尖切取作外植體。
1.3 啟動培養(yǎng)
采用MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別量(稱)取母液、蔗糖、瓊脂及根據(jù)配方量添加6-BA和NAA,用蒸餾水混合后邊攪拌邊加熱使其完全熔化,再滴加 1mol/L HC1溶液或 1mol/LNaOH 溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH值至5.8,后加人蒸餾水定容至所需容量,趁熱按每瓶 10mL 的量分裝至 56mL 的玻璃培養(yǎng)瓶中并封好瓶蓋。將分裝好的培養(yǎng)基放進高壓滅菌鍋,在 0.105MPa 下蒸汽消毒 20min 后置于超凈工作臺,在室溫下冷卻凝固后存放,3d后檢查培養(yǎng)基污染情況,清洗掉污染的培養(yǎng)基,留下無菌污染的培養(yǎng)基進行接種。
1.4外植體消毒與處理
將外植體用流水沖洗 30min 后,分別置于滅菌后的玻璃培養(yǎng)瓶中(每瓶放1個),在超凈工作臺上剝掉其葉鞘,往玻璃瓶中倒入 75% 酒精消毒10 s,一半玻璃瓶加入 10% 次氯酸鈉溶液并浸泡 10min ,剩余一半玻璃瓶加入藍(lán)月亮84消毒液(按原液和水1:50比例稀釋)并浸泡 20min (見表1),均用無菌水沖洗3\~4次,以徹底去除殘留消毒劑;置于接種盤上,剝?nèi)∏o尖;接種后置于 MS+6-BA0.5mg/L+ NAA 0.1mg/L 萌發(fā)培養(yǎng)基上,30d后,選擇無污染且已萌發(fā)的外植體再進行分化培養(yǎng)。
1.5 分化培養(yǎng)
對經(jīng)過啟動培養(yǎng)已萌發(fā)的外植體進行修剪,后轉(zhuǎn)到 MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L 的分化培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基pH值為5.8),繼續(xù)誘導(dǎo)叢芽分化,培養(yǎng)30d后觀察分化情況。
分化率 分化芽數(shù)量/接種外植體數(shù)量 ×100%
1.6 增殖培養(yǎng)
采用MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加蔗糖30g/L 、瓊脂 7g/L ,調(diào)整培養(yǎng)基pH值為5.8。添加不同質(zhì)量濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑(如6-BA、NAA、KT等)有機物(如水解酪蛋白和酵母提取液等),進行配方優(yōu)化,設(shè)置多個處理組合(見表1),以觀察不同配方對東寮芋頭增殖的影響。每瓶接種3個芽,每組處理接種20瓶,30d后統(tǒng)計出芽增殖率。
增殖率 有效芽數(shù)量(高度大于 1.0cm 的芽)/接種芽數(shù)量 ×100%
1.7 生根培養(yǎng)
采用1/2MS為基本培養(yǎng)基,添加蔗糖 30g/L 瓊脂 7g/L ,調(diào)整培養(yǎng)基pH值為5.8,附加活性炭 和NAA 0.1mg/L 。每瓶接種1個芽,30d后觀察生根情況。
1.8 培養(yǎng)條件
將接種芽放入含有不同配方培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,并置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)定適宜的光照強度( 2000lx 、光照周期(每天光照 16h 、溫度[(25±2) 小、相對濕度( 50% )。定期觀察并記錄外植體的生長狀況,并及時清理污染培養(yǎng)基。
1.9 移栽與馴化
待東寮芋頭組培苗具3\~4片葉且根系發(fā)達、生長健壯時進行移栽。移栽前進行煉苗處理,首先進行開瓶煉苗(7d左右),該部分分3個階段進行:先松瓶塞1\~2d,接著半開蓋1\~2d,剩下幾天完全揭去瓶蓋。開瓶練苗后,首先,將東寮芋頭組培苗用鑷子小心取出,洗凈根部的培養(yǎng)基,移栽到裝有人工配制的培養(yǎng)基質(zhì)(泥炭土與珍珠巖體積比2:1的營養(yǎng)杯中;其次,轉(zhuǎn)移到溫室大棚中管理30d,該過程保持基質(zhì)濕潤但不過濕,避免陽光直曬及積水;最后,移栽于戶外。
2 結(jié)果與分析
2.1不同消毒劑對外植體消毒效果試驗結(jié)果
由表1可知,外植體在 75% 乙醇中處理10s再用 10% 次氯酸鈉溶液浸泡 10min 的方法,污染率較低,成功率達 80% 。
莖尖在2種不同的消毒劑處理下均出現(xiàn)不同程度的褐化。成活的莖尖外植體在培養(yǎng)5d后逐漸開始膨大且明顯變綠,經(jīng)過30d的培養(yǎng)能觀察到新的組織塊,在整個生長過程中均未觀察到愈傷組織。
2.2分化培養(yǎng)試驗結(jié)果
