袁 琨,沈昊陽,賈東芬,馮 達

(1.中國計量大學(xué) 光學(xué)與電子科技學(xué)院,浙江 杭州 310018;2.杭州彩譜科技有限公司,浙江 杭州 310034;3.北京六角體科技發(fā)展有限公司,北京 101102)

大腸菌群因廣泛存在于溫血動物的糞便中和自然界中而被國際公認為檢測醫(yī)藥[1]、環(huán)境[2]及水體檢測[3-4]的安全性指示菌.目前多用濾膜法(MF)[5]和多管發(fā)酵法(MTF)進行檢測.其中,MF法是檢測大腸菌群的“金標準”[6].但是這兩種方法需要在觀察到陽性結(jié)果后進行驗證測試,測量周期長,而且測量方法繁瑣.在食品安全快速檢測工作中,亟需一種快速檢測的方法[7-8].

酶底物法(Enzyme substrate technique)采用大腸菌群細菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)分解ONPG(Ortho- nitrophenyl-β- D- galactopyranoside),使培養(yǎng)液在波長366 nm紫外光下產(chǎn)生熒光的原理,來判斷水樣中是否含有大腸菌群[9].陳燦映等研究了大腸菌群快速檢測培養(yǎng)基,實現(xiàn)了培養(yǎng)18 h.即可對大腸菌群進行檢測[10].生長時間光譜法是利用分光光度法和酶底物法相結(jié)合的一種快速檢測方法.采用分光光度法直接測量,可以獲得更短的檢測時間.蔡盡忠等基于生長時間光譜法[11]實現(xiàn)對大腸菌群9 h即可得到檢測結(jié)果,測量數(shù)值與菌落形成數(shù)的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6.

本文針對微生物快速檢測的需求,基于生長時間光譜法設(shè)計了大腸菌群快速檢測儀器.根據(jù)大腸菌群指數(shù)生長期與大腸菌群濃度的關(guān)系來計算大腸菌群初始濃度.以O(shè)NPG(鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷)為底物,研究了初始大腸菌群濃度與可見光波段特定波長處透過率測量值之間的關(guān)系,采用分光光度法對大腸菌群的生長時間進行檢測.通過構(gòu)建基于雙積分球的測量光學(xué)結(jié)構(gòu),較低的平行樣測量相對標準偏差,實現(xiàn)了更短測量時間.

1 生長時間光譜法的原理

當利用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對大腸菌群進行培養(yǎng)時,大腸菌群的數(shù)目會隨著生長時間的增加而改變.大腸菌群的繁殖過程主要分為幾個階段,接種初期大腸菌群生長會進入一個停滯期.停滯一段時間后,大腸菌群開始繁殖,進入一個指數(shù)增長的時期.指數(shù)增長到一定程度,大腸菌群的菌落數(shù)目會進入一個穩(wěn)定的時期,這個穩(wěn)定期過后,大腸菌群由于自身的原因會進入衰亡階段,如圖1.大腸菌群細菌會產(chǎn)生β-半乳糖苷酶,這種酶分解ONPG使培養(yǎng)液呈黃色,所以溶液的顏色就成為了大腸菌群菌落形成數(shù)的指示標志[12].通過分光光度法對特定波長透過率的檢測就能準確的指示大腸菌群的菌落數(shù)變化,大腸菌群的生長時間與透過率的變化如圖2.

圖1 大腸菌群生長時間曲線Figure 1 Total coliforms growth time curve

圖2 大腸菌群的生長時間與透過率的關(guān)系Figure 2 Relationship between growth time and transmissibility of total coliforms

生長時間光譜法就是利用大腸菌群繁殖過程中的指數(shù)增長這一時期,大腸菌群到達穩(wěn)定菌落數(shù)的時間與大腸菌群的初始濃度有關(guān).由大腸菌群達到穩(wěn)定期所消耗的生長時間和大腸菌群的初始濃度的特定關(guān)系進行相應(yīng)的數(shù)學(xué)計算求出大腸菌群的初始濃度.透過率到達某一個固定透過率Tt所需要的時間t與大腸菌群的初始濃度相關(guān).

