喬佳璐 王麗

摘 要：目的：建立高效液相色譜測(cè)定食用油中黃曲霉毒素B1的方法。方法：樣品用甲醇水提取，經(jīng)黃曲霉毒素B1免疫親和柱凈化，用甲醇洗脫，洗脫液用柱后碘衍生法上機(jī)測(cè)定。結(jié)果：該方法線性回歸方程為Y=27 217.3X，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，回收率在96.8%～101.2%，方法重復(fù)性的RSD為0.6%，質(zhì)控樣的Z值為0.5，檢出限為0.029 ?g·kg-1，定量限為0.098 ?g·kg-1。結(jié)論：該方法線性關(guān)系良好，回收率優(yōu)良，質(zhì)控樣、檢出限、定量限均符合要求，具有簡(jiǎn)單、快速、高效、節(jié)約試劑耗材的特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：食用油；高效液相色譜法；黃曲霉毒素B1

Quantitative Determination of Aflatoxins B1 in Edible Oil by High Performance Liquid Chromatography

QIAO Jialu， WANG Li

（Baoji Food and Drug Testing Center， Baoji 721000， China）

Abstract： Objective： In order to establish the determination method of aflatoxins B1 in edible oil by high performance liquid chromatography. Method： The samples were extracted with methanol water， purified by aflatoxins B1 immunoaffinity column， eluted with methanol， and determined by post-column iodine derivatization. Result： The linear regression equation was Y=27 217.3X， the correlation coefficient was R2=0.999 6. The recovery rate of method was from 96.8% to 101.2%， the RSD of reproducibility was 0.6%， the Z value of quality control samples was 0.5， and the detection limit was 0.029 ?g·kg-1， the limit of quantification was 0.098 ?g·kg-1. Conclusion： The method has good linearity， good recovery， quality control sample， detection limit， quantitative limit are in line with the requirements， with simple， fast， efficient and save reagent consumables characteristics.

Keywords： edible oil; high performance liquid chromatograph; aflatoxins B1

黃曲霉毒素是一種由黃曲霉菌產(chǎn)生的真菌毒素，主要包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2等羥基化代謝產(chǎn)物[1]。其中，黃曲霉霉毒素B1的毒性最強(qiáng)，最為多見(jiàn)，是國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局規(guī)定的大部分食品的必檢項(xiàng)目之一。黃曲霉毒素B1普遍存在于花生油、菜籽油等食用油中，且以南方高溫、高濕地區(qū)的食用油受污染最為嚴(yán)重[2]。黃曲霉毒素B1易溶于甲醇等有機(jī)溶劑，難溶于水，耐熱耐高溫，在食物中需要加熱至280 ℃以上才會(huì)裂解，所以一般烹調(diào)溫度下黃曲霉毒素B1難以被破壞。

黃曲霉毒素B1會(huì)對(duì)人體的肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)造成損傷，是世界公認(rèn)的毒性最強(qiáng)、分布最廣、危害最大的一類真菌毒素[3-4]，被世界衛(wèi)生組織劃定為Ⅰ類致癌物。我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定玉米油、花生油中黃曲霉毒素B1限量為20 μg·kg-1；其他食用植物油脂為10 μg·kg-1[5]。黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法有很多種[6-8]，GB 5009.22—2016收納的就有5種檢測(cè)方法，分別為高效液相色譜-柱前衍生法、同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜-柱后衍生法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法[9]。本文主要針對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)食用油的高效液相色譜-柱后衍生法進(jìn)行優(yōu)化，使得檢測(cè)過(guò)程更加方便簡(jiǎn)潔，省時(shí)省力，為檢測(cè)機(jī)構(gòu)完成大批量檢測(cè)任務(wù)提供便利。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽油，購(gòu)買于寶雞市華潤(rùn)萬(wàn)家超市高新店；甲醇、乙腈、正己烷，均為色譜純，均采購(gòu)于DIKMA；碘（I2），采購(gòu)于天津科密歐試劑有限公司；黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：1162-65-8，濃度100 ?g·mL-1，采購(gòu)于壇墨質(zhì)檢科技有限公司；批號(hào)：SB05-195-2008，濃度2 ?g·mL-1，采購(gòu)于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所）；黃曲霉毒素B1免疫親和柱，采購(gòu)于天津博納艾杰爾科技有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（配備RF-20A熒光檢測(cè)器、柱后衍生器），日本島津公司；氮吹儀，無(wú)錫沃信儀器有限公司；電子天平（感量0.1 mg），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；旋渦混合器（VG3），IKA；固相萃取儀（AP-02B真空泵），天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：thermo UMISil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：甲醇-水（50+50）；發(fā)射波長(zhǎng)：440 nm；激發(fā)波長(zhǎng)：360 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；衍生溶液：0.05%碘溶液；衍生液流速：0.2 mL·min-1。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確吸取1.0 mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于100 mL的容量瓶中，加乙腈定容至刻度，配制成濃度為1 ?g·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中冷藏保存；取0.5 mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于

