吳曉文,張長太,李佳佳,凡孝菊*,周景文*

1(江蘇創(chuàng)健醫(yī)療科技股份有限公司,江蘇 常州,213000)2(江南大學 未來食品科學中心,江蘇 無錫,214000)

乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)是一種功能性糖蛋白,屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族,大約由700個氨基酸構(gòu)成,分子質(zhì)量在80 kDa左右[1]。1939年,SORENSEN等[2]首次從牛奶中分離得到了這種粉紅色的蛋白質(zhì);1960年,JOHANSON[3]又從人乳中成功將其提取出來。人初乳中富含乳鐵蛋白,平均濃度可達到6 g/L;隨著時間的推移,濃度會降低并維持在1～2 g/L水平;牛初乳和常乳中的乳鐵蛋白濃度分別為0.8 g/L左右和0.03～0.49 g/L,低于人初乳和常乳中的含量。除了普遍存在于哺乳動物的乳汁當中,乳鐵蛋白還分布在膽汁、胃腸液、尿液、眼淚、唾液等各種黏膜分泌物里,同時也是次級中性粒細胞的重要組成成分[3-4]。

人乳鐵蛋白(human lactoferrin,hLF)由703個氨基酸組成,METZ-BOUTIGUE等[5]在1984年完成了對其整體序列的測定;1989年,ANDERSON等[3]解析了人乳鐵蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。乳鐵蛋白的三維構(gòu)象呈兩個球形葉片狀,N-葉與C-葉之間有40%左右的序列一致性,兩者通過一段α螺旋連接。以人乳鐵蛋白1FCK(文件1FCK來自PDB數(shù)據(jù)庫)為例,N-葉與C-葉又各自分為2個結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)域之間的裂隙是Fe3+的結(jié)合位點,結(jié)合時需要陰離子如CO32-的配合(圖1)[6]。乳鐵蛋白在哺乳動物當中的進化高度保守[7]。牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin,bLF)的氨基酸序列與人乳鐵蛋白有69%的一致性,兩者的二級結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象幾乎相同,僅在N-葉與C-葉的相對位置以及兩者內(nèi)部各自2個結(jié)構(gòu)域閉合程度上略有差異[8]。除了人和牛之外,數(shù)據(jù)庫里還包含其他8個物種的乳鐵蛋白序列,分別來自鼠、馬、豬、山羊、綿羊、水牛、牦牛和駱駝[9-10]。在不同的哺乳動物體內(nèi),乳鐵蛋白含量存在顯著差異,而針對不同來源的乳鐵蛋白進行生化特性對比研究的報道很少[7]。

a-乳鐵蛋白的三維構(gòu)象;b-與金屬離子相互作用的氨基酸殘基位點

乳鐵蛋白作為一種糖蛋白,通過Asn-X-Thr/Ser三肽中的天冬酰胺殘基進行N-連接型糖基化。從氨基酸序列上可預(yù)測出,人乳鐵蛋白有4個潛在位點,但研究結(jié)果表明,其中只有2個真正連接了糖鏈[5];牛乳鐵蛋白有5個潛在位點,只有3個連接了糖鏈[8]。乳鐵蛋白的空間構(gòu)象和生物活性不受糖基化的直接影響,但其抵抗胰蛋白酶降解的能力會在糖基化之后增強,從而提升結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[11]。來自哺乳動物的天然乳鐵蛋白帶有復(fù)雜型糖鏈,而重組表達的乳鐵蛋白,根據(jù)不同的表達系統(tǒng)和培養(yǎng)條件,具有多樣性的糖基化形式,或者缺乏糖基化修飾[12]。

1 乳鐵蛋白的生物學功能

乳鐵蛋白是哺乳動物固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分,具有廣泛的抵抗病原體的活性,包括抵抗細菌、真菌、病毒的能力及抗寄生蟲能力等;同時,乳鐵蛋白還具有抗氧化、抗癌、促進成骨細胞增殖以及免疫調(diào)節(jié)等功能[13-15]。

1.1 對細菌的影響

乳鐵蛋白能夠通過結(jié)合Fe3+限制細菌的生長。鐵是大多數(shù)細菌生長所必需的元素,乳鐵蛋白憑借高度的親和力競爭性螯合Fe3+,從而抑制大腸桿菌、變形鏈球菌、霍亂弧菌等需鐵細菌的生長,以及抑制銅綠假單胞菌等病原菌生物膜的形成[16];自身鐵飽和度越低,乳鐵蛋白的抑菌活性越強[17]。然而,鐵爭奪只是延緩了細菌的生長繁殖,補鐵之后抑菌作用會消失[18]。

