肖蓮蓮，余靈靜，劉藝芃，胡 楊，張?jiān)朴?，?晶，程建明*

人參囊泡調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境的活性成分研究

肖蓮蓮1, 2，余靈靜1, 2，劉藝芃1, 2，胡 楊1, 2，張?jiān)朴?, 2，嵇 晶1, 2，程建明1, 2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省經(jīng)典名方工程研究中心，江蘇 南京 210023

探討人參來(lái)源的細(xì)胞外囊泡（ginseng-derived nanoparticles，GDNPs）在調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型及抑制黑色素瘤生長(zhǎng)方面的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。采用納米顆粒跟蹤分析儀、透射電鏡測(cè)試及紫外-可見(jiàn)分光光度法全面表征GDNPs及其主要成分（蛋白質(zhì)、多糖和皂苷）的含量；通過(guò)qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GDNPs與其含有的多糖、皂苷成分對(duì)骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）表型的調(diào)控影響。收集不同極化程度的BMDM條件培養(yǎng)基（conditional medium，CM）孵育小鼠皮膚黑色素瘤B16F10細(xì)胞，CCK-8法測(cè)定不同CM處理后B16F10細(xì)胞活力，驗(yàn)證活性成分對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)控作用；通過(guò)PMP柱前衍生法定量分析GDNPs活性成分組成。透射電鏡下觀察GDNPs形態(tài)結(jié)構(gòu)良好，含量測(cè)定結(jié)果為2.46×1011顆粒的GDNPs含有4.31 mg蛋白質(zhì)、4.46 mg多糖、1.22 mg皂苷。qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GDNPs多糖可以逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細(xì)胞表型，向M1方向極化。GDNPs多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化后的CM顯著抑制了B16F10細(xì)胞活力。PMP柱前衍生法分析GDNPs多糖成分由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，其物質(zhì)的量比為4.72∶1.07∶2.15。揭示了GDNPs中多糖成分在調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)鍵作用，為進(jìn)一步的機(jī)制研究和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

人參細(xì)胞外囊泡；腫瘤免疫微環(huán)境；巨噬細(xì)胞極化；多糖；葡萄糖；半乳糖；阿拉伯糖

目前，腫瘤免疫治療在癌癥的進(jìn)展及其治療策略中占據(jù)核心地位，腫瘤免疫治療是指免疫細(xì)胞滲透到腫瘤部位啟動(dòng)抗癌免疫應(yīng)答，控制或殺滅腫瘤細(xì)胞的療法。但腫瘤細(xì)胞會(huì)通過(guò)劫持免疫檢查點(diǎn)、重塑腫瘤的細(xì)胞外基質(zhì)形成阻止免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的屏障，以及通過(guò)影響免疫抑制細(xì)胞和免疫微環(huán)境中相關(guān)信號(hào)通路形成免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，從而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊[1-2]。腫瘤免疫微環(huán)境由免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞因子以及其他多種分子間的精細(xì)相互作用所構(gòu)成。癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間持續(xù)、動(dòng)態(tài)的相互作用是促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。在此環(huán)境中，巨噬細(xì)胞作為免疫反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，其表型轉(zhuǎn)變及功能活性對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境具有顯著的調(diào)控作用。它們可以根據(jù)刺激和環(huán)境因素被激活為M1型（經(jīng)典激活）或M2型（替代激活）。M1型巨噬細(xì)胞具備顯著的抗腫瘤能力，呈現(xiàn)出免疫激活態(tài)，并能夠釋放免疫刺激性細(xì)胞因子。M2型巨噬細(xì)胞則具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散的潛力，釋放免疫抑制性因子[3-5]。鑒于此，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型表型的轉(zhuǎn)變已被視為腫瘤治療的潛在策略，通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)來(lái)優(yōu)化腫瘤免疫微環(huán)境，進(jìn)而增強(qiáng)免疫治療效果。

