摘 要:為探究大腸菌群測(cè)試片法在食品檢測(cè)中的可行性,依據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 16140-2:2016中的性能指標(biāo)驗(yàn)證要求,對(duì)MicroFast?大腸菌群測(cè)試片法進(jìn)行包容性、排他性,以及與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》(GB 4789.3—2016)中方法的一致性驗(yàn)證,采用t-檢驗(yàn)和Bland-Altman分析方法進(jìn)行一致性分析評(píng)價(jià)。16株目標(biāo)菌在測(cè)試片上形成典型菌落,24株非目標(biāo)菌中的23株均未在測(cè)試片上形成菌落,阿巴特圖巴沙門(mén)氏菌ATCC 35640在測(cè)試片上形成非典型菌落。測(cè)試片法和GB 4789.3—2016中方法的檢測(cè)結(jié)果呈正相關(guān)(R2>0.976);95%置信區(qū)間的樣品比例為1∶25,滿(mǎn)足不得高于1∶20的要求;所有食品類(lèi)型的β-期望容忍區(qū)間(β-ETI)均在±0.5對(duì)數(shù)單位范圍內(nèi),測(cè)試片法和GB 4789.3—2016方法具有很好的一致性。MicroFast?大腸菌群測(cè)試片法對(duì)純菌株的包容性和排他性良好,在一致性方面符合ISO 16140-2:2016對(duì)方法等效性的要求,可作為替代方法,用于檢測(cè)食品中的大腸菌群。
關(guān)鍵詞:測(cè)試片法;大腸菌群;平板計(jì)數(shù)法
Validation of Coliform in Food by Test Tablets Method
TAO Wenjing1, DONG Bin2, JIAO Fenglian3, ZHOU Qi1, QU Lianhai1, WANG Qi3*
(1.Beijing Meizheng Bio-Tech Co., Ltd., Beijing 102200, China; 2.Beijing Guangming Jianeng Dairy Co., Ltd., Beijing 101300, China; 3.SGS-CSTC Standards Technical Services Co., Ltd., (Qingdao), Qingdao 266071, China)
Abstract: This study was aimed to evaluate the feasibility of coliform detection in food by coliform test tablets. Based on performance indicator verification requirements of international standard ISO16140-2:2016, MicroFast? coliform test tablets method was used for evaluation, including inclusivity, exclusivity, and consistency with"GB 4789.3—2016 method, and t-test and Bland-Altman analysis were used for consistency analysis and evaluation. The 16 target strains all grew typical colonies on the test tablets, and 23 of the 24 non-target strains had no colonies on the test tablets. Salmonella Abatetuba ATCC 35640 formed atypical colonies on the test tablets. There was a positive correlation between the test tablets method and the national standard method (R2>0.976). The proportion of samples exceeding the 95% confidence interval of the total average value of the difference was 1∶25, which met the ratio requirement of no more than 1∶20. The β-expected tolerance interval (β-ETI) for all food types was ±0.5log10 units, the two methods were in good agreement. MicroFast? coliform count plate had good performance in terms of inclusivity and exclusivity to pure strains, met the requirements of ISO16140-2:2016 for method equivalence in terms of consistency. It can be used as an alternative method for testing coliforms in food.
