陳佳茜，郭廣洋，譚新杰，呂淑芳，胥華偉，原 夢，鄧 萍，侯典云*

?藥材與資源?

連翹多胺氧化酶基因家族的鑒定及干旱和鹽脅迫下的表達分析

陳佳茜1, 2，郭廣洋1, 2，譚新杰1, 2，呂淑芳1, 2，胥華偉1, 2，原 夢1, 2，鄧 萍1, 2，侯典云1, 2*

1. 河南科技大學農(nóng)學院，河南 洛陽 471023 2. 河南省藥食兼用資源評價與創(chuàng)新利用工程研究中心，河南 洛陽 471023

研究連翹多胺氧化酶（polyamine oxidase，）基因家族在鹽和干旱脅迫下的響應特征。通過分析連翹轉錄組數(shù)據(jù)鑒定出5個連翹基因家族成員，結合蛋白質理化性質和基序分析、蛋白質結構分析、系統(tǒng)進化分析、結構域等方式進行相關性分析，并探究了鹽和干旱脅迫下基因的表達水平。連翹基因家族氨基酸數(shù)介于235～541 aa，相對分子質量在26 069～59 328，等電點在5.27～5.86；不穩(wěn)定系數(shù)為35.68～44.14，總平均親水性皆為負值，推測連翹PAO家族蛋白均為不穩(wěn)定型、酸性、親水性蛋白，α-螺旋與無規(guī)則卷曲為蛋白主要二級結構形式。鑒定出的5個連翹基因家族成員均具有特異性表達模式；在鹽和干旱脅迫下5個連翹基因家族成員的表達均受到誘導，可能參與連翹的鹽脅迫及干旱脅迫響應調控，為深入探討連翹基因家族的功能奠定了基礎。

連翹；基因家族；基因表達；脅迫；蛋白質結構分析

多胺（polyamines，PAs）是小分子質量的脂肪胺，存在于植物細胞中參與各種生物過程[1]。PAs主要包括腐胺（Put）、亞精胺（Spd）和精胺（Spm）3種。PAs與逆境脅迫及衰老有關的植物激素脫落酸（ABA）和乙烯（ETH）關系密切，在調控生長、發(fā)育、衰老等方面發(fā)揮重要作用外，還參與對各種生物和非生物脅迫耐受功能的響應[2]，在提高植物抗逆性、維持植物生長發(fā)育等方面具有重要作用[3]。研究表明，多胺含量的變化可能是植物提高脅迫條件下耐受性的方式之一[4]。在植物生長發(fā)育過程中，多胺除合成代謝外，還會通過氧化方式維持植物體內的多胺平衡。其中，經(jīng)多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）途徑分解多胺是最常見方式之一[5]。大部分的PAOs以多胺為底物，催化生成更小分子多胺，以及1分子氨基醛和H2O2[6]，進而維持植物細胞體內的多胺的穩(wěn)定，提高植物抗生物脅迫及非生物脅迫的能力[7]。

當受到非生物因素脅迫時，植物表型及生理生化會發(fā)生變化，也會通過改變自身基因序列的表達來調節(jié)對環(huán)境的適應性。PAOs先后在水稻[8]、擬南芥[9]和其他植物中發(fā)現(xiàn)具有多胺分解代謝、植物發(fā)育和非生物脅迫耐受性的作用[10]。目前已從煙草[11]、玉米[12]、甜橙[13]、番茄[14]和大麥[15]等植物中鑒定分離出了一系列編碼PAO的基因，并研究了在一定非脅迫條件下的基因家族成員的響應。

連翹(Thunb.) Vahl為木犀科連翹屬落葉灌木，多產(chǎn)于我國河南、河北、山東、陜西、山西等地區(qū)[16]，多以干燥果實入藥，具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱等功效[17]。據(jù)報道，連翹生產(chǎn)極易受干旱、鹽堿地等影響[18-19]，導致產(chǎn)量不佳。目前，關于連翹非生物脅迫研究主要集中在不同品種之間的比較[19-20]，抗脅迫相關基因的研究較少，對連翹基因家族信息的全面分析鮮有報道。

