張闖，趙孔祥，張敏，王利強*

（1.天津海關(guān)工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津 300457；2.天津海關(guān)動植物食品檢測中心，天津 300457）

大麻中主要成分有大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚3 種。其中大麻酚存在于大麻葉中，是一種脂溶性且不具有精神活性的大麻素，在藥用方面可以起到止咳、鎮(zhèn)靜、安眠等功效，同時大麻酚可以抑制四氫大麻酚引起的不良反應(yīng)，加強四氫大麻酚的藥效，二者搭配使用常作為免疫疾病的主要治療手段[3-4]。大麻二酚是從大麻植物中提取的純天然成分，可以起到神經(jīng)保護(hù)、抗炎、代謝與免疫調(diào)節(jié)等功效[5-6]。在我國大麻二酚屬于工業(yè)大麻級別，不允許用于食品和化妝品。四氫大麻酚是大麻中主要的精神活性物質(zhì)，是大麻類毒品中對神經(jīng)系統(tǒng)起作用的主要成分。我國已將四氫大麻酚列入第一類精神藥品管制目錄，藥理方面可起抗腫瘤、保護(hù)心血管和抗菌等作用[7]。因此，開展對餅干中大麻的分析檢測工作具有重要意義。

目前大麻酚類物質(zhì)檢測主要有液相色譜[8-9]、氣相色譜[10]、氣相色譜-質(zhì)譜[11]、液相色譜-質(zhì)譜[12-14]、電化學(xué)[15]等技術(shù)，在食品安全檢測領(lǐng)域，質(zhì)譜技術(shù)相較色譜技術(shù)存在明顯優(yōu)勢[16-18]：靈敏度高，準(zhǔn)確性強；抗干擾能力強，目標(biāo)物質(zhì)即便在色譜柱上分離效果不好，也可通過化合物的離子化狀態(tài)進(jìn)行分析定量。氣相色譜質(zhì)譜法適合易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物，同時需要衍生化處理，不適合大麻酚類物質(zhì)檢測[19]，因此，本研究選擇液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行大麻酚類物質(zhì)的測定。

試驗運用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）凈化結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對餅干中大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚的測定進(jìn)行研究。與之前大麻酚類物質(zhì)研究相比，本研究首次采用大氣壓化學(xué)電子（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）源替代了以往使用較多的電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)對試驗的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Ultra 型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；T25 高速分散機：德國IKA 公司；2-15 離心機：美國Sigma 公司。

乙腈、甲醇、乙醇、甲酸（色譜純）：上海安譜有限公司；試驗用水為Milli-Q 高純水。大麻酚（CAS 號：521-35-7）、大麻二酚（CAS 號：13956-29-1）、四氫大麻酚（CAS 號：192-08-3）：天津阿爾塔科技有限公司；氯化鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、檸檬酸鈉、醋酸鈉：國藥集團上海有限公司；N-丙基乙二胺、C18：天津博納艾杰爾科技有限公司；石墨化碳黑：上海安譜有限公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

以乙腈配制質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18 ℃下儲存。以乙腈配制1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制濃度為2、5、10、20、50、100 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 試劑配制

0.1%甲酸溶液：準(zhǔn)確量取1 mL 甲酸于900 mL 水中，水定容至1 000 mL；乙腈-醋酸溶液（99+1）：量取10 mL 醋酸加入990 mL 乙腈中，混勻。

1.2.3 樣品前處理

1.2.3.1 樣品提取

稱取具有代表性的樣品5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入乙腈-醋酸溶液（99+1）20 mL，振搖混合均勻，加入6 g 無水硫酸鎂、1.5 g 醋酸鈉，超聲提取10 min，8 000 r/min 離心5 min。

1.2.3.2 樣品凈化

吸取1 mL 上清液至內(nèi)含150 mg 無水硫酸鎂、100 mg N-丙基乙二胺、50 mg C18 的2 mL 聚丙烯離心管中；渦旋混勻1 min，8 000 r/min 離心5 min，吸取上清液過微孔濾膜，用于測定。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold C18 色譜柱（柱長50 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm，填料粒徑1.9 μm）；流動相A：0.1% 甲酸水溶液，流動相B：甲醇，流動相及洗脫條件見表1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量10 μL，流速0.3 mL/min。

表1 流動相及梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase and gradient elution conditions

1.2.5 質(zhì)譜條件

大氣壓化學(xué)電子源（APCI），正離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源溫度為300 ℃；放電電流：8.0 μA；霧化氣：氮氣，310 kPa；離子傳輸管溫度：300 ℃；碰撞氣：氬氣。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇

本研究選擇0.1%甲酸水溶液作為水相溶劑，甲酸可以為陽離子的形成提供必需的質(zhì)子來源，從而提高目標(biāo)化合物的離子化效率。有機相對比了甲醇和乙腈兩種溶液，試驗發(fā)現(xiàn)在甲醇作為流動相的情況下，目標(biāo)化合物的峰形、出峰時間以及響應(yīng)強度更好。