Keywords: test tablets method; coliforms; plate count method
大腸菌群(Coliforms)是指在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌[1]。大腸菌群是表明食品衛(wèi)生狀況的指示菌,已經(jīng)規(guī)定了49種食品大腸菌群的限量指標(biāo)[2],大腸菌群作為食品衛(wèi)生管理和安全性評(píng)價(jià)的微生物檢測(cè)項(xiàng)目越來(lái)越受到人們的重視[3]。
目前,食品中大腸菌群計(jì)數(shù)的常規(guī)方法是平板計(jì)數(shù)法,主要參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》(GB 4789.3—2016)[1]進(jìn)行檢驗(yàn),該方法雖然是微生物檢驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但其操作流程復(fù)雜,工作量較大且對(duì)操作人員的經(jīng)驗(yàn)要求較高,致使檢測(cè)效率不高[4]。隨著國(guó)際交流合作的開(kāi)展、標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步互認(rèn),逐漸出現(xiàn)多種經(jīng)過(guò)國(guó)際權(quán)威組織認(rèn)證的即用型大腸菌群檢測(cè)產(chǎn)品,如測(cè)試片等[5]。測(cè)試片主要成分包括顯色劑(由顯色基團(tuán)和微生物代謝物組成)、培養(yǎng)基、冷水可凝膠等,微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的酶與顯色劑中的特定代謝物反應(yīng),使顯色基團(tuán)顯色[6]。測(cè)試片法操作簡(jiǎn)單,結(jié)果易觀(guān)察,誤差小。大腸菌群測(cè)試片操作簡(jiǎn)單,結(jié)果判定符合GB 4789.3—2016中對(duì)大腸菌群“產(chǎn)酸、產(chǎn)氣”的定義,培養(yǎng)時(shí)間僅18~24 h[7],實(shí)驗(yàn)工作效率高。因此,測(cè)試片法在食品檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。許金榜[8]采用大腸菌群4種目標(biāo)菌對(duì)測(cè)試片和VRBA進(jìn)行分離與選擇性比較,結(jié)果表明,VRBA和測(cè)試片的檢測(cè)性能均可滿(mǎn)足大腸菌群的定量檢測(cè)要求。
本研究擬采用MicroFast?大腸菌群測(cè)試片,以平板計(jì)數(shù)法[1]為參考方法,參考國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 16140-2:2016[9]的性能指標(biāo)驗(yàn)證要求,對(duì)測(cè)試片法進(jìn)行包容性、排他性及方法一致性驗(yàn)證。
1 材料與方法
1.1 試劑及設(shè)備
MicroFast?大腸菌群測(cè)試片,北京美正生物科技有限公司;營(yíng)養(yǎng)肉湯、磷酸鹽緩沖液、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂、煌綠乳糖膽鹽肉湯,北京陸橋技術(shù)股份有限公司。BAGMIXER 400均質(zhì)器,法國(guó)Interscienc公司;VORTEX GENIUS3渦旋振蕩器,德國(guó)IKA公司;LRH-250恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。
1.2 菌株
目標(biāo)菌株共16株,包括大腸埃希氏菌(Escherichia coli,CGMCC 1.0090;ATCC 25922;ATCC 8739;CICC 23657;CICC 10305;CICC 10354;ATCC 8099)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae,ATCC 4352)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes,ATCC 13048)、莫金斯克羅諾桿菌(C. muytjensii,ATCC 51239)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,CICC 10667)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(Enteroinvasive Escherichia coli,CICC 10662)、大腸埃希氏菌O157(Escherichia coli O157,CICC 10907)、腸道致病性大腸埃希氏菌(Enteropathogenic Escherichia coli,CICC 24189)、腸道出血性大腸埃希氏菌(Enterohemorrhagic Escherichia"coli,CICC 24187)、腸道集聚性大腸埃希氏菌(Enteroag-gregative Escherichia coli,CICC 24186)。