幾乎所有的細(xì)胞類(lèi)型，無(wú)論是在體內(nèi)還是體外，都會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），它們的結(jié)構(gòu)、成分和分子加工反映了它們起源細(xì)胞中發(fā)生的活動(dòng)[6]。植物來(lái)源EVs具有天然生物活性脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA和其他藥理活性分子，具有獨(dú)特的形態(tài)和組成特征[7-9]。人參來(lái)源的細(xì)胞外囊泡（ginseng-derived nanoparticles，GDNPs）已經(jīng)被證明具有調(diào)節(jié)免疫[10]、抗腫瘤[11]、抗衰老[12]、促進(jìn)傷口愈合[13]、抗心肌損傷[14]、抗炎[15]、抗骨質(zhì)疏松[16]的藥理作用。之前的研究分別從體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證明了GDNPs能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫微環(huán)境促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞由M2向M1表型的極化，產(chǎn)生總活性氧，導(dǎo)致小鼠黑色素瘤細(xì)胞凋亡增加并顯著抑制了荷瘤小鼠的黑色素瘤生長(zhǎng)[17]。除此之外，藥物通過(guò)血腦屏障治療腦腫瘤的能力被認(rèn)為是最重要的藥物特性之一，而GDNPs在調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，募集M1巨噬細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)于透過(guò)血腦屏障靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有良好的潛力[18]。早期研究已揭示GDNPs內(nèi)含豐富的代謝產(chǎn)物，并能夠介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)通訊。這種介導(dǎo)機(jī)制主要通過(guò)Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）和髓樣分化因子88（myeloid differentiation primary response 88，MyD88）信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，進(jìn)而調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞的功能，使其表現(xiàn)出抗腫瘤活性[17]。盡管有此初步發(fā)現(xiàn)，但GDNPs在調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境中的確切作用的活性成分還不完全?；诖?，本研究旨在采用巨噬細(xì)胞極化模型，深入探討GDNPs中的活性成分，以揭示其在腫瘤免疫微環(huán)境調(diào)控中的詳細(xì)機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞株

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由南京安諾康生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)為NO.202343651，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（蘇）2018-0049，飼養(yǎng)溫度為24～25 ℃，相對(duì)濕度為50%～60%，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)202306A011）。

B16F10小鼠皮膚黑色素瘤細(xì)胞系購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥品與試劑

GDNPs由實(shí)驗(yàn)室制備，具體方法參考文獻(xiàn)[17]；RPMI 1640完全培養(yǎng)基（批號(hào)WHAA23X032）、0.02% EDTA溶液（Versene液，批號(hào)WH2622F311）均購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司；巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF，批號(hào)0332537CL21）、白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4，批號(hào)0332538KE01）、IL-13（批號(hào)0332650NG026）均購(gòu)自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)GK10009）購(gòu)自美國(guó)GlpBio公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號(hào)L8880）、紅細(xì)胞裂解液（批號(hào)20220818）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；甲醇（批號(hào)20230228）、乙醇（批號(hào)20220325）、三氯甲烷（批號(hào)20220311）、正丁醇（批號(hào)20221020）、石油醚（批號(hào)20220429）、無(wú)水磷酸二氫鈉（批號(hào)20220217）均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；高氯酸（批號(hào)2012003）購(gòu)自天津鑫源化工有限公司；流式細(xì)胞染色緩沖液（批號(hào)2207X220780）購(gòu)自上海懋康生物科技有限公司；PE抗鼠CD206抗體（批號(hào)B369245）、FITC抗鼠CD86抗體（批號(hào)B367027）、抗鼠CD16/32抗體（批號(hào)B343988）均購(gòu)自Biolegend公司；人參皂苷Re對(duì)照品（批號(hào)AZ21122181，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司；巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)C20PB02541B）購(gòu)自普西唐生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品半乳糖（批號(hào)S07HB193921）、葡萄糖醛酸（批號(hào)R09J11H115178）、阿拉伯糖（批號(hào)K28J12B135956）、半乳糖醛酸（批號(hào)J09HB187862）、鼠李糖（批號(hào)O12A10K95105）、木糖（批號(hào)D17N9S74410）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)E1811036）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 儀器