除了抑菌作用之外,乳鐵蛋白還具有直接的殺菌活性。對于細胞壁含有脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的革蘭氏陰性菌,乳鐵蛋白能夠與細胞外膜上的孔道蛋白結(jié)合,誘導(dǎo)LPS釋放,從而增加外膜對疏水分子的通透性,有利于溶菌酶和其他抗菌分子進入菌體內(nèi)部殺死細菌[19]。對于細胞壁含有負電性磷壁酸的革蘭氏陽性菌,乳鐵蛋白能夠通過靜電相互作用,以N-葉帶正電荷的氨基酸殘基與磷壁酸結(jié)合,打破非極性環(huán)境,改變膜通透性,使菌體因內(nèi)部成分外泄而死[20]。

1.2 對真菌的影響

乳鐵蛋白對包括酵母菌和霉菌在內(nèi)的多種真菌病原體具有抑制或殺傷作用。FERNANDES等[21]評估了牛乳鐵蛋白對22種酵母和24種霉菌的抗真菌活性,及其與6種廣泛使用的抗真菌藥物的協(xié)同效果。實驗結(jié)果表明,牛乳鐵蛋白對所有被測試的酵母菌具有廣泛且一致的抑制能力,而只對4種霉菌有效果;其抑制酵母菌的活性會受到鐵飽和度以及消化程度的影響。當牛乳鐵蛋白與兩性霉素B(amphotericin B,AMB)聯(lián)合用于抑制真菌時,對22種酵母中的19種展現(xiàn)出高度的協(xié)同作用。LF-AMB能夠促使菌體孔隙形成、菌絲變薄以及細胞塌陷,具有應(yīng)用于抗真菌治療的潛力。

乳鐵蛋白能夠誘導(dǎo)常見的條件致病菌——白色念珠菌的調(diào)節(jié)性細胞死亡。通過掃描電鏡可觀察到,暴露于乳鐵蛋白的白色念珠菌細胞會出現(xiàn)膨脹、內(nèi)容物泄露,或者表面凹陷、裂縫等變化,最終走向死亡。2008年,ANDRéS等[22]首次證明了K+外流參與了這一細胞凋亡過程。K+通過離子通道流出導(dǎo)致滲透壓變化,細胞發(fā)生收縮從而一定程度上促進了凋亡,而菌體細胞膜的通透性并未改變。2019年,該團隊進一步提出,乳鐵蛋白抑制Pma1p H+-ATPase活性導(dǎo)致細胞質(zhì)酸化,才是調(diào)控細胞死亡通路的第一個轉(zhuǎn)導(dǎo)信號[23]。除此之外,人乳鐵蛋白誘導(dǎo)的白色念珠菌細胞凋亡樣表型還包括磷脂酰絲氨酸外化、核染色質(zhì)凝結(jié)、DNA降解和活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增加[22]。ACOSTA-ZALDVAR等[24]在釀酒酵母模型中研究該細胞凋亡機制時,進一步發(fā)現(xiàn)了乳鐵蛋白能引起與ROS積累和細胞色素C釋放相關(guān)的線粒體功能障礙,說明線粒體能量代謝在人乳鐵蛋白的殺傷功效中起著關(guān)鍵作用。

1.3 對病毒的影響

乳鐵蛋白對感染人類和動物的多種RNA及DNA病毒具有抗性,通常而言,缺鐵型乳鐵蛋白的抗病毒效果更為顯著,但鐵飽和型也能夠起到一定的作用,可見鐵飽和度并非決定性因素[25]。一些情況下,乳鐵蛋白可以阻止病毒進入靶細胞,在病毒感染的早期發(fā)揮作用,如針對脊髓灰質(zhì)炎病毒[26]、單純皰疹病毒[27]、巨細胞病毒[28]以及艾滋病病毒[29];而另外一些情況下,乳鐵蛋白還可以直接與病毒顆粒作用,阻止其發(fā)揮毒性或者抑制其在宿主細胞中的復(fù)制,如針對丙型肝炎病毒[30]和輪狀病毒[31]。以輪狀病毒為例,乳鐵蛋白能夠與病毒顆粒結(jié)合,阻止其吸附到靶細胞上,預(yù)防感染;而在輪狀病毒感染過程中,乳鐵蛋白能夠干擾其合成抗原,即在病毒進入靶細胞后仍能保持抗病毒作用[31]。