非目標(biāo)菌株共24株,包括阿巴特圖巴沙門(mén)氏菌(S. abaetetuba,ATCC 35640)、銅綠假單胞菌(P. aeruginosa,ATCC 9027)、銅綠假單胞菌(P. aeruginosa,AS 1.1129)、銅綠假單胞菌(P. aeruginosa,ATCC15442)、福氏志賀氏菌(Shigella flexneri,ATCC 12022)、屎腸球菌(Enterococcus faecium,ATCC 8459)、副溶血性弧菌(Vibrio para,ATCC 17802)、金黃色葡萄球菌(S. aureas,ATCC 6538)、金黃色葡萄球菌(S. aureas,ATCC 25923)、金黃色葡萄球菌(S. aureas,ATCC 6538p)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,ATCC 49619)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis,ATCC 33186)、熒光假單胞菌(P. fluoresoens,ATCC 13525)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,CICC 6045)、伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii,CICC 21663)、英諾克李斯特氏菌(Listeria innocua,CICC 10297)、蠟樣芽孢桿菌(B. cereus,ATCC 11778)、蠟樣芽孢桿菌(B. cereus,CMCC 63301)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes,CICC 10373)、萊士曼氏乳酸桿菌(Lactobacillus leichmannii,ATCC 7830)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus casei spp. rhamnosus,ATCC 7469)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,ATCC 19115)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis,ATCC 11774)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis,ATCC 6633)。
1.3 食品基質(zhì)
選用5大類(lèi)食品類(lèi)型,每個(gè)大類(lèi)選擇6種食品基質(zhì),包括市售乳及乳制品,冷凍飲品,水果和蔬菜,肉及肉制品,糧食和糧食制品。其中22種采取人工污染接種方式的食品基質(zhì)見(jiàn)表1。
1.4 試驗(yàn)方法
1.4.1 參考方法
以《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》(GB 4789.3—2016)[1]中的平板計(jì)數(shù)法為參考方法。
1.4.2 測(cè)試片法
參照MicroFast?大腸菌群測(cè)試片說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。打開(kāi)測(cè)試片覆蓋膜,將1 mL樣液滴入培養(yǎng)基中央,慢慢蓋上蓋膜,待樣液完全滲入培養(yǎng)基內(nèi),置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),(36±1)℃培養(yǎng)18~24 h,計(jì)數(shù)測(cè)試片上帶氣泡的紅色菌落。
1.4.3 包容性和排他性驗(yàn)證
分別將目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌共40株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)后,梯度稀釋成濃度為10~100 CFU·mL-1的菌液,分別取上述菌液1 mL添加到測(cè)試片上,(36±1)℃培養(yǎng)18~24 h,觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài)。
1.4.4 方法一致性驗(yàn)證
(1)菌株準(zhǔn)備。選用大腸埃希氏菌(ATCC 25922)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC 4352)和產(chǎn)氣腸桿菌(ATCC 13048)3株陽(yáng)性菌作為目標(biāo)菌,復(fù)蘇培養(yǎng)后,梯度稀釋成濃度為250~2 500 CFU·mL-1、2 500~25 000 CFU·mL-1 和25 000~250 000 CFU·mL-1的低、中、高3種濃度的菌液。
(2)樣本準(zhǔn)備。食品基質(zhì)選擇自然污染樣品和人工添加樣品,每個(gè)食品類(lèi)型的基質(zhì)包括低、中、高3種污染水平,每種食品基質(zhì)做5個(gè)重復(fù)測(cè)試。因?yàn)槭称坊|(zhì)含有背景菌,所以只添加目標(biāo)陽(yáng)性菌。每個(gè)樣品稱(chēng)取5份,每份25 g,分別加入1 mL 1.4.4(1)中對(duì)應(yīng)濃度的目標(biāo)菌,使得每份樣品中目標(biāo)菌的含量為低濃度10~100 CFU·g-1、中濃度100~1 000 CFU·g-1、高濃度1 000~10 000 CFU·g-1。
(3)樣品測(cè)試。在制備好的樣本中加入225 mL無(wú)菌生理鹽水,用BAGMIXER 400均質(zhì)器拍打2 min,制成1∶10的樣品勻液。吸取1∶10樣品勻液1 mL,沿管壁緩慢注入盛有9 mL稀釋液的無(wú)菌試管中,在渦旋振蕩器上振蕩混勻,制成1∶100的樣品勻液。按照上述操作制備梯度稀釋液。選擇3個(gè)適宜稀釋度的稀釋液,分別按照參考方法和測(cè)試片法進(jìn)行測(cè)試。
1.5 數(shù)據(jù)處理
為方便統(tǒng)計(jì),以10為底對(duì)檢測(cè)結(jié)果取對(duì)數(shù)。使用t-檢驗(yàn)分析測(cè)試片法和參考方法的偏倚范圍和β-期望容忍區(qū)間,使用Bland-Altman方法,采用Microsoft Excel繪制散點(diǎn)圖評(píng)估測(cè)試片法與參考方法的一致性。
2 結(jié)果與分析
2.1 包容性和排他性驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