50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，配制成濃度為10 ng·mL-1的中間液；取一定體積的儲(chǔ)備液及中間液，配制成濃度為0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、

2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1和40.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 樣品提取及凈化

準(zhǔn)確稱取混合均勻的試樣5 g置于50 mL離心管中，加20 mL乙腈-水溶液（84+16），渦旋混合，超聲提取20 min，以6 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，取4 mL上清液，加入12 mL超純水，混合均勻，待過(guò)柱；將免疫親和柱置于固相萃取裝置上，棄去保護(hù)液，調(diào)節(jié)壓力，使待測(cè)樣液以2 mL·min-1的速度穩(wěn)定下滴，滴完后，加入2×10 mL水，淋洗親和柱，待水滴完后，抽干親和柱；脫離真空系統(tǒng)，加2 mL甲醇洗脫，控制流速為2 mL·min-1，抽干親和柱，收集全部洗脫液于玻璃試管中，過(guò)0.22 μm濾膜，濾液待測(cè)。

1.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證分析

通過(guò)平行樣品、質(zhì)控樣品、空白試驗(yàn)、加標(biāo)試驗(yàn)以及重復(fù)性試驗(yàn)確定方法的準(zhǔn)確度[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品與溶劑的選擇

分別用不同來(lái)源的濃度為2 ?g·mL-1、100 ?g·mL-1的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，加載質(zhì)控樣，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度越大，儲(chǔ)存過(guò)程中損失越小，質(zhì)控樣結(jié)果越準(zhǔn)確。因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)該購(gòu)買濃度大的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為5 ng·mL-1）的液相色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 液相色譜條件的確定

實(shí)驗(yàn)中分別使用不同比例（30∶70、40∶60、45∶55、50∶50）的甲醇-水作為流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)甲醇-水比例為50∶50時(shí)，目標(biāo)峰峰形對(duì)稱，樣品中雜質(zhì)干擾影響小。樣品的液相色譜圖見(jiàn)圖2，空白試驗(yàn)的液相色譜圖見(jiàn)圖3。

2.3 線性關(guān)系分析結(jié)果

參照1.3.1中的色譜條件對(duì)系列不同質(zhì)量濃度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，黃曲霉毒素B1線性回歸方程為Y=27 217.3X，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，線性關(guān)系良好。黃曲霉毒素B1的線性關(guān)系圖見(jiàn)圖4。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證分析結(jié)果

2.4.1 加標(biāo)回收率考察

稱取陰性樣品約5 g，共9份，精密加入適量黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3.3操作，制得供試品溶液，按1.3.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，高、中、低3種濃度的加標(biāo)回收率平均值分別為100.4%、98.5%和97.3%，滿足GB/T 27404—2008標(biāo)準(zhǔn)要求（60%～120%），結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4.2 重復(fù)性考察

稱取陽(yáng)性樣品5 g，重復(fù)測(cè)定6次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%，滿足GB/T 27404—2008標(biāo)準(zhǔn)要求（≤30%），結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.3 質(zhì)控樣考察

稱取質(zhì)控樣品約5 g，共3份，按1.3.3操作制得供試品溶液。按1.3.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果為1.62 ?g·kg-1。所選質(zhì)控樣來(lái)自中食國(guó)實(shí)（編號(hào)為CFAPA-QC618B-1），指定值為1.55 ?g·kg-1，通過(guò)數(shù)據(jù)分析得出測(cè)定結(jié)果的Z值為0.5，符合質(zhì)控樣Z值要求（|Z|≤2）。

2.4.4 檢出限考察

稱取陰性樣品約5 g，共3份，加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品0.15 ng，按1.3.3操作制得供試品溶液。按1.3.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果為0.029 ?g·kg-1，小于標(biāo)準(zhǔn)給定檢出限（0.03 ?g·kg-1），滿足GB 5009.22—2016標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.4.5 定量限考察

稱取陰性樣品約5 g，共3份，加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品0.5 ng，按1.3.3操作制得供試品溶液。按1.3.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果為0.098 ?g·kg-1，小于標(biāo)準(zhǔn)給定定量限（0.1 ?g·kg-1），滿足GB 5009.22—2016標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)論

本研究對(duì)GB 5009.22—2016第三法高效液相色譜-柱后衍生法進(jìn)行了優(yōu)化，樣液凈化環(huán)節(jié)用超純水代替了PBS溶液，去掉了原標(biāo)準(zhǔn)中的氮吹環(huán)節(jié)。在優(yōu)化的條件下測(cè)定食用油中黃曲霉毒素B1，目標(biāo)峰峰形良好，保留時(shí)間在8.4 min左右，雜峰與目標(biāo)峰分離度好，干擾小。該方法簡(jiǎn)單、快速、高效、節(jié)約試劑，為食用油中黃曲霉毒素B1的定性、定量分析提供了一種更加省時(shí)省力的途徑，使實(shí)驗(yàn)室大批量檢驗(yàn)工作實(shí)現(xiàn)了節(jié)能減負(fù)。

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