本研究以連翹轉錄組數(shù)據(jù)為基礎，篩選鑒定連翹基因家族成員，并對該家族成員進行了理化性質、保守結構域、保守基序、以及鹽和干旱脅迫下的表達水平等分析研究，為進一步研究連翹基因家族的功能提供理論基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

研究所用連翹葉片及果實采自河南洛陽市宜陽縣連翹種植基地，由河南科技大學侯典云教授鑒定為連翹(Thunb.) Vahl。連翹愈傷組織材料為本實驗室培養(yǎng)。

1.2 儀器

JJ223BC型電子天平（精度0.001 mg，雙杰測試儀器公司）、5415R型低溫高速離心機（Eppendorf 公司）、JY04S-3D型凝膠成像分析系統(tǒng)（君意電泳公司）、實時熒光定量PCR儀（Lightcycler96，Roche公司，瑞士）等。多糖多酚植物RNA提取試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）反轉錄試劑盒均購自南京諾維贊生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 愈傷組織脅迫處理

在愈傷組織生長7周左右時，在基礎誘導培養(yǎng)基中添加200 mmol/L NaCl作為鹽脅迫處理，添加400 mmol/L甘露醇作為干旱處理，分別在在不同時間（1、3、5、7、10 d）進行取材，液氮冷凍，?80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 基于轉錄組的連翹PAO基因家族的篩選與鑒定

從連翹轉錄組序列中篩選獲得基因家族相關序列，使用ORF Finder（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder/）在線分析預測基因序列的開放閱讀框（open reading frame，ORF），獲得連翹基因家族相關基因序列全長，本研究所用到的擬南芥基因組注釋信息和基因組序列信息來自于擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫TAIR（https://www.arabidopsis.org/）中下載PAO家族蛋白序列；從水稻基因組數(shù)據(jù)庫（https:// ricedata.cn/gene/）中下載水稻PAO家族蛋白序列。將初步獲得的連翹PAO蛋白序列通過結構域在線分析軟件SMART（http://smart.embl.de/）對保守結構域進行分析。

2.3 連翹PAO家族蛋白理化性質及保守基序分析

利用在線分析工具Expasy ProtParam tool （https://web.expasy.org/protparam/）分析連翹PAO家族蛋白的理化性質。利用SOPMA和signa IP 5.0在線分析對家族蛋白質二級結構特征和蛋白信號肽進行預測。利用在線分析工具The MEME （https:// meme-suite.org/meme/tools/meme）在線分析連翹PAO家族蛋白的基序，并進行可視化分析。

2.4 連翹PAO家族系統(tǒng)進化關系分析

通過NCBI在線查詢相關植物PAO家族蛋白序列，并使用軟件MEGA 7.0對篩選出的連翹PAO家族與其進行多重序列比對，基于比對結果，使用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。

2.5 熒光定量PCR分析

使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取連翹葉片、果實、愈傷組織以及脅迫處理后不同時間的愈傷組織的RNA，按照qRT-PCR反轉錄試劑盒說明書操作，利用Primer Premier 5.0軟件設計相關引物（表1），內參基因為，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix對以上提取RNA進行熒光定量PCR驗證。熒光定量PCR反應程序：預變性95 ℃、30 s；變性95 ℃、10 s；退火60 ℃、30 s；40個循環(huán)。反應體系20 μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA為1.0 μL，用ddH2O補至20 μL。