培養(yǎng)后對(duì)MicroFast?大腸菌群測(cè)試片上的菌落形態(tài)進(jìn)行觀(guān)察,16株目標(biāo)菌在MicroFast?大腸菌群測(cè)試片上均長(zhǎng)出紅色有氣泡的典型菌落,24株非目標(biāo)菌中的23株未在測(cè)試片上形成菌落,只有阿巴特圖巴沙門(mén)氏菌ATCC 35640在測(cè)試片上形成非典型菌落,MicroFast?大腸菌群測(cè)試片法的包容性和排他性均非常良好。
2.2 方法一致性驗(yàn)證結(jié)果
參考ISO 16140-2:2016中的性能指標(biāo),以GB 4789.3—2016平板計(jì)數(shù)法為參考方法,分析MicroFast?大腸菌群測(cè)試片法對(duì)每種食品類(lèi)型的檢測(cè)結(jié)果在線(xiàn)性、相對(duì)正確度、準(zhǔn)確度方面的性能。
2.2.1 線(xiàn)性分析
以參考方法檢測(cè)結(jié)果x為橫坐標(biāo),測(cè)試片法檢測(cè)結(jié)果y為縱坐標(biāo),繪制5種食品類(lèi)型的散點(diǎn)圖,見(jiàn)圖1。計(jì)算各食品類(lèi)型的直線(xiàn)回歸方程,相關(guān)系數(shù)(R2)分別為乳制品0.986 3,冷凍飲品0.976 5,水果和蔬菜0.996 2,肉及肉制品0.979 0,糧食和糧食制品0.997 7。
上述結(jié)果說(shuō)明,大腸菌群測(cè)試片法與參考方法檢測(cè)結(jié)果呈正相關(guān)。
2.2.2 相對(duì)正確度分析
使用Bland-Altman方法分析獲得的檢測(cè)結(jié)果,計(jì)算參考方法和測(cè)試片法的平均值和差值。偏倚可以用這兩種方法測(cè)定結(jié)果差值的平均值D進(jìn)行估計(jì),平均值D的變異情況則用差值的標(biāo)準(zhǔn)偏差SD描述。檢測(cè)的5大類(lèi)150個(gè)樣品的差值在-0.477 1~0.845 1,所有樣品的差值的總平均值為-0.010 5,標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.144 7。按照公式(1)計(jì)算所有樣品差值的總平均值的95%置信區(qū)間為(-0.298 0,0.277 0)。95%置信區(qū)間的計(jì)算公式為
式中:D為兩種方法檢測(cè)結(jié)果的差值的平均值;T為t-分布的百分位數(shù);SD為兩種方法檢測(cè)結(jié)果差值的標(biāo)準(zhǔn)偏差;n為成對(duì)數(shù)據(jù)的個(gè)數(shù)。
以?xún)煞N檢測(cè)方法結(jié)果的平均值A(chǔ)為橫坐標(biāo),以?xún)煞N檢測(cè)方法結(jié)果的差值D為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖,見(jiàn)圖2。由散點(diǎn)圖可以看出,偏離比較大的樣品的檢測(cè)結(jié)果均<2lg CFU·g-1(即<100 CFU·g-1)。因平板計(jì)數(shù)法更適用于高濃度污染樣品的檢測(cè),對(duì)于含量在100 CFU·g-1以下的檢測(cè)結(jié)果會(huì)有較大的偏差。整體來(lái)看,150個(gè)樣品中超出差值的總平均值的95%置信區(qū)間的樣品數(shù)量為6,比例為1∶25,滿(mǎn)足ISO 16140-2:2016中要求的不得高于1∶20的比例,所以在相對(duì)正確度上測(cè)試片法符合性能指標(biāo)要求。
2.2.3 準(zhǔn)確度分析
對(duì)人工污染樣品,通過(guò)比較參考方法和測(cè)試片法結(jié)果,進(jìn)行準(zhǔn)確度分析。對(duì)每種樣品的5個(gè)平行測(cè)試結(jié)果取中間值,測(cè)試片法結(jié)果的中間值(Zi)的β-期望容忍區(qū)間(β-ETI)的計(jì)算公式為
式中:β-ETI為測(cè)試片法結(jié)果的中間值(Zi)的β-期望容忍區(qū)間;偏倚Bi為測(cè)試片法結(jié)果的中間值(Zi)與參考方法結(jié)果的中間值(Mi)的差值,Salt為Zi的標(biāo)準(zhǔn)偏差,計(jì)算結(jié)果詳見(jiàn)表1。
根據(jù)ISO 16140-2:2016的要求,準(zhǔn)確度的可接受性限值A(chǔ)L=±0.5對(duì)數(shù)單位。由表1可知,所有食品類(lèi)型的β-期望容忍區(qū)間(β-ETI)的上限值和下限值均在可接受性限值范圍內(nèi)。所以可認(rèn)為測(cè)試片法與參考方法是等效的。
驗(yàn)證結(jié)果表明,測(cè)試片法在對(duì)純菌株的包容性和排他性方面的性能良好,目標(biāo)菌均呈現(xiàn)典型菌落形態(tài),非目標(biāo)菌不能生長(zhǎng)或呈現(xiàn)非典型菌落形態(tài);與參考方法的檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系,在相對(duì)正確度和準(zhǔn)確度方面也均符合ISO 16140-2:2016對(duì)于方法等效性的要求。根據(jù)本次評(píng)估數(shù)據(jù),測(cè)試片法可以用于檢測(cè)食品中的大腸菌群項(xiàng)目。
3 結(jié)論與討論
本研究以GB 4789.3—2016平板計(jì)數(shù)法為參考方法,依據(jù)ISO 16140-2:2016中的性能指標(biāo)驗(yàn)證要求,對(duì)MicroFast?大腸菌群測(cè)試片法進(jìn)行包容性、排他性及方法一致性驗(yàn)證,選用40株標(biāo)準(zhǔn)菌株,5大類(lèi)食品150個(gè)樣本,使用t-檢驗(yàn)分析和Bland-Altman分析方法對(duì)結(jié)果一致性進(jìn)行分析。