關(guān)于乳鐵蛋白的抗病毒作用,研究者們已經(jīng)提出了幾種機制,其中被廣泛接受的,是乳鐵蛋白結(jié)合并阻斷糖胺聚糖病毒受體,特別是硫酸乙酰肝素,從而阻止病毒進入宿主細胞,避免了感染的發(fā)生[31]。但WEIMER等[32]的研究表明,體外與體內(nèi)實驗結(jié)果之間存在矛盾,乳鐵蛋白的抗病毒機制仍有待進一步探索。

1.4 功能特性

多項體內(nèi)、體外試驗表明,乳鐵蛋白是一種具有生理活性的功能性蛋白質(zhì),參與調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)節(jié)鐵吸收、促進腸道細胞增殖分化、促進成骨細胞增殖、抗氧化以及抗腫瘤等生物體內(nèi)多種病理生理過程[33]。這些功能使得乳鐵蛋白具有強大的應(yīng)用價值和市場潛力,引起了食品與飼料行業(yè)及醫(yī)學界的廣泛關(guān)注。

2018年,中國營養(yǎng)學會婦幼營養(yǎng)分會發(fā)布《乳鐵蛋白嬰幼兒健康效應(yīng)專家共識》,明確了LF能夠降低嬰幼兒、兒童呼吸道疾病和腹瀉的發(fā)病率,降低新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎和敗血癥的發(fā)病率和死亡率,提高兒童幽門螺桿菌根除率,促進幼兒生長發(fā)育[34]。4年之后,中國營養(yǎng)學會臨床營養(yǎng)分會又發(fā)布了《乳鐵蛋白臨床應(yīng)用中國專家共識》,進一步明確了LF功能特性的九大共識,將LF納入專業(yè)醫(yī)學視角,以期將LF合理應(yīng)用到更多臨床治療場景[35]。截至目前,我國尚無添加LF的藥品,成人可以通過攝入普通食品或者保健品進行補充。隨著人們對LF了解的逐漸深入以及LF相關(guān)產(chǎn)品的推廣普及,通過補充LF來提高免疫力和增強身體素質(zhì),有可能成為全民的共同選擇。

2 乳鐵蛋白的表達系統(tǒng)

乳鐵蛋白因其獨特的生物學活性,在食品、日用品、保健品和藥品中都有廣闊的應(yīng)用空間。通過轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng)在工業(yè)級別上生產(chǎn)重組乳鐵蛋白,既可以打破因畜牧業(yè)規(guī)模和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)帶來的產(chǎn)量限制,又可以解決人源乳鐵蛋白獲得困難的問題。多數(shù)已開發(fā)的表達系統(tǒng)生產(chǎn)的重組乳鐵蛋白,在物理、生化和生物學特性上,與天然乳鐵蛋白相比沒有顯著區(qū)別[36]。

2.1 細菌

已報道的成功用于乳鐵蛋白異源表達的細菌有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌等。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有操作簡單、遺傳背景清晰、成本低廉等優(yōu)勢,劣勢是重組蛋白缺乏合適的翻譯后加工修飾,無法通過連接糖鏈阻止聚集而多以包涵體形式存在[12]。另外,大腸桿菌細胞壁外膜中的脂多糖可在臨床上引起多種生理和病理反應(yīng)[37],以及大腸桿菌本身作為條件致病菌,對人體健康也存在風險;因此,以大腸桿菌為宿主生產(chǎn)乳鐵蛋白,必須對最終產(chǎn)品的內(nèi)毒素殘留水平和微生物指標進行嚴格的監(jiān)測?？莶菅挎邨U菌和干酪乳桿菌雖然沒有大腸桿菌應(yīng)用廣泛,但這兩種菌株作為一般認為安全(generally recognized as safe,GRAS)菌株,在安全性上具有先天優(yōu)勢。