莖尖在分化培養(yǎng)的過程中出現(xiàn)一定程度的褐化。經(jīng)過啟動培養(yǎng)的外植體分化培養(yǎng)20d后逐漸分化出芽,分化率達到 73.14% ,分化出來的芽整體較粗壯。每塊幼芽能分化出2~3株長有2~4片葉的東寮芋頭幼苗。
2.3增殖培養(yǎng)基篩選試驗結(jié)果
采用MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,對比不同處理組合的結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見表2),不同處理過程都在一定程度上促進出芽,在NAA和KT質(zhì)量濃度一致的情況下,處理1芽的增殖數(shù)量最多,即MS+6-BA5.0mg/L+NAA 水解酪蛋白100mg/L+ 酵母提取液 0.5% 的組合最有利于東寮芋頭外植體的增殖。該配方下,外植體的增殖速度較其他配方快且生長狀態(tài)好。
2.4生根培養(yǎng)基試驗結(jié)果
采用1/2MS為基本培養(yǎng)基,附加活性炭 0.5g/L 和NAA 0.1mg/L 進行東寮芋頭組培苗的生根培養(yǎng)試驗。經(jīng)過30d的培養(yǎng),每株組培苗均能生根,根系較發(fā)達,且無愈傷組織生成。即在設(shè)定的培養(yǎng)條件下,東寮芋頭組培苗能夠穩(wěn)定生長并成功誘導(dǎo)生根。
2.5再生植株的移栽與馴化
移栽具有3\~4片葉且根系發(fā)達、生長健壯的東寮芋頭組培苗。移栽時,選擇透氣性良好、保水保肥能力適中的基質(zhì)(珍珠巖與泥炭土混合物)。在移植前,為有效促進東寮芋苗根系的進一步發(fā)育,增強其對新環(huán)境的耐受能力,需要進行煉苗處理。此后,隨著植株的生長,逐漸將其轉(zhuǎn)移至室外,使其逐漸適應(yīng)自然環(huán)境。經(jīng)過一段時間的馴化,再生植株的葉片顏色鮮綠、根系發(fā)達、生長勢強,與常規(guī)繁殖的植株無明顯差異。這表明通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的東寮芋頭再生植株具有良好的生長潛力和應(yīng)用價值,初次嘗試的移栽成活率在 75% 以上。
3結(jié)論與討論
研究表明,用東寮芋頭進行組培繁殖時,外植體用 75% 乙醇處理10s再用 10% 次氯酸鈉溶液浸泡 10min 的方法,污染率較低; NAA 0.1mg/L 的配方適用于東寮芋頭莖尖的啟動培養(yǎng): $\mathrm{MS^{+6-BA2.0\mg/L+NAA0.1\mg/L}}$ 的配方適用于東寮芋頭莖尖的分化培養(yǎng);較適合東寮芋頭組培苗的增殖培養(yǎng)基是 $\mathrm{MS+6-BA~5.0~\mg/L+NAA}$
水解酪蛋白
酵母提取液 0.5% ;能促進東寮芋頭組培苗生根的培養(yǎng)基是
活性炭 0.5g/L+NAA0.1mg/L ,培養(yǎng)條件為光照強度
、每天光照 16h 、溫度(25±2)
、相對濕度 50% 。
研究初步探索了東寮芋頭組織培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié),包括外植體的消毒、啟動培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、增殖和生根培養(yǎng)基的篩選、培養(yǎng)條件調(diào)控及再生植株的移栽和馴化。通過一系列優(yōu)化措施的實施,能成功獲得健壯的東寮芋頭再生植株,但整體增殖系數(shù)偏低。在對芋頭莖尖進行消毒,以及后續(xù)的分化培養(yǎng)過程中,外植體均出現(xiàn)不同程度的褐化。由于褐化是植物組織培養(yǎng)過程中一種常見的現(xiàn)象,往往會影響該技術(shù)的成功實施[1]。未來研究應(yīng)進一步探討降低芋頭外植體褐化的方法(如添加防褐化劑活性炭[12-13]、維生素C等[14-15]或調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度[16-17]等),以及探索能提高東寮芋頭組織培養(yǎng)分化、增殖效率的培養(yǎng)基配方[18-23]
此外,光照強度、光照周期、溫度及相對濕度的調(diào)控等培養(yǎng)條件對植株生長也具有顯著影響。因此,應(yīng)設(shè)置不同的培養(yǎng)條件,通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來促進植株在組培階段的健康生長和高效繁殖。提高再生植株的移栽成活率和適應(yīng)能力也是提高東寮芋頭組織快繁技術(shù)不可或缺的環(huán)節(jié),可對栽培基質(zhì)及管理方式進一步優(yōu)化。
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