安微 林華 鄭晶 李丹丹 張婧 徐國鋒

基金項目：海關(guān)總署科研項目（2021HK174）。

作者簡介：安微（1986—），女，黑龍江訥河人，碩士，高級獸醫(yī)師。研究方向：動物疫病檢測。

通信作者：徐國鋒（1986—），男，山東聊城人，博士，助理研究員。研究方向：動物病原體檢測。E-mail： xgf879@163.com。

摘 要：本研究以對蝦白斑綜合癥病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）的VP664基因、傳染性皮下及造血組織壞死病毒（Infectious Subcutaneous and Hematopoietic Necrosis Virus，IHHNV）的NSP2基因、蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon Hepatopenaei，EHP）的ssrRNA基因以及壞死性肝胰腺炎細(xì)菌（Necrotizing Hepatopancreatitis Bacteria，NHPB）的16SrRNA基因為檢測對象，建立了WSSV、IHHNV、EHP和NHPB的四重?zé)晒舛縋CR方法，并對該方法的特異性、靈敏性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，建立的四重?zé)晒舛縋CR方法特異性良好，對WSSV、IHHNV、EHP和NHPB的最低檢測限為4.05 copies·μL-1、6.53 copies·μL-1、

5.85 copies·μL-1和6.18 copies·μL-1，本實驗建立的方法具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：對蝦；對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）；傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）；蝦肝腸胞蟲（EHP）；壞死性肝胰腺炎細(xì)菌（NHPB）

Establishment of Quadruple-Fluorescence Quantitative PCR Detection Method for WSSV， IHHNV， EHP and NHPB

AN Wei1， LIN Hua1， ZHENG Jing1， LI Dandan2， ZHANG Jing1， XU Guofeng3*

（1.Technical Center of Chengdu Customs， Chengdu 610041， China;

2.Technical Center of Haikou Customs， Haikou 570100， China;

3.Inflammation and Allergic Diseases Research Unit， Affiliated Hospital of Southwest Medical University，

Luzhou 646000， China）

Abstract： This study focuses on the VP664 gene of WSSV in shrimp， the NSP2 gene of IHHNV， the ssrRNA gene of EHP， and the 16SrRNA gene of NHPB. A quadruple fluorescence quantitative PCR method was established to simultaneously detect WSSV， IHHNV， EHP， and NHPB， and the specificity and sensitivity of this method were studied. The experimental results indicate that the established quadruple fluorescence quantitative PCR method has good specificity， with the minimum detection limits for WSSV， IHHNV， EHP， and NHPB being 4.05 copies·μL-1，

6.53 copies·μL-1， 5.85 copies·μL-1 and 6.18 copies·μL-1. The method established in this experiment has good application prospects.

Keywords： shrimp; white spot syndrome virus（WSSV）; infectious subcutaneous and hematopoietic necrosis virus（IHHNV）; enterocytozoon hepatopenaei（EHP）; necrotizing hepatopancreatitis bacteria（NHPB）

我國是世界上對蝦消費量最大的國家之一，對蝦在我國消費者的餐桌上占據(jù)著重要的地位，因此保障對蝦的食品安全問題至關(guān)重要[1]。隨著我國對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，再加上目前養(yǎng)殖戶普遍采用養(yǎng)殖密度高、集約化的養(yǎng)殖模式，使得養(yǎng)殖水環(huán)境惡化，各類對蝦傳染性疾病頻發(fā)，嚴(yán)重威脅了我國對蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。對蝦白斑綜合癥病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）、傳染性皮下及造血組織壞死病毒（Infectious Subcutaneous and Hematopoietic Necrosis Virus，IHHNV）、蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon Hepatopenaei，EHP）以及壞死性肝胰腺炎細(xì)菌（Necrotizing Hepatopancreatitis Bacteria，NHPB）是對蝦養(yǎng)殖中最常見的4種病原菌，對對蝦養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生巨大的危害[3-4]。

在對收集的對蝦樣本進(jìn)行常見病原菌檢測時發(fā)現(xiàn)，WSSV、IHHNV、EHP和NHPB在臨床樣本中容易發(fā)生細(xì)菌、病毒混合感染的情況，這增加了臨床診斷的難度，所以迫切需要一種能夠同時檢測4種病原菌的方法，以便快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行診斷。本研究將通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件、引物設(shè)計和探針選擇，建立一種同時針對這4種病原體進(jìn)行定量PCR檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

WSSV、IHHNV、EHP、NHPB、肝胰腺細(xì)小病毒（Hepatopancreatic Parvovirus，HPV）、急性肝胰腺壞死病毒（Acute Hepatopancreas Necrosis，AHPND）、十足目虹彩病毒1（Decapod Iridescent Virus 1，DIV1）和蝦血細(xì)胞虹彩病毒（Shrimp Hemocyte Iridescent Virus，SHIV）均為本實驗室保存。

1.2 試劑

基因組DNA提取試劑盒、AceQ qPCR Probe Master Mix、膠回收/DNA純化試劑盒、ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V2和快速質(zhì)粒小提試劑盒。

1.3 引物探針設(shè)計與合成

本試驗以WSSV的VP664基因、IHHNV的NSP2基因、EHP的ssrRNA基因以及NHPB的

16SrRNA基因為檢測對象，分別設(shè)計4對特異性引物和探針；多重?zé)晒舛縋CR引物、探針由成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，序列如表1所述。

1.4 構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

參照基因組提取試劑盒說明提取DNA，使用本試驗設(shè)計的普通PCR引物擴(kuò)增目標(biāo)基因，運用膠回收/DNA純化試劑盒純化目標(biāo)基因，運用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V2構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)測序比對成功后作為標(biāo)準(zhǔn)品備用。按照常規(guī)方法擴(kuò)增含有標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的陽性菌株，運用快速質(zhì)粒小提試劑盒提取標(biāo)準(zhǔn)品，按照計算公式得出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)[5]。