2.1.2 色譜柱的選擇

本研究對比了C18、T3 兩種型號色譜柱。目標(biāo)物在T3 柱下，目標(biāo)物保留較弱，出峰快，樣品中共流出物容易干擾其測定。而在C18 柱下，目標(biāo)物的峰形及質(zhì)譜相應(yīng)強度更好，同時保留時間合適。這是因為大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚都屬弱極性物質(zhì)，C18 柱鍵合相上的極性基團修飾相較T3 柱更少，C18 柱相較T3 柱對弱極性分子保留能力更好。因此，選擇C18 柱作為本試驗分析用色譜柱。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化在電離源的選擇上，本研究對比使用ESI 和APCI 源時目標(biāo)化合物的出峰情況發(fā)現(xiàn)，采用APCI 離子源，目標(biāo)化合物回收率更好。這可能是因為大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚在溶液中離子化情況較差。ESI 是利用離子蒸發(fā)，液相離子化，而APCI 源則是依靠電暈針放電離子化，氣相離子化，同時相較ESI，APCI 源更適合弱極性化合物分析，檢出限也更低，更適合定量。質(zhì)譜參數(shù)見表2，質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 3 種化合物多反應(yīng)（MRM）色譜圖Fig.1 Chromatograms of three compounds under MRM monitoring

表2 3 種大麻酚多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Table 2 MRM parameters for the three cannabinoids

2.3 前處理條件優(yōu)化

QuEChERS 是近些年較為流行的食品檢測前處理方法。其原理類似于固相萃取，利用吸附劑自身特點，吸附基質(zhì)中的雜質(zhì)，達(dá)到凈化的作用。主要步驟包括：樣品制備、溶劑提取、鹽析劑除水，吸附劑除雜、上清液離心。相較于常用的液液萃取、微波萃取、固相萃取等傳統(tǒng)前處理方法，QuEChERS 操作更加便捷、操作時間更短、可應(yīng)用的基質(zhì)范圍更廣、有機溶劑用量更少[20]。

2.3.1 提取溶劑的選擇

分別選擇甲醇，乙醇、乙腈、乙腈醋酸溶液（99+1）、乙酸乙酯作為提取溶劑，在其他試驗條件不變的情況下，對標(biāo)準(zhǔn)添加餅干樣品進(jìn)行提取，不同提取方式的目標(biāo)化合物回收率見表3。

表3 不同溶劑對3 種大麻酚提取效率的影響Table 3 Effects of different solvents on the extraction efficiency of three cannabinoids

由表3 可知，提取用乙腈醋酸（99+1）溶液提取3 種化合物的回收率最好。因此選擇乙腈醋酸（99+1）溶液作為提取溶劑。

2.3.2 超聲時間的選擇

在其他試驗條件不變的情況下，不同超聲時間（4、8、10、15 min）下，陽性樣品目標(biāo)化合物回收率變化情況見表4。

表4 不同超聲時間對3 種大麻酚提取效率的影響Table 4 Effects of different ultrasound time on the extraction efficiency of three cannabinoids

超聲波可以加速餅干在溶液中的溶解，提高反應(yīng)速率和溶解度。由表4 可知，隨著超聲時間從4 min延長到8 min 再到10 min，目標(biāo)化合物的回收率逐漸增大，而在10 min 和15 min 下，目標(biāo)化合物的回收率基本沒有變化，因此選擇10 min 作為最終超聲時間。

2.3.3 萃取鹽包的選擇

餅干樣品經(jīng)過乙腈提取后，需要加入萃取鹽包分離水相和有機相。選擇鹽包1（2 g Na2SO4+2 g NaCl）、鹽包2（4 g MgSO4+1 g NaCl）、醋酸體系鹽包3（6 g MgSO4+1.5 g CH3COONa）、檸檬酸體系鹽包（4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g C6H5Na3O7+0.5 gC6H6Na2O7）4 種不同鹽包組合，通過比較目標(biāo)化合物的回收率，確定合適的萃取鹽包。

其中鹽包1、鹽包2 屬于普通常規(guī)鹽包，鹽包3 屬于醋酸緩沖體系，是美國農(nóng)業(yè)部AOAC2007 標(biāo)準(zhǔn)中QUCHERCES 鹽包，鹽包4 屬于檸檬酸緩沖體系，是歐盟EN15662 標(biāo)準(zhǔn)中QUCHERCES 鹽包。在其他試驗條件相同的情況下，加入這4 種鹽包，目標(biāo)化合物的回收率，見圖2。

圖2 不同鹽包種類對3 種大麻酚提取效率的影響Fig.2 Effect of different types of salt packs on the extraction efficiency of three cannabinoids

由圖2 可知，加入醋酸體系鹽包3 后，3 種目標(biāo)化合物回收率都較高，且使用鹽包3 提取后的溶液在質(zhì)譜顯示的雜峰較少，因此本試驗選擇醋酸緩沖體系（6 g MgSO4+1.5 g CH3COONa）作為萃取鹽包。