WANG等[9]通過BL21(DE3)表達系統(tǒng)獲得了昆明小鼠乳鐵蛋白及其N-葉部分,經(jīng)鎳柱純化后產(chǎn)量分別為17 mg/L和20 mg/L;由于兩者均以包涵體的形式存在,因此抗菌效果不夠理想。HU等[38]通過BL21(DE3)表達系統(tǒng)獲得了以包涵體形式存在的人乳鐵蛋白C-葉部分,經(jīng)純化和復(fù)性處理后產(chǎn)量為700 mg/L;與全長人乳鐵蛋白相比,該工作中表達的乳鐵蛋白C-葉具有更強的抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231的能力,這可能要歸因C-葉獨特的空間構(gòu)象和高底物親和力,更加詳細的抗腫瘤機制有待進一步研究。GARA-MONTOYA等[39]通過BL21(DE3)成功表達了牛乳鐵蛋白-硫氧還蛋白融合蛋白,產(chǎn)量為15.3 mg/L;經(jīng)凝血酶和胃蛋白酶處理所得的乳鐵蛋白肽,對大腸桿菌的抑制作用是未處理樣品的4倍。JIN等[40]以枯草芽孢桿菌為宿主,通過優(yōu)化氨基酸密碼子和選擇最優(yōu)啟動子Pveg,成功表達了牛乳鐵蛋白N-葉,純化后產(chǎn)量為16.5 mg/L。表達產(chǎn)物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出明顯的抑菌活性。

乳鐵蛋白具有廣譜抑菌性,但在以上工作中,重組乳鐵蛋白均在細胞內(nèi)完成表達,似乎并未對宿主產(chǎn)生毒害作用,研究者們沒有就此問題開展討論。對于干酪乳桿菌表達體系,情況則又有不同。由于乳酸菌可以適應(yīng)缺鐵環(huán)境,乳鐵蛋白的存在不會對其活力產(chǎn)生負面影響,反而是可以促進腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖[41-42]。CHEN等[43]將干酪乳桿菌作為宿主表達人乳鐵蛋白,產(chǎn)物在培養(yǎng)基中的濃度達到了10.6 mg/L。以重組干酪乳桿菌對小鼠進行灌胃試驗,與使用野生型菌株灌胃的對照組相比,實驗組小鼠對致病性大腸桿菌表現(xiàn)出更強的抵抗能力和更低的腸道損傷,說明該重組干酪乳桿菌具有作為腸道微生態(tài)制劑的潛力。

2.2 酵母

酵母表達系統(tǒng)具有培育周期短、操作簡單的特點,同時還具有翻譯后加工修飾的功能,重組產(chǎn)物多以高甘露糖基化的糖蛋白形式存在;除此之外,目的蛋白還可以通過分泌途徑分泌至酵母細胞外,提取程序簡單。相比于大腸桿菌等常用的原核表達體系,使用酵母表達乳鐵蛋白更便于工業(yè)化生產(chǎn)[12, 44]。

LIANG等[45]在1993年以釀酒酵母為宿主成功表達了重組人乳鐵蛋白。在該表達系統(tǒng)中,部分產(chǎn)物可以通過酵母轉(zhuǎn)化酶信號肽分泌至細胞外,培養(yǎng)液中濃度為1.5～2 mg/L,還有部分產(chǎn)物殘留在細胞內(nèi)。測試結(jié)果表明,分泌型重組目的蛋白的結(jié)構(gòu)經(jīng)過了糖基化修飾,且具有Fe2+和Cu2+結(jié)合能力。然而,在后期進行大規(guī)模培養(yǎng)時,出現(xiàn)了產(chǎn)物表達量顯著低于前期測試水平的現(xiàn)象,作者推測可能是由于乳鐵蛋白對酵母細胞具有毒性從而導(dǎo)致了表達量難以穩(wěn)定。并且,在表達分子質(zhì)量高于30 kDa的外源蛋白時,釀酒酵母在分泌效率上不占優(yōu)勢[46],所以此后更多的團隊把畢赤酵母表達重組乳鐵蛋白作為研究方向。

PARAMASIVAM等[47]首次在畢赤酵母中成功表達了完整的馬乳鐵蛋白,搖瓶中的產(chǎn)量達到16.5 mg/L,圓二色光譜測試結(jié)果證實了產(chǎn)物具有合理的空間構(gòu)象。IGLESIAS-FIGUEROA等[48]將牛乳鐵蛋白在畢赤酵母KM71-H中進行胞內(nèi)表達,最終產(chǎn)量達到3.5 g/L,表達產(chǎn)物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和部分銅綠假單胞菌具有抑制作用。該工作中,目的蛋白的表達量非?？捎^,但由于需要對菌體進行裂解以及對包涵體進行復(fù)性處理,純化工藝復(fù)雜,所以工業(yè)化難度較大。此外,來源于藏羊[49]、牦牛[10]的乳鐵蛋白也都在畢赤酵母中得到了成功表達,分泌表達量分別為60 mg/L和40 mg/L,且產(chǎn)物均具有相應(yīng)的抑菌活性。