使用Bland-Altman方法分析GB 4789.3—2016平板計(jì)數(shù)法和MicroFast?大腸菌群測(cè)試片方法結(jié)果,5大類(lèi)150個(gè)樣品的差值在-0.477 1~0.845 1,所有樣品差值的總平均值為-0.010 5,標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.144 7。
150個(gè)樣品中超出差值總平均值的95%置信區(qū)間的樣品數(shù)量為6,比例為1∶25,滿(mǎn)足ISO 16140-2:2016中要求的不得高于1∶20的比例,所以在相對(duì)正確度上MicroFast?大腸菌群測(cè)試片方法符合性能指標(biāo)要求。
對(duì)人工污染樣品,通過(guò)比較GB 4789.3—2016平板計(jì)數(shù)法和MicroFast?大腸菌群測(cè)試片方法結(jié)果,進(jìn)行準(zhǔn)確度分析。所有食品類(lèi)型的β-期望容忍區(qū)間(β-ETI)的上限值均小于0.5對(duì)數(shù)單位,下限值均大于-0.5對(duì)數(shù)單位。所以,可以認(rèn)為MicroFast?大腸菌群測(cè)試片方法與GB 4789.3—2016平板計(jì)數(shù)法等效。
綜上所述,MicroFast?大腸菌群測(cè)試片方法與GB 4789.3—2016平板計(jì)數(shù)法具有很好的一致性和等效性,且測(cè)試片法在檢驗(yàn)的前期準(zhǔn)備和后續(xù)驗(yàn)證方面比國(guó)標(biāo)法更簡(jiǎn)便省時(shí),提高了檢驗(yàn)的效率,且其輕便的包裝節(jié)省空間,具有一定的優(yōu)勢(shì)。在此,也建議GB4789.3—2016在修訂過(guò)程中引入大腸菌群測(cè)試片方法,對(duì)于提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)效率、準(zhǔn)確度等具有重要意義。
參考文獻(xiàn)
[1]國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì),國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù):GB 4789.3—2016[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016.
[2]蘇濤,毛永楊,田金蘭,等.食品安全標(biāo)準(zhǔn)中微生物檢驗(yàn)指標(biāo)的問(wèn)題分析及建議[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2019,10(9):2801-2807.
[3]王杰偉,孫萬(wàn)東,吳艷輝,等.乳糖膽鹽體系大腸菌群測(cè)試片的研制及性能驗(yàn)證[J/OL].食品與發(fā)酵工業(yè),1-10[2024-01-27].https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035750.
[4]徐蕾蕊,付溥博,汪琦,等.測(cè)試片法在食品菌落總數(shù)檢測(cè)中的應(yīng)用研究[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2021,12(2):472-478.
[5]CARA B E,DOROTA B P,DAVID S L.Childhood obesity: public–health crisis common sensecure[J].Lancet,2002,360(9331):473-482.
[6]劉振宇.食品中病原微生物快速檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].廣州化工,2014,42(16):32-33.
[7]AOAC Performance Tested Certificate No. 102102, MicroFast?coliform Count Plate.20232.[EB/OL].(2024-01-15)[2024-01-15].https://members.aoac.org/AOAC/My_Account/Search_RICertifiedMethods/AOAC/PTM_Validated_Methods.aspx?hkey=6fb0f362-ed2a-4d99-bc6f-9ee3aca8d0ed.
[8]許金榜.VRBA和3M PetrifilmTM快速測(cè)試片定量檢測(cè)大腸菌群的性能比較研究[J].質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督研究,2021(1):17-22.
[9]International Organization for Standardization.ISO 16140-2:2016 Microbiology of the food chain–method validation–part 2: protocol for the validation of alternative(proprietary) methods against a reference method[S/OL].(2016-06-01)[2024-01-15].https://www.iso.org/standard/54870.html.
作者簡(jiǎn)介:陶文靖(1987—),女,山東青島人,碩士,工程師。研究方向:微生物檢驗(yàn)技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)制修訂。
通信作者:王琦(1985—),女,山東青島人,本科,工程師。研究方向:微生物檢驗(yàn)技術(shù)和食品污染控制。E-mail: catherine-q.wang@sgs.com。