在實際實驗過程中,為了使檢測時間縮短,需要使得Tt盡可能高.即分光光度測量結(jié)果在大腸菌群數(shù)量比較少時,透過率信號應(yīng)能穩(wěn)定體現(xiàn)菌群的菌落數(shù)量,需要保證多次測量的測量穩(wěn)定性.傳統(tǒng)的分光光度計多采用0/0測量幾何條件,且光束直徑較小.由于基于生長時間光譜法的大腸菌群快速檢測中,在對大腸菌群進行培養(yǎng)時,菌群是在比色皿中隨機位置出現(xiàn)的,菌群的位置和大小會造成分光光度計入射光線的散射,給測量穩(wěn)定性帶來較大影響,如圖3.所以,在儀器測量光路設(shè)計中,應(yīng)保證所有的透射光均應(yīng)被探測器檢測到,以增強測量的穩(wěn)定性.

圖3 分光光度法測量原理和散射現(xiàn)象Figure 3 Spectrophotometric measurement principle and scattering phenomenon

2 大腸菌群快速檢測儀器設(shè)計

2.1 儀器光路結(jié)構(gòu)的設(shè)計

為了增強測量穩(wěn)定性,設(shè)計了基于雙積分球結(jié)構(gòu)的雙光路測量光學(xué)結(jié)構(gòu),如圖4.光路結(jié)構(gòu)由光源、兩個探測器和兩個積分球構(gòu)成.兩個積分球的內(nèi)表面均涂敷白色高反射漫反射涂料.光源發(fā)出來的光首先進入積分球A中,光線經(jīng)過重復(fù)勻化后漫入射至比色皿,經(jīng)過在比色皿中傳輸后從比色皿后表面出射,出射光在積分球B中進行勻化后,進入傳感器.此外,為了保證測量結(jié)果不受光源波動影響,另外一個傳感器B采用光纖對光源能量波動進行實時監(jiān)測,取I=I1/I1,作為最終結(jié)果.

本設(shè)計中采用LED作為光源,以硅光電池作為檢測元器件.從LED光源發(fā)出的可見光經(jīng)積分球的勻光后照射到樣品池中,樣品的透射光在經(jīng)過積分球勻光后會經(jīng)過特定波長的濾光片,再由硅光電池收集透射光信號.這種光路結(jié)構(gòu)保證了入射至比色皿表面的入射光是漫入射光,所有方向的出射光全部可以被傳感器采集.這樣就避免了由于大腸菌群在比色皿中分布不均勻?qū)y量產(chǎn)生的影響.

圖4 雙積分球光學(xué)測量結(jié)構(gòu)Figure 4 Double-integrated sphereoptical measurement structure

2.2 測量波長選擇實驗

2.2.1 實驗材料

大腸菌群菌株分離于生活污水,酶底物ONPG(鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷),ONPG培養(yǎng)基,瓊脂培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基.

2.2.2 制備菌懸液

將大腸菌群接種于瓊脂培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)24 h,用接種環(huán)將菌體接種到0.9%生理鹽水制成菌懸液,用0.9%生理鹽水依次稀釋,制備一系列濃度為10、102、103、104、105、106、107cfu/mL的大腸菌群樣品溶液.

2.2.3 實驗方法

將不同菌落數(shù)的大腸菌群樣品溶液接種到ONPG培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫培養(yǎng)下進行測試,每隔1 min測試一次溶液透過率,測試時長為5 h.使用波長范圍為300～800 nm的分光光度計,每間隔1 nm對樣品透過率進行測量.以460 nm,515 nm,525 nm,595 nm,625 nm的測量結(jié)果為例,如圖5-9.

圖5 波長460 nm下恒溫37 ℃時8種不同菌落形成數(shù)的大腸菌群透過率隨時間的變化曲線Figure 5 Curves of the transmissibility of coliforms in 8 different concentrations at a constant temperature of 37 ℃ at a wavelength of 460 nm over time

圖6 波長515 nm下恒溫37 ℃時8種不同菌落形成單位的大腸菌群透過率隨時間的變化曲線Figure 6 Curves of the transmissibility of coliforms in 8 different concentrations at a constant temperature of 37 ℃ at a wavelength of 515 nm over time

圖7 波長525 nm下恒溫37 ℃時8種不同菌落形成單位的大腸菌群透過率隨時間的變化曲線Figure 7 Curves of the transmissibility of coliforms in 8 different concentrations at a constant temperature of 37 ℃ at a wavelength of 525 nm over time

圖8 波長595 nm下恒溫37 ℃時8種不同菌落形成單位的大腸菌群透過率隨時間的變化曲線Figure 8 Curves of the transmissibility of coliforms in 8 different concentrations at a constant temperature of 37 ℃ at a wavelength of 595 nm over time

圖9 波長625 nm下恒溫37 ℃時8種不同菌落形成單位的大腸菌群透過率隨時間的變化曲線Figure 9 Curves of the transmissibility of coliforms in 8 different concentrations at a constant temperature of 37 ℃ at a wavelength of 625 nm over time

使用所有波長測量都難以對10 cfu/mL、102cfu/mL的大腸菌群樣品溶液進行分辨,本測量方案的最低檢出限應(yīng)為102cfu/mL.