在畢赤酵母中,最常用的醇氧化酶啟動子需要通過甲醇進行誘導(dǎo),使得該表達體系在生產(chǎn)應(yīng)用時存在安全隱患。以上研究均處于實驗室階段,未對該問題進行討論。如果項目進入到了投產(chǎn)階段,那么對每批次的產(chǎn)品進行跟蹤檢測,確保甲醇殘留量在歷經(jīng)純化、干燥等工藝后已降低至安全限量以下,是不可缺少的程序。

2.3 霉菌

霉菌作為生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細胞工廠,具有很多獨特的優(yōu)勢。它具有強大的蛋白表達能力和分泌途徑,能夠正確地進行各種翻譯后處理,包括糖基化、多肽鏈剪切、二硫鍵形成等,并且能夠?qū)㈠e誤折疊的蛋白快速清除[50]。更加重要的是,霉菌還具有很強的生存能力,這使得它優(yōu)于以大腸桿菌、畢赤酵母為代表的原核體系和酵母體系,尤其適合作為生產(chǎn)乳鐵蛋白這種具有廣譜抗菌性的“毒蛋白”的底盤細胞。

來自Baylor醫(yī)學院的Ward課題組,是最早在霉菌中異源表達哺乳動物糖蛋白的團隊。1992年,該課題組在構(gòu)巢曲霉中表達人乳鐵蛋白,獲得了5 mg/L的產(chǎn)量[51];同時期在米曲霉中表達人乳鐵蛋白,分泌表達量為25 mg/L,且重組產(chǎn)物與天然乳鐵蛋白具有相同的分子質(zhì)量、鐵結(jié)合能力以及免疫活性[52]。1995年,該團隊又進一步在泡盛曲霉中將人乳鐵蛋白與葡萄糖淀粉酶進行融合表達,再通過內(nèi)源性KEX-2肽酶切割加工成為成熟的乳鐵蛋白,該重組產(chǎn)物具有與人腸細胞受體結(jié)合的能力,且分泌表達產(chǎn)量高達2 g/L,已具備商業(yè)化價值[53]。雖然基于該重組乳鐵蛋白開發(fā)的藥物,因在三期臨床試驗中與安慰劑組相比沒有療效上的差異[54],未能成功走向市場,但該研究仍讓我們窺見了霉菌體系生產(chǎn)重組乳鐵蛋白走向產(chǎn)業(yè)化的可能。

2.4 動物細胞系和轉(zhuǎn)基因哺乳動物

在動物細胞系和轉(zhuǎn)基因動物中誘導(dǎo)表達重組產(chǎn)物,是目前基礎(chǔ)研究、生物制藥以及基因治療的重要研究方向[55]。通過哺乳動物細胞表達目的蛋白,能夠獲得與天然蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更加一致的產(chǎn)物;但由于細胞培養(yǎng)對專業(yè)技術(shù)和經(jīng)濟投入的較高要求,難以避免地在規(guī)?；瘧?yīng)用上受到限制[56]。通過轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)目的蛋白,乳腺細胞無疑是最理想的表達場所;乳腺是外分泌器官,乳汁不會進入體循環(huán)影響宿主的生理代謝,且重組蛋白在分泌過程中已經(jīng)過充分的加工和修飾,一般具有穩(wěn)定的生物活性[57]。