表1 qRT-PCR引物

3 結果與分析

3.1 連翹PAO基因家族成員鑒定

基于連翹轉錄組數(shù)據(jù)，篩選獲得21條連翹基因家族相關序列，使用ORF Finder在線分析網(wǎng)站獲得連翹基因家族氨基酸序列全長，并與擬南芥及水稻基因家族序列進行BLAST比對，將初步獲得的連翹PAO家族蛋白序列通過結構域在線分析軟件SMART對保守結構域進行分析，通過篩選，最終鑒定到5個基因家族成員，依次命名為～。通過對連翹PAO家族蛋白序列保守結構域進行分析，結果見圖1，發(fā)現(xiàn)連翹PAO家族均含有Pfam Amino_oxidase的完整結構域。

對篩選出的連翹PAO家族進行蛋白理化性質分析（表2），結果表明連翹PAO家族編碼蛋白質氨基酸數(shù)介于235～541 aa，預測得到的理論相對分子質量為26 069～59 328，等電點在5.27～5.86；不穩(wěn)定系數(shù)為35.68～44.14，推測連翹PAO家族均為不穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水性皆為負值，推測連翹PAO家族蛋白均為酸性、親水性蛋白。預測蛋白質二級結構結果顯示，連翹PAO家族蛋白均含有α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲和自由延伸鏈，其中α-螺旋與無規(guī)則卷曲類別占比較高，其為PAO蛋白的主要二級結構形式。

圖1 連翹PAO家族蛋白保守結構域

表2 連翹PAO基因家族蛋白理化性質分析

3.2 連翹PAO家族的蛋白保守基序分析

對連翹PAO家族中的保守Motif進行分析預測結果表明（圖2），連翹PAO家族中含有8個保守Motif，每個成員含有的Motif有所相同，F(xiàn)sPAO2、FsPAO3、FsPAO4含有相同的Motif。FsPAO1及FsPAO5含有相同的Motif，但它們所含有的Motif位置不同，這些差異可能揭示這些蛋白功能的多樣性，并且說明了連翹基因家族的蛋白序列是相對保守的。

圖2 連翹PAO家族成員保守基序分析

3.3 連翹PAO家族系統(tǒng)進化關系分析

為探索不同植物PAO家族蛋白間的進化關系，通過NCBI將連翹PAO家族蛋白質序列與擬南芥、水稻、玉米、番茄、甜橙PAO家族蛋白質序列進行多序列對比，并構建系統(tǒng)進化樹（圖3），通過對系統(tǒng)進化樹的分析，并結合“2.2”項中的蛋白保守基序分析結果，可將連翹PAO家族分為3類：連翹FsPAO1與擬南芥AtPAO1相近，隸屬于亞家族I，連翹FsPAO2、FsPAO3、FsPAO4與擬南芥AtPAO2、AtPAO3、AtPAO4相近且具有相似Motif，歸類于同一分區(qū)，屬于亞家族Ⅲ一類，連翹FsPAO5與甜橙CsPAO1、CsPAO2以及擬南芥AtPAO5相近，劃分于亞家族II。

3.4 連翹PAO基因家族成員在連翹不同組織器官中的表達

為了探究連翹基因家族成員在不同組織中的表達情況，利用熒光定量PCR測定了連翹在連翹葉片、果實以及愈傷組織中的轉錄水平（圖4），在果實、葉片、愈傷組織中的相對表達量存在顯著差異（＜0.05）。結果顯示，連翹基因家族在葉片、果實以及愈傷組織中均有表達，但表達量不盡相同。相比較下，在連翹愈傷組織中的相對表達量最高，顯著高于在葉片中的表達；在連翹果實中的相對表達量相對較高，在葉片及愈傷組織中的相對表達量相近；在連翹果實中的相對表達量最高，其次為愈傷組織，均高于在葉片中的表達；在連翹果實中的相對表達量最高，顯著高于葉片中的表達，在愈傷組織中的相對表達量顯著低于在葉片中的表達；在連翹果實中的相對表達量最高，顯著高于在葉片及愈傷組織中的表達。

圖3 連翹PAO家族系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3.5 連翹PAO基因家族成員在鹽脅迫下的表達