Gallios分析型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman公司）；Nanosight NS300型納米顆粒跟蹤分析儀（英國(guó)Malvern公司）；2695型高效液相色譜儀、2998型PDA紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）。

2 方法

2.1 GDNPs的表征及穩(wěn)定性測(cè)試

2.1.1 透射電鏡觀察 取適量GDNPs，使用PBS稀釋至適當(dāng)濃度。取10 μL稀釋液滴在銅網(wǎng)上，靜置4 min，隨后用2%磷鎢酸染色3 min。在室溫下自然風(fēng)干后，置于200 kV電壓的透射電鏡下進(jìn)行成像。

2.1.2 粒徑與粒子濃度的測(cè)定 取適量GDNPs，并用PBS稀釋到所需濃度，隨后在納米顆粒跟蹤分析儀的自動(dòng)模式下進(jìn)行測(cè)量。

2.1.3 穩(wěn)定性測(cè)試 將GDNPs置于4 ℃保存，每天于同一時(shí)間點(diǎn)利用納米顆粒跟蹤分析儀測(cè)定粒徑，連續(xù)測(cè)定7 d，觀察GDNPs粒徑變化。

2.2 蛋白質(zhì)、多糖、皂苷類(lèi)成分含量測(cè)定

2.2.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 根據(jù)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量，精密量取供試品溶液2 μL，用空白溶劑補(bǔ)足至20 μL，各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min，在562 nm下測(cè)定各個(gè)樣品吸光度（）值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其在GDNPs中的含量。

2.2.2 多糖含量測(cè)定 采用苯酚硫酸法測(cè)定GDNPs中的多糖含量，精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于干燥至恒定質(zhì)量的試管中，以蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL。精密加入5%苯酚溶液0.5 mL及濃硫酸2.5 mL，充分振搖5 min，置沸水浴加入20 min，立即置于冰水浴中冷卻3 min，在488 nm處測(cè)定各溶液的值。精密量取供試品溶液0.1 mL，測(cè)定方法同標(biāo)準(zhǔn)品，在488 nm處測(cè)定各供試品的值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其在GDNPs中的含量。

2.2.3 皂苷類(lèi)成分含量測(cè)定 精密吸取人參皂苷Re對(duì)照品溶液0、10、20、40、80、100、120 μL，分別置10 mL干燥的具塞試管中，60 ℃水浴蒸干溶劑，精密加5%香草醛冰醋酸溶液-高氯酸（2∶8）的混合溶液1 mL，置60 ℃水浴中加熱15 min，取出，置冰水浴中冷卻，精密加冰醋酸5 mL，搖勻，在544 nm處測(cè)定各溶液的值。精密量取供試品溶液300 μL，測(cè)定方法同標(biāo)準(zhǔn)品，在544 nm處測(cè)定各供試品的值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其在GDNPs中的含量。

2.3 GDNPs多糖、皂苷成分提取方法

取適量GDNPs加入10倍量的去離子水在80 ℃下煎煮2 h，趁熱抽濾，收集濾液，減壓濃縮至10 mL，加入無(wú)水乙醇調(diào)整體積分?jǐn)?shù)至95%，4 ℃靜置過(guò)夜，收集沉淀，純水復(fù)溶后使用Sevag法進(jìn)行脫蛋白處理，蒸干溶劑，純水復(fù)溶得到GDNPs多糖樣品（GP）。

取適量GDNPs加入10倍量的70%乙醇溶液回流提取2 h，趁熱抽濾，收集濾液，減壓濃縮至無(wú)醇味，依次使用石油醚、三氯甲烷、水飽和正丁醇萃取，回收正丁醇層，蒸干，純水復(fù)溶得到GDNPs皂苷樣品（GG）。

2.4 B16F10細(xì)胞培養(yǎng)

B16F10細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d傳代1次。

2.5 骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）極化相關(guān)實(shí)驗(yàn)