目前,人乳鐵蛋白已在轉(zhuǎn)基因小鼠、山羊、豬和牛中得到了成功表達,產(chǎn)量從3 g/L到30 g/L不等,重組產(chǎn)物均與天然人乳鐵蛋白具有相似的鐵結(jié)合釋放特性以及抗菌能力[56,58-61]。荷蘭Pharming公司聯(lián)合萊頓大學[60]克隆的轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在泌乳期分泌人乳鐵蛋白,分泌量可達13 g/L,但是小鼠乳腺的尺寸限制了乳鐵蛋白的規(guī)?；a(chǎn),相比之下,奶牛乳腺生物反應(yīng)器是更加理想的靶蛋白表達系統(tǒng)。該團隊又通過核顯微注射法克隆了轉(zhuǎn)基因牛,重組人乳鐵蛋白的表達水平在整個泌乳期內(nèi)保持平穩(wěn),產(chǎn)量達到3 g/L,且未影響牛奶的總體產(chǎn)量及理化參數(shù)[61]。WANG等[56]采用相比于顯微注射更加簡單高效的核轉(zhuǎn)染法,獲得了無抗生素標記的高拷貝細菌人工染色體(bacterial artifcial chromosome,BAC)轉(zhuǎn)基因牛,克隆牛表達的人乳鐵蛋白產(chǎn)量可達4.5～13.6 g/L。該團隊通過進一步的胚胎移植繁育了200頭轉(zhuǎn)基因牛,表明轉(zhuǎn)基因牛乳腺生物反應(yīng)器具有大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)的潛力;但另一方面,轉(zhuǎn)基因動物群的飼養(yǎng)仍要依賴傳統(tǒng)的養(yǎng)殖模式,在投入產(chǎn)出比和可持續(xù)發(fā)展上還需要更多考量。

表1 乳鐵蛋白的表達系統(tǒng)Table 1 Various expression systems of recombinant lactoferrin

3 乳鐵蛋白的法規(guī)管理與應(yīng)用

3.1 法規(guī)管理

3.1.1 天然乳鐵蛋白

2000年,美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)首次批準bLF為GRAS物質(zhì),可用于特定食品的生產(chǎn);2012年,歐盟委員會批準bLF可添加于特定食品中以強化其健康功能。關(guān)于應(yīng)用范圍和使用限量,美國FDA陸續(xù)許可將bLF用于嬰幼兒配方乳粉、調(diào)制乳粉、風味發(fā)酵乳、冰淇淋、甜點及口香糖等產(chǎn)品中,添加量在100～400 mg/100 g;歐盟允許bLF應(yīng)用的范圍更廣,除上述品類外,還包括飲料、糖果、糕點以及奶酪基產(chǎn)品等,添加量在80～3 000 mg/100 g[65]。

在我國,乳鐵蛋白屬于食品添加劑當中的細分類別——營養(yǎng)強化劑,產(chǎn)品規(guī)格按照GB 1903.17—2016《食品安全國家標準 食品營養(yǎng)強化劑 乳鐵蛋白》進行管理,使用限量的發(fā)展歷程見表2。根據(jù)GB 14880—2012 《食品安全國家標準 營養(yǎng)強化劑使用標準》,乳鐵蛋白可添加到調(diào)制乳、風味發(fā)酵乳和含乳飲料中,使用量≤1.0 g/kg;可用在嬰幼兒配方食品中,使用量≤1.0 g/kg(限粉狀產(chǎn)品,液態(tài)按稀釋倍數(shù)折算)。2012年,衛(wèi)生部發(fā)布第15號公告,附件4《鐵等8種擴大使用范圍及用量的食品營養(yǎng)強化劑》中規(guī)定,乳鐵蛋白可用于調(diào)制乳粉,使用量≤1.0 g/kg。2013年,衛(wèi)生計生委發(fā)布第11號文件《關(guān)于批準抗壞血酸鈉等8種食品添加劑擴大使用范圍用量的公告》,乳鐵蛋白在嬰幼兒配方食品中的最大使用量為1.0 g/L,以即食狀態(tài)計,粉狀產(chǎn)品按沖調(diào)倍數(shù)增加使用量。

表2 乳鐵蛋白的使用規(guī)定Table 2 Regulations for the application of lactoferrin

3.1.2 重組乳鐵蛋白

現(xiàn)階段,我國尚未出臺任何關(guān)于重組乳鐵蛋白的使用標準和政策,國外也沒有關(guān)于重組乳鐵蛋白的安全食用歷史。2021年,國家衛(wèi)健委正式打開了轉(zhuǎn)基因食品添加劑新品種的申報路徑,如果針對重組乳鐵蛋白進行申報,需要先根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》對產(chǎn)品進行轉(zhuǎn)基因生物安全評價;取得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部出具的轉(zhuǎn)基因安全評價證書之后,再參照《食品添加劑新品種管理辦法》和《食品添加劑新品種申報與受理規(guī)定》向國家衛(wèi)生計生委提出關(guān)于食品添加劑新品種生產(chǎn)與經(jīng)營的申請。