1.5 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照已經(jīng)篩選、優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)參數(shù)，將WSSV、IHHNV、EHP、NHPB的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋（10倍），選擇其中8個稀釋度濃度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)注曲線相關(guān)系數(shù)R2及效率E。

1.6 特異性試驗

以WSSV、IHHNV、EHP、NHPB、HPV、AHPND、DIV1、SHIV的cDNA/DNA為模板，驗證所建立方法的特異性。

1.7 靈敏性試驗

將WSSV、IHHNV、EHP、NHPB的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋（10倍），采用106～10-1 copies·μL-1

共8個濃度，用來驗證該方法的靈敏性，確定最低檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

參照表1所述的引物，擴(kuò)增4種病原菌的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為69 bp、81 bp、156 bp和67 bp。運用ClonExpress Ultra One Step Cloning

Kit V2與各個DNA片段構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)過計算得出WSSV、IHHNV、EHP、NHPB質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為4.05×1010 copies·μL-1、6.53×1010 copies·μL-1、

5.85×1010 copies·μL-1和6.18×1010 copies·μL-1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

WSSV、IHHNV、EHP、NHPB的引物濃度分別為0.4 μL、0.5 μL、0.6 μL和0.6 μL；探針濃度分別為0.3 μL、0.4 μL、0.4 μL和0.2 μL；熒光通道分別為CY5、VIC、Texas Red和6-FAM；反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)程序為95 ℃下5 min；95 ℃下10 s，

62 ℃下30 s，循環(huán)40次。本試驗的判斷標(biāo)準(zhǔn)是Ct值≤35，擴(kuò)增曲線呈“S”型，則檢測結(jié)果為陽性；當(dāng)35

2.3 特異性結(jié)果

該方法只對WSSV、IHHNV、EHP和NHPB有特異性擴(kuò)增，對HPV、AHPND、DIV1和SHIV呈現(xiàn)出陰性檢測結(jié)果，表明該方法具有良好的特異性。

2.4 靈敏性結(jié)果

為了驗證建立方法的靈敏性，選擇不同稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果見圖1。本試驗建立的多重?zé)晒舛縋CR方法對WSSV、IHHNV、EHP、NHPB的最低檢測限分別為4.05 copies·μL-1、

6.53 copies·μL-1、5.85 copies·μL-1和6.18 copies·μL-1，

表現(xiàn)該方法具有較高的靈敏性。

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著我國對對蝦的需求量逐漸增多，對蝦養(yǎng)殖業(yè)迎來了蓬勃發(fā)展，大規(guī)模、高密度的養(yǎng)殖模式使得水環(huán)境遭到破壞，各類對蝦疾病頻發(fā)。據(jù)報道，對蝦疾病約有60%是由病毒引起，其次是細(xì)菌和寄生蟲，而且由病毒、細(xì)菌、寄生蟲引起的混合感染在對蝦臨床上也呈現(xiàn)出逐年增多趨勢[6]。本文成功建立了一種WSSV、IHHNV、EHP和NHPB四重?zé)晒舛縋CR檢測方法。該檢測方法涵蓋了引起對蝦疾病常見的病毒、細(xì)菌和寄生蟲，本方法的建立旨在解決現(xiàn)有單一或雙重PCR方法的局限性，并提供一種高效、快速和可靠的多重病原體檢測方案。本次建立的方法具有良好特異性，只對WSSV、IHHNV、EHP和NHPB有特異性檢測結(jié)果，對其他病原菌呈現(xiàn)陰性檢測結(jié)果。本方法靈敏度高，對WSSV、IHHNV、EHP、NHPB的最低檢測限都小于10 copies·μL-1，想較于其他檢測方法優(yōu)勢明顯[7]。雖然本文已經(jīng)成功地應(yīng)用于WSSV、IHHNV、EHP、NHPB的臨床檢驗，但在面對其他新出現(xiàn)的病原體或其變異株時，可能需要進(jìn)一步改進(jìn)和驗證該方法的特異性和準(zhǔn)確性。此外，還需要考慮實際操作的可行性和成本效益等因素。

參考文獻(xiàn)

[1]陸冬.山東省南美白對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與對策研究[D].廈門：集美大學(xué)，2022.

[2]于永翔，王印庚，蔡欣欣，等.環(huán)境、病原、免疫因子三要素與池塘養(yǎng)殖對蝦AHPND發(fā)生的關(guān)聯(lián)性[J].水生生物學(xué)報，2023，47（1）：1-10.

[3]劉寶彬，楊冰，呂秀旺，等.凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）及蝦肝腸胞蟲（EHP）的熒光定量PCR檢測[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2017，38（2）：158-166.

[4]李家僑，謝艷輝，李家嬋，等.湛江口岸進(jìn)口凍蝦攜帶病毒檢測發(fā)現(xiàn)與分析[J].中國口岸科學(xué)技術(shù)，2021，3（5）：38-44.

[5]安微，鄭晶，車穎欣，等.諾如病毒和輪狀病毒三重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)雜志，2022，58（8）：49-54.

[6]劉順，翁歆之，鄭曉葉，等.2017年—2019年浙江臺州地區(qū)凡納濱對蝦4種病原PCR檢測[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2022，43（3）：137-141.

[7]QIU L，CHEN M M，WAN X Y，et al.Detection and quantification of shrimp hemocyte iridescent virus by TaqMan probe based real-time PCR[J].J Invertebr Pathol，2018，154（5）：95-101.