2.5.1 BMDM提取 C57BL/6小鼠脫頸處死，迅速浸泡在75%乙醇中5～10 min。在超凈臺(tái)上分離小鼠的股骨和脛骨，并轉(zhuǎn)移至PBS中。利用無(wú)菌手術(shù)剪刀小心地切除股骨的兩端，隨后用1 mL帶針注射器抽取PBS，并注入股骨兩端，使骨髓細(xì)胞流出到培養(yǎng)皿內(nèi)。利用移液槍反復(fù)吹打，使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液過(guò)100 μm的細(xì)胞濾網(wǎng)，以去除細(xì)胞團(tuán)塊、骨碎片、皮毛和其他雜質(zhì)。細(xì)胞懸液于室溫1 500 r/min離心5 min后，去掉上清液。加入1 mL紅細(xì)胞裂解液孵育3 min，于室溫1 500 r/min離心5 min，然后用PBS洗滌細(xì)胞。將細(xì)胞重新懸浮在含20 ng/mL M-CSF的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中。在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并放置在CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天更換1次培養(yǎng)基，直到第7天觀察到梭形細(xì)胞，標(biāo)志著B(niǎo)MDM的成熟。

2.5.2 qRT-PCR分析BMDM的、mRNA表達(dá) 將成熟的BMDM調(diào)整至1×106個(gè)/孔，設(shè)置空白組、模型組和給藥組，空白組只添加不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，模型組加入20 ng/mL的IL-4、IL-13），孵育48 h；給藥組在添加20 ng/mL的IL-4、IL-13孵育24 h后，分別添加低、中、高劑量（10、20、40 μg/mL）的多糖提取物（GP1、GP2、GP3）或低、中、高劑量（3、6、12 μg/mL）的皂苷成分提取物（GG1、GG2、GG3）孵育至48 h。給藥結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗2次，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.5.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMDM的CD206、CD86熒光表達(dá) 將成熟的BMDM調(diào)整至1×106個(gè)/孔，設(shè)置空白組、模型組和給藥組，空白組只添加不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，模型組加入20 ng/mL的IL-4、IL-13），孵育48 h；給藥組在添加20 ng/mL的IL-4、IL-13孵育24 h后，分別添加10 μg/mL GDNPs或低、中、高劑量（10、20、40 μg/mL）的多糖提取物（GP1、GP2、GP3）或低、中、高劑量（3、6、12 μg/mL）的皂苷成分提取物（GG1、GG2、GG3）孵育至48 h。給藥結(jié)束后，每孔加入1 mL 0.02% EDTA溶液，消化收集細(xì)胞，加入1 mL細(xì)胞染色緩沖液洗滌細(xì)胞2次，500 μL細(xì)胞染色緩沖液重懸，收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中。加入Fc受體封閉劑抗鼠CD16/32冰上孵育10 min，然后加入PE抗鼠CD206抗體、FITC抗鼠CD86抗體于冰上染色30 min。孵育結(jié)束后，加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞2次，4 ℃、1 500 r/min離心5 min；棄去上清，加入500 μL PBS重懸細(xì)胞，過(guò)300目篩網(wǎng)轉(zhuǎn)移至流式管中，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)情況。

2.5.4 BMDM條件培養(yǎng)基（conditional medium，CM）的制備[19-20]誘導(dǎo)成熟的BMDM分為M1組（加入100 ng/mL的LPS）、M2組（加入20 ng/mL的IL-4、IL-13）、GP1組（在添加IL-4、IL-13孵育24 h后添加10 μg/mL GP孵育至48 h）、GP2組（在添加IL-4、IL-13孵育24 h后添加20 μg/mL GP孵育至48 h）、GP3組（在添加IL-4、IL-13孵育24 h后添加40 μg/mL GP孵育至48 h），給藥孵育后得到不同極化的巨噬細(xì)胞，在無(wú)血清培養(yǎng)基中孵育24 h后棄去培養(yǎng)基，10 000 r/min離心5 min，收集上清作為CM，分別得到M1-CM、M2-CM、GP1-CM、GP2-CM、GP3-CM用于孵育B16F10細(xì)胞，測(cè)定B16F10細(xì)胞活力以驗(yàn)證GDNPs中的活性成分。