3.2 生產(chǎn)與應(yīng)用

1985年,比利時Oleofina公司成為首家商業(yè)化生產(chǎn)牛乳鐵蛋白的企業(yè)。1989年,日本森永乳業(yè)開始在德國Milei公司生產(chǎn)牛乳鐵蛋白。隨后,新西蘭新萊特、荷蘭皇家菲仕蘭、澳洲百斯頓等公司也加入進來,全球乳鐵蛋白年產(chǎn)量從2006年的不足80 t上升至2015年的221 t,并在2021年達到300 t左右[66-67]。2022年5月,飛鶴首條乳鐵蛋白自動化生產(chǎn)線也已正式投產(chǎn),開創(chuàng)了國內(nèi)乳業(yè)先河。1986年,森永乳業(yè)首次將乳鐵蛋白應(yīng)用于嬰兒配方乳粉的生產(chǎn)。歷經(jīng)多年發(fā)展,乳鐵蛋白在日本的應(yīng)用范圍已擴大至酸奶、飲料、營養(yǎng)補充劑、寵物食品、牙膏和化妝品等,在產(chǎn)品中起到改善腸道菌群、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗感染等作用[66,68]。目前,我國對乳鐵蛋白的應(yīng)用多集中在嬰幼兒配方乳粉和保健食品領(lǐng)域,原料主要依賴進口。

重組人乳鐵蛋白(recombinant human lactoferrin,rhLF)在抗菌、鐵的結(jié)合釋放性能等方面與天然人乳鐵蛋白(hLF)具有相似的性質(zhì)。體外試驗結(jié)果表明,胃蛋白酶能在60 min內(nèi)將rhLF完全消化,與hLF的消化情況相似。截至目前,沒有關(guān)于人類對乳鐵蛋白這種存在于自身分泌腺中的物質(zhì)過敏的報道。因此,對具有相同氨基酸序列的外源蛋白質(zhì)過敏的可能性幾乎可以忽略不計[69]。另外,戴亞妮等[70]通過急性經(jīng)口毒性試驗和90 d喂養(yǎng)試驗證明,rhLF屬無毒級產(chǎn)品,無亞慢性毒性,無潛在的食用安全風險。

2022年8月,新加坡生物技術(shù)公司TurtleTree宣布,將通過發(fā)酵技術(shù)(乳腺細胞)生產(chǎn)重組牛乳鐵蛋白產(chǎn)品,專注于嬰兒營養(yǎng)、免疫、腸道健康等方面的研究,并計劃于2023年率先在美國推出商業(yè)化產(chǎn)品[71]。De Novo Dairy是首家總部位于南非的精密發(fā)酵公司,這家初創(chuàng)公司通過畢赤酵母表達體系生產(chǎn)rhLF,并計劃在2023年將新產(chǎn)品推向市場[72]。

4 總結(jié)與展望

重組乳鐵蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)與天然乳鐵蛋白基本一致,來自不同表達體系的產(chǎn)品雖然在糖基化方面存在差異,但生物活性幾乎不受影響。同時,重組乳鐵蛋白在產(chǎn)量與規(guī)格上更具可控性,在生產(chǎn)上更加高效、環(huán)保、可持續(xù),高度符合“未來食品”的特征。隨著合成生物學的快速發(fā)展,以及法規(guī)管理的與時俱進,一些勇于創(chuàng)新的生物技術(shù)公司已經(jīng)開始對重組乳鐵蛋白的商業(yè)化進行布局,未來有望出現(xiàn)重組產(chǎn)品與天然產(chǎn)品在市場上并駕齊驅(qū)的景象。

在表達體系的考量上,相比于仍要依賴傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式的轉(zhuǎn)基因動物,以及培養(yǎng)成本居高不下的哺乳動物細胞,能夠?qū)χ亟M蛋白進行翻譯后修飾的酵母和霉菌無疑是更加具有競爭力的選擇。鑒于乳鐵蛋白具有廣譜抑菌性,想要獲得高效分泌和表達的菌株,宿主細胞對重組乳鐵蛋白的耐受程度是關(guān)鍵因素?；蛟S,可以通過高通量篩選或者底盤細胞改造等手段,獲得具有商業(yè)價值的高產(chǎn)菌株,最終促成重組乳鐵蛋白的產(chǎn)業(yè)化之路。