白銀雪 張夏夏 吳丹丹 任珊 安冬青

摘要?目的：探討天香丹對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠嘌呤能配體門(mén)控離子通道7（P2X7）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）的影響。方法：選取8周齡無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠30只，予以高脂飼料喂養(yǎng)12周，造模成功后隨機(jī)分為模型組、阿托伐他汀組、天香丹組，每組10只；另選取C57BL/6J小鼠10只予普通飼料喂養(yǎng)，設(shè)為空白對(duì)照組。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清白細(xì)胞介素（IL）-18、IL-1β、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的水平；免疫組化檢測(cè)組織中P2X7、NLRP3的表達(dá)。結(jié)果：ELISA結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，模型組IL-18、IL-1β、ATP水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀組、天香丹組IL-18、IL-1β、ATP水平降低（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，模型組P2X7、NLRP3表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀組、天香丹組P2X7、NLRP3表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：天香丹改善動(dòng)脈粥樣硬化與調(diào)節(jié)鉀穩(wěn)態(tài)抑制炎癥小體的激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞?動(dòng)脈粥樣硬化；天香丹；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；嘌呤能配體門(mén)控離子通道7；腺嘌呤核苷三磷酸；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.010

The Effect of Tianxiangdan on ?Atherosclerosis by Inhibiting P2X7/NLRP3 Expression

BAI Yinxue， ZHANG Xiaxia， WU Dandan， REN Shan， AN Dongqing

Xinjiang Medical University， Key Laboratory of Xinjiang Famous Physicians and Characteristic Prescriptions， Urumchi 830054， Xinjiang， China

Corresponding Author?AN Dongqing， E-mail： andongqing3@gmail.com

Abstract?Objective：To investigate the effect of Tianxiangdan on purinergic ligand-gated ion channel 7（ P2X7 ） and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3（ NLRP3） in atherosclerotic mice.Methods：Thirty 8-week-old SPF male ApoE-/-?mice were selected and fed with high-fat diet for 12 weeks.After successful modeling，they were randomly divided into model group，statin group，and Tianxiangdan group，with 10 mice in each group.Ten C57BL/6J mice were fed with normal diet as blank control group.The levels of interleukin（IL）-18，IL-1β，and adenosine triphosphate（ATP） in serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expression of P2X7 and NLRP3 in tissues was detected by immunohistochemistry.Results：ELISA results displayed that compared with the blank group，the levels of IL-18，IL-1β，and ATP in model group ?increased（P＜0.05）.Compared with the model group，the levels of IL-18， IL-1β，and ATP in statin group and Tianxiangdan group decreased（P＜0.05）.The results of immunohistochemistry showed that the expression of P2X7 and NLRP3 in model group was significantly higher than that in blank group（ P＜0.05）.The expression of P2X7 and NLRP3 in the statin group and Tianxiangdan group ?decreased compared with the model group（P＜0.05）.Conclusion：The improvement of atherosclerosis by Tianxiangdan is related to regulating potassium homeostasis and inhibiting the activation of inflammasome.

Keywords??atherosclerosis; Tianxiangdan; nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3; purinergic ligand-gated ion channel 7， P2X7; adenosine triphosphate; experimental study

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）是心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，是全世界心血管疾病死亡的重要

基金項(xiàng)目?國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.82060861）；新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（No.2020D04006）；新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目（No.2022A03019）

作者單位?新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（烏魯木齊 830054）

通訊作者?安冬青，E-mail：andongqing3@gmail.com

引用信息?白銀雪，張夏夏，吳丹丹，等.天香丹抑制P2X7/NLRP3表達(dá)改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（7）：1225-1228.