為探究鹽脅迫處理下連翹基因家族成員的表達情況，對不同處理時間的愈傷組織進行了基因表達分析（圖5）。其中，在NaCl處理后1 d后的相對表達量迅速上升到最大值，達到15倍以上，并在處理3 d后急速下降，在愈傷組織適應脅迫條件后達到穩(wěn)定狀態(tài)；在NaCl處理后的表達水平下調，并在處理7 d時相對表達量回調，并有上升趨勢；在NaCl處理1 d后相對表達量明顯下降，并在7 d后開始逐漸上升；在NaCl處理1d后相對表達量隨著處理時間的增加而逐漸上升；在NaCl處理1 d后相對表達量開始上升，并在處理5 d后達到最大值，相對表達量上升3.5倍，在處理7 d后相對表達量下降；結果表明，連翹PAO基因家族成員在鹽脅迫條件下均受到誘導，但處理時間的不同，具有不同的響應效果。

圖4 連翹PAO基因家族成員在不同組織的相對表達量

與處理0 d比較，*P < 0.05, **P <0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1，下圖同。

3.6 連翹PAO基因家族成員在干旱脅迫下的表達

根據(jù)熒光定量PCR結果分析（圖6），在干旱脅迫條件下，表現(xiàn)出相同的表達水平趨勢，在處理3 d后約為7倍之多，但相比較下對于鹽脅迫的響應更為顯著。在干旱脅迫條件下，在處理5 d后相對表達量顯著上調，表明在鹽脅迫以及干旱脅迫條件下的響應可能有所不同。在干旱脅迫條件下，在處理5d后相對表達量上升，而后下降，相比較下，對于鹽脅迫的響應更為明顯。相似的，在干旱脅迫條件下的相對表達量趨勢為隨著處理時間的增加而逐漸上升，表明可能對于鹽脅迫和干旱脅迫都具有響應效果。在干旱脅迫條件下，相對表達量的結果為先上升后下降之后上升，在處理10 d時達到最大值，表明對于鹽脅迫和干旱脅迫都做出響應，但響應效果有所不同。這些結果表明，連翹基因家族成員在干旱脅迫下的相對表達量均有變化，隨處理時間的增加，具有不同的響應效果。

圖6 在干旱脅迫條件下連翹PAO基因家族成員的

4 討論

植物在生長發(fā)育過程中會受到各種生物和非生物脅迫的影響，在受到非生物脅迫時，調節(jié)自身基因適應環(huán)境也是主要方法之一。在水稻[21]中，在種子萌發(fā)期的表達水平增高會通過增加了PAO酶活性，維持ROS穩(wěn)態(tài)，影響Na+含量，從而提高水稻耐鹽性。在玉米[22]中，干旱條件下基因家族表達可能提高光合光反應效率和整體耐受性。在辣椒[23]中，和在擬南芥中的過表達通過改變轉基因植物的生理和分子水平來提高其對低溫脅迫的耐受性。在大豆[24]中過表達也會提高大豆的耐鹽性，提高種子發(fā)芽率。在棉花[25]中，基因的啟動子區(qū)域存在響應干旱脅迫的順式作用元件，轉入擬南芥中降低了擬南芥幼苗的抗旱能力。

本研究中，從轉錄組中篩選出21條相關基因家族成員，通過生物信息學分析，最終得到5條PAO蛋白，植物中的PAO通常分為4個亞家族[8, 26-27]，本研究中生物信息學分析結果表明，連翹5個PAO蛋白分為3個亞家族，而沒有屬于亞家族IV的成員。理化性質、蛋白結構域、進化關系、家族分類、蛋白保守基序均顯示出屬于同一亞家族的成員具有相似的特征，不同亞家族的成員之間表現(xiàn)為多樣性，這可能與連翹基因家族的進化密切相關。