2.3.4 吸附劑的選擇

樣品經(jīng)初步凈化后需采用無水硫酸鎂、石墨化炭黑（graphitized carbon blacks，GCB）、N-丙基乙二胺（primary secondary amine ，PSA）、C18 等吸附劑對基質(zhì)中的雜質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步凈化。其中，MgSO4可除去提取液中少量水分；GCB 可以通過自身結(jié)構(gòu)吸附干擾物質(zhì)；PSA 通過胺基的弱離子交換作用和極性基質(zhì)成分形成氫鍵，可有效去除色素、糖類、有機酸等；C18 主要依靠非極性相互作用吸附脂肪等物質(zhì)。

本試驗選用6 種不同配比的吸附劑組合，分別為吸附劑組合1（0.1 g MgSO4+0.1 g PSA+0.1 g C18）、吸附劑組合2（0.15 g MgSO4+0.1 g PSA+0.05 g C18）、吸附劑組合3（0.15 g MgSO4+0.2 g PSA+0.1 g C18）、吸附劑組合4（0.2 g MgSO4+0.15 g PSA+0.15 g C18）；吸附劑組合5（0.2 g MgSO4+0.2 g PSA+0.1 g C18+0.1 g GCB）；吸附劑組合6（0.15 g MgSO4+0.1 g PSA+0.15 g C18+0.2 g GCB）。在其他試驗條件相同的情況下，分別向陰性基質(zhì)中添加20 ng/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過比較大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚的回收率來確定最佳吸附劑組合，結(jié)果見圖3。

圖3 不同吸附劑組成對3 種大麻酚提取效率的影響Fig.3 Effect of different adsorbent combinations on the extraction efficiency of three cannabinoids

由圖3 可知，吸附劑組合2 在餅干基質(zhì)中均呈現(xiàn)出最佳的凈化效果，3 種物質(zhì)的回收率為82.1%～85.4%。因此本試驗選擇吸附劑組合2（0.15 g MgSO4+0.1 g PSA+0.05 g C18）作為吸附劑。同時也看到加入GCB 降低了3 種目標(biāo)化合物的回收率，這是因為GCB是6 個碳原子構(gòu)成的平面六角形，對平面苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物有較強的吸附作用，大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚三者均有平面苯環(huán)結(jié)構(gòu)。吸附劑中加入GCB 會吸附溶液中的大麻酚類物質(zhì)，降低回收率。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評價

在液相色譜質(zhì)譜檢測中，基質(zhì)效應(yīng)普遍存在，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，APCI 替換ESI 在一定程度上可以消除基質(zhì)效應(yīng)，提高定量準(zhǔn)確度?；|(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）計算方法為ME=A/B-1，式中，A 為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；B 為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。當(dāng)ME＞0，表明基質(zhì)效應(yīng)增強；ME＜0，表明基質(zhì)效應(yīng)抑制；|ME|=0 表示不存在基質(zhì)效應(yīng)；|ME|＜0.2 為弱基質(zhì)效應(yīng)；0.2≤|ME|≤0.5為中等基質(zhì)效應(yīng)；|ME|＞0.5 為強基質(zhì)效應(yīng)。不同電離模式下的基質(zhì)效應(yīng)如表5 所示。

表5 不同電離模式下的基質(zhì)效應(yīng)Table 5 Matrix effects under different ionization modes

由表5 可知，使用ESI 源檢測3 種大麻酚，三者均呈現(xiàn)中等基質(zhì)效應(yīng)，但在APCI 下三者呈弱基質(zhì)效應(yīng)。APCI 的使用大大降低了3 種化合物的基質(zhì)效應(yīng)。在相關(guān)研究中認(rèn)為在利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測分析時，ESI 源比APCI 源更容易出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)[21]。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 線性方程與檢出限、定量限

以3 倍信噪比確定方法檢出限，以10 倍信噪比確定定量限，大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚的線性關(guān)系及檢測靈敏度如表6 所示。

表6 大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚的線性關(guān)系及檢測靈敏度Table 6 Linear relationship and detection sensitivity of cannabinol，cannabidiol，and tetrahydrocannabinol

2.5.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

取空白樣品，選擇低5 ng/mL、中20 ng/mL、高100 ng/mL 3 個濃度進(jìn)行添加回收試驗，重復(fù)6 次，回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如表7 所示。

表7 方法回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 7 Method recovery rate and relative standard deviation（n=6）

由表6、表7 可知，該方法的精密度和準(zhǔn)確性良好。

2.6 實際樣品測試

從市場上采集了8 份餅干樣品，經(jīng)測定均未檢出大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚。

3 結(jié)論

本研究采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對餅干中大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚進(jìn)行了痕量檢測。研究首次采用APCI 源替代ESI 源，大大降低了基質(zhì)效應(yīng)。通過優(yōu)化提取溶劑、超聲時間、萃取鹽包組成、吸附劑用量搭配等QuEChERS 前處理條件規(guī)避了傳統(tǒng)液相色譜法檢出限高、樣品處理復(fù)雜等問題。該方法簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確性高，適合于餅干中大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚的測定。