若不考慮10 cfu/mL、102cfu/mL的大腸菌群樣品溶液檢測數(shù)據(jù),在波長625 nm下恒溫37 ℃時8種不同菌落形成單位的大腸菌群透過率隨時間的變化曲線中可以明顯看出,樣品菌落形成單位越大,透過率下降的越早,和理論分析相符.所以,可以采用波長625 nm作為分光光度測量波長.

3 大腸菌群生長時間模型的建立

基于生長時間光譜法的原理,需要建立大腸菌群的生長時間與大腸菌群的初始菌落數(shù)的數(shù)學(xué)模型.大腸菌群的生長時間通過樣品透過率的變化進行測量,采用樣品從實驗開始時的初始透過率降低至初始透過率的70%時所需時間作為生長時間.

根據(jù)圖9所示的波長625 nm下恒溫37 ℃時8種不同菌落形成單位的大腸菌群透過率隨時間的變化曲線,培養(yǎng)開始時的時刻為t0,同時記錄此時樣品透過率T0.開始每分鐘對樣品透過率進行一次測量,當測量透過率ΔT≤0.7×T0時,此時刻為t,取Δt=t-t0.具體數(shù)據(jù)如表1.

表1 大腸菌群初始菌落數(shù)與生長期時間的對應(yīng)關(guān)系

生長時間t與大腸菌群特定菌落數(shù)Ct的關(guān)系可以描述為

Ct=C0×e-kΔt.

(1)

式(1)中C0為大腸菌群初始菌落數(shù),Δt為指數(shù)生長期的時長即達到穩(wěn)定時期的時間t與開始指數(shù)生長的時間t0的差值.

取對數(shù)表示關(guān)系式

lnC0=C0×e-kΔt.

(2)

對表1中的數(shù)據(jù)按照式(2)進行擬合,即可得到確定的大腸菌群初始菌落數(shù)與生長期時間的對應(yīng)關(guān)系如式(3).從實驗數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn),對大腸菌群100 cfu/mL的檢測,只需要276 min的生長時間.

lnC0=17.68-0.048 37×Δt.

(3)

4 實驗結(jié)果驗證

4.1 多次測量平行樣的相對標準偏差測試

制作102、103、104、105、106、107cfu/mL的大腸菌群樣品溶液共6組,每組10個,通過實驗測定每組溶液,每組結(jié)果的相對標準偏差如表2.

表2 不同濃度的相對標準偏差

4.2 實驗結(jié)果與濾膜法測量結(jié)果的比對

選取20個水樣,其中地表水10個,地下水10個,對每個水樣同步采用本實驗方案和濾膜法進行大腸菌群的檢測.濾膜法的檢測步驟參照《GB/T5750.12-2006生活飲用水標準檢驗方法微生物指標》中的要求[13].測量結(jié)果如圖10,相關(guān)系數(shù)為0.979.

圖10 濾膜法測量大腸菌群數(shù)目與本方案測量結(jié)果對比Figure 10 Comparison with the filter membrane method

5 結(jié)語

本文基于生長時間光譜法設(shè)計了大腸菌群快速檢測儀器.采用分光光度法對大腸菌群的指數(shù)生長時間進行檢測;通過實驗確定了625 nm作為分光光度檢測波長;設(shè)計采用了雙積分球光路結(jié)構(gòu),提高了儀器對透過率的測量穩(wěn)定性,采用樣品從實驗開始時的初始透過率降低至初始透過率的70%時所需時間作為生長時間,顯著降低了檢測所需時間,對大腸菌群100 cfu/mL的檢測,只需要276 min.建立了大腸菌群的生長時間與大腸菌群的初始菌落數(shù)的數(shù)學(xué)模型.設(shè)計實驗評價了本方案平行樣相對標準偏差小于12.61%;與濾膜法進行比對,相關(guān)系數(shù)0.979.下一步工作計劃把本方案應(yīng)用于單增李斯特、沙門氏菌、志賀氏菌等其它檢測應(yīng)用中.