危險(xiǎn)因素之一，As易損斑塊的破裂是引發(fā)急性心血管事件的主要原因［1］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥體的激活是影響As易損斑塊的重要因素［2］。研究表明，細(xì)胞外的腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）可激活嘌呤能配體門(mén)控離子通道7（purinergic ligand-gated ion channel 7，P2X7）受體，介導(dǎo)鉀外流，導(dǎo)致NLRP3炎癥體激活［3-6］，NLRP3炎癥體激活后可通過(guò)誘發(fā)炎癥反應(yīng)參與As的發(fā)生與發(fā)展［7］。鉀離子通道拮抗劑可抑制鉀外流，調(diào)控炎癥小體的激活而改善As，但目前只用于實(shí)驗(yàn)研究，臨床應(yīng)用有待進(jìn)一步的發(fā)展，尋找鉀離子通道拮抗劑迫在眉睫。As屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”“真心痛”等疾病范疇?；静C(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，治當(dāng)以通補(bǔ)開(kāi)泄為法。天香丹是依據(jù)通補(bǔ)開(kāi)泄法理論治療胸痹的經(jīng)驗(yàn)方。前期研究表明，天香丹可通過(guò)調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，下調(diào)白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性因子水平，控制炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定易損斑塊，有效改善As［8-9］。本研究建立As小鼠模型，使用天香丹進(jìn)行干預(yù)，探究天香丹對(duì)P2X7/NLRP3通路及相關(guān)炎性因子的影響，為中醫(yī)藥治療As提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?動(dòng)物

8周齡無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠30只，從北京維通利華公司購(gòu)入；普通C57BL/6J小鼠10只，從新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)入；體質(zhì)量（18.00±2.00）g，共同飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境中。

1.2?實(shí)驗(yàn)分組及給藥

30只SPF級(jí)雄性 ApoE-/-小鼠，10只 C57BL/6 小鼠共同在屏障環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。C57BL/6 小鼠以普通飼料喂養(yǎng)，作為空白對(duì)照組；ApoE-/-小鼠給予高脂飲食（基礎(chǔ)飼料＋21%豬油＋0.15%膽固醇），喂養(yǎng)12 周建立As模型；將 ApoE-/-小鼠

按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（蒸餾水）、阿托伐他汀組［3 mg/（kg·d）］與天香丹組［2.73g/（kg·d）］，每組 10 只。藥物劑量［g/（kg·d）］＝9.1×成人臨床常藥量［g/（kg·d）］。灌胃體積＝0.2 mL/10 g。每日定時(shí)灌胃 1 次，連續(xù)灌胃 8 周，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整用藥劑量。所有小鼠自由飲水、飲食，不限制活動(dòng)。

1.3?藥物與試劑

基礎(chǔ)飼料和高脂飼料（21.00%脂肪、0.15%膽固醇、78.85%基礎(chǔ)飼料）購(gòu)于北京科澳協(xié)力飼料有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2020-0010；天香丹顆粒（每包9 g，批號(hào)：210540，新齊康藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）；阿托伐他汀鈣片（20 mg，28片，批號(hào)：EE0898，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)）；小鼠腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（貨號(hào)YX-012016M）、小鼠IL-18ELISA試劑盒（貨號(hào)YX-E21218）、小鼠IL-1β ELISA試劑盒（貨號(hào)YX-E28912）由上海優(yōu)選生物科技有限公司生產(chǎn)；免二步法試劑盒（貨號(hào)PV-6001）、封閉用羊血清（貨號(hào)ZLI-9022）由中杉金橋公司生產(chǎn)；DBA顯色試劑盒（貨號(hào)ab64238）、P2X7 抗體（貨號(hào)AB259942）由Abcam公司生產(chǎn)；NLRP3抗體（貨號(hào)DF7438）由Affinity生物科學(xué)有限公司生產(chǎn)。

1.4?儀器

高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，型號(hào)：Sigma3-18KS）；酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛公司生產(chǎn)，型號(hào)：MULTISKANGO）；真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：DZF-6090）。

1.5?ELISA法檢測(cè)血清IL-18、IL-1β、ATP水平

采集每組6只小鼠血清，離心后取上清，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，于波長(zhǎng)450 nm處分別測(cè)定各孔的吸光度值。獲得的光密度（OD）值用Origin2021軟件進(jìn)行分析。

1.6?免疫組化檢測(cè)組織中P2X7、NLRP3表達(dá)

每組取6只小鼠腹主動(dòng)脈石蠟切片，脫蠟和水化后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次5 min；檸檬酸鈉修復(fù)20 min，冷卻至室溫；PBS洗3次，每次2 min；擦干組織周圍液體，在組織上滴加過(guò)氧化氫溶液（H2O2），避光放置15 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS洗3次，每次2 min；隨后滴加山羊血清置于37 ℃孵育箱內(nèi)30 min；甩凈封閉液，滴加稀釋的一抗，4 ℃過(guò)夜；取出放置室溫，PBS洗3次，每次2 min；甩凈PBS后滴加二抗置于37 ℃孵育箱內(nèi)20 min；PBS洗5次，每次2 min；擦干組織周圍液體滴加DBA顯色液，自來(lái)水沖洗；蘇木素復(fù)染，水化和透明后，中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用Image pro plus軟件進(jìn)行分析。