基因表達結果顯示在不同器官和組織中的表達具有差異性，有報道證明番茄基因家族在不同組織中的表達同樣具有差異性[14]。實時熒光定量PCR結果表明，有在葉片、果實和愈傷組織中均有表達。在果實中有較高的表達水平，在愈傷組織中有較高的表達水平，推測基因家族的組織表達多樣性與功能多樣性之間可能具有一定的相關性。

為進一步探究連翹基因家族對鹽脅迫以及干旱脅迫下的響應模式，本試驗結合轉錄組篩選結果對鹽脅迫及干旱脅迫下的連翹基因家族成員的表達進行分析，發(fā)現(xiàn)在200 mmol/L NaCl處理下，、、表達顯著上調，與棉花[28]中基因的先上升后下降結果類似，、表達下調，說明基因家族成員對鹽脅迫也能產(chǎn)生應答反應。在400 mmol/L甘露醇處理后，表達均表現(xiàn)為顯著上調，與相關報道中[29]逆境處理后PAO活性先上升后下降的趨勢相同。這些結果與之前關于PAO提高抗旱機制的報告一致[30]，由此可見，連翹基因家族成員均受到鹽脅迫和干旱脅迫影響，推測它們可能參與到鹽脅迫及干旱脅迫的響應過程，但這些基因的分子調控機制及潛在功能還需進一步研究探討。

綜上所述，本研究從連翹基因組中分析出了5個基因家族，分類分析和組織表達分析顯示出其可能的生化和生理功能多樣性，在鹽脅迫和干旱脅迫響應中表現(xiàn)出不同的逆境脅迫相關性，為后續(xù)這些基因的功能鑒定提供了重要參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification and expression analysis ofgene family under salt and drought stress

CHEN Jiaxi1, 2, GUO Guangyang1, 2, TAN Xinjie1, 2, LV Shufang1, 2, XU Huawei1, 2, YUAN Meng1, 2, DENG Ping1, 2, HOU Dianyun1, 2

1. College of Agriculture,, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China 2. Henan Engineering Research Center for Evaluation and Innovative Utilization of Homology of Medicine and Food, Luoyang 471023, China

To study the response characteristics of Lianqiao ()polyamine oxidase () gene family under salt and drought stress.Five members of thegene family were identified by analyzing thetranscriptome data. The correlation analysis was carried out by means of protein physical and chemical properties and motif analysis, protein structure analysis, phylogenetic analysis, and structural domains. The gene expression levels were analyzed under salt and drought stress.The amino acid number of thegene family ranged from 235 to 541 aa; The molecular weight from 26 069 to 59 328; The isoelectric point ranged from 5.27 to 5.86; The instability coefficients from 35.68 to 44.14, and the total average hydrophilicity was negative, so it was hypothesized that all the proteins of thegene family were unstable, acidic, hydrophilic proteins, with α-Helix and irregular coil being the main secondary structural forms of PAO proteins.The five identified members of thegene family had specific expression patterns, and salt stress and drought stress induced the expression of the five members of thegene family, which might be involved in the regulation ofin response to salt stress and drought stress. Through this study lays a foundation for in-depth exploration of the function of thegene family.

(Thunb.) Vahl;gene family; gene expression; stress; protein structure analysis

R286.12

A

0253 - 2670(2024)09 - 3077 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.021

2023-10-09

國家自然科學基金項目（U1404829）；中央本級重大增減支項目“名貴中藥資源可持續(xù)利用能力建設項目”（2060302）；河南省自然科學基金資助項目（202102110156）；河南省科技攻關（242102110325）；河南省中藥材產(chǎn)業(yè)科技特派員服務團、河南省中藥產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助

陳佳茜（1999—），碩士研究生，主要從事藥用植物分子生物學研究。E-mail: chenjiaxi0120@163.com

通信作者：侯典云（1975—），教授，博士生導師，主要從事藥用植物資源評價與利用研究。Tel: (0379)64282340 E-mail: dianyun518@163.com

[責任編輯 時圣明]