1.7?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)?果

2.1?各組血清ATP水平比較

與空白對(duì)照組比較，模型組ATP水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿托伐他汀組、天香丹組ATP水平明顯降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.2?各組P2X7、NLRP3表達(dá)水平比較

與空白對(duì)照組比較，模型組P2X7、NLRP3表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿托伐他汀組、天香丹組P2X7、NLRP3表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖1、表2。

2.3?各組血清IL-18、IL-1β水平比較

與空白對(duì)照組相比，模型組IL-18、IL-1β水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀組、天香丹組IL-18、IL-1β水平明顯降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

3?討?論

As是一種發(fā)生于血管壁的慢性炎癥性病理變化，以脂質(zhì)沉積和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)為特征［10］，As引發(fā)的冠心病、心肌梗死、腦卒中等心腦血管疾病是我國(guó)首位致死性疾病，嚴(yán)重危害廣大人民群眾的身體健康和生命安全［10-11］。鉀作為重要的電解質(zhì)之一，在維持細(xì)胞正常代謝與酸堿平衡、細(xì)胞膜的應(yīng)激性和心肌的正常功能中發(fā)揮重要作用。鉀通道ATP主要分布于心肌和血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)膜上［12］。研究表明，P2X7受體是廣泛表達(dá)于各種免疫細(xì)胞中的ATP門(mén)控陽(yáng)離子選擇性通道，升高的細(xì)胞外ATP激活P2X7受體［3-6］。研究顯示，鉀離子的相關(guān)蛋白P2X7受體在人頸動(dòng)脈斑塊與冠狀動(dòng)脈狹窄中的表達(dá)顯著增加［13-14］。

NLRP3炎癥小體是脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)血管炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素，在As的發(fā)生和發(fā)展中起著根本性的作用［15］。細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)的紊亂是NLRP3炎癥小體激活的重要細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)。鉀外流被認(rèn)為在NLRP3炎癥小體激活中具有重要作用，幾種NLRP3激活劑可降低細(xì)胞內(nèi)鉀濃度；相比之下，增加細(xì)胞外鉀濃度可抑制所有受試NLRP3激活劑的炎癥小體激活［16-17］。NLRP3炎癥小體被激活后，能夠促進(jìn)產(chǎn)生大量炎性因子IL-1β和IL-18，造成易損斑塊破裂，加重As的發(fā)展進(jìn)程［18］。因此，調(diào)節(jié)鉀穩(wěn)態(tài)抑制NLRP3的激活對(duì)As的發(fā)生、發(fā)展極其重要。

中醫(yī)將As大致歸于“胸痹”“心痛”“心痹”“卒心痛”等范疇，

As的基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，因虛致實(shí)，因?qū)嵰嫣?。心氣損傷，統(tǒng)血無(wú)能，以致瘀血內(nèi)生；氣虛及陽(yáng)，陽(yáng)虛則寒或陽(yáng)虛飲停，以氣滯、血瘀、痰濁、寒凝相兼為患。天香丹具有益氣活血、辛通開(kāi)泄的功效，方中君藥紅景天補(bǔ)氣養(yǎng)血，活血化瘀；臣藥丹參益氣活血、通經(jīng)止痛，降香化瘀止血、理氣止痛，新塔花寧心安神、疏風(fēng)散熱；四藥合用益氣活血、補(bǔ)虛通絡(luò)。

本研究發(fā)現(xiàn)As模型組小鼠血清ATP含量明顯升高，證實(shí)As發(fā)生時(shí)，細(xì)胞中鉀離子紊亂，引發(fā)炎癥反應(yīng)，增加血管中脂質(zhì)沉積，促進(jìn)As的發(fā)生發(fā)展。與模型組相比，天香丹組P2X7、NLRP3蛋白的表達(dá)均明顯降低，血清炎性因子IL-18、IL-1β水平降低，表明天香丹可以調(diào)節(jié)鉀紊亂，減少炎癥發(fā)生，減輕脂質(zhì)沉積，進(jìn)而改善As的狀況。

綜上所述，天香丹改善As可能與調(diào)節(jié)鉀穩(wěn)態(tài)而抑制炎癥小體的激活有關(guān)。

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（收稿日期：2023-08-30）

（本文編輯王麗）