2.6 CCK-8法檢測(cè)B16F10細(xì)胞活力

常規(guī)培養(yǎng)B16F10細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔加入細(xì)胞混懸液100 μL，待細(xì)胞貼壁后，加入不同CM繼續(xù)培養(yǎng)，空白組與調(diào)零孔（不含細(xì)胞）加入無(wú)血清培養(yǎng)基，24 h后棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL培養(yǎng)基洗滌2次后更換新的培養(yǎng)基，各孔加入10 μL的CCK-8試劑，37 ℃孵育4 h，并于酶標(biāo)儀上讀取各孔在450 nm處的值，計(jì)算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力＝(給藥－調(diào)零)/(空白－調(diào)零)

2.7 GDNPs多糖的單糖組成分析及方法學(xué)考察[21-23]

2.7.1 PMP柱前衍生法分析單糖組成 取適量GDNPs，加入3 mol/L三氟乙酸溶液3 mL，超聲溶解，封口，110 ℃水解6 h，放冷至室溫，3 000 r/min離心10 min，取上清液減壓蒸干，加甲醇溶解蒸干5～6次，殘?jiān)映兯芙舛ㄈ葜? mL，制得水解后樣品供試液。取葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品各400 μL，加400 μL的0.5 mol/L PMP甲醇溶液和400 μL的0.3 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻，70 ℃水浴加熱100 min后，再加500 μL的0.3 mol/L鹽酸，混勻。加入2 mL三氯甲烷萃取，劇烈搖晃，3 500 r/min離心5 min，棄去氯仿層，過(guò)0.22 μm濾膜得PMP衍生化樣品。使用Waters高效液相色譜儀進(jìn)行分析，色譜條件為Agilent ZORBX SB-aq C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫25 ℃；體積流量1 mL/min；流動(dòng)相為磷酸二氫鈉鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.85）-乙腈（82∶18），等度洗脫。

2.7.2 線性關(guān)系考察 按“2.7.1”項(xiàng)下方法制備各對(duì)照品系列質(zhì)量濃度的PMP衍生化標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。以葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖3個(gè)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），分析得到其線性回歸方程、線性系數(shù)（）和線性范圍分別為葡萄糖＝585 162＋837 782，＝0.999 3，線性范圍1.05～20.96 mg/mL；半乳糖＝901 803＋35 251，＝0.999 6，線性范圍0.20～12.26 mg/mL；阿拉伯糖＝950 752－92 833，＝0.999 7，線性范圍0.35～10.46 mg/mL。結(jié)果顯示，3個(gè)成分的線性系數(shù)在0.999 3～0.999 7，符合線性關(guān)系考察要求。

2.7.3 精密度試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液，按照“2.7.1”項(xiàng)下制備PMP衍生化標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示，葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖3個(gè)成分的峰面積RSD分別為1.23%、1.19%、1.36%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取GDNPs樣品，按照“2.7.1”項(xiàng)下方法制備PMP衍生化供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12 h在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示，供試品溶液中葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖3個(gè)成分的峰面積RSD分別為2.34%、2.78%、2.06%，均小于3%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取GDNPs樣品，按照“2.7.1”項(xiàng)下方法平行制備6份PMP衍生化供試品溶液，按“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示，供試品溶液中葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的峰面積RSD分別為1.40%、1.82%、1.52%，均小于3%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.7.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取6份已測(cè)定單糖含量的GDNPs樣品，每份1 mL，分別精密加入樣品中指標(biāo)成分質(zhì)量與對(duì)照品質(zhì)量比例約為1∶1的對(duì)照品溶液，按照“2.7.1”項(xiàng)下方法制備PMP衍生化供試品溶液，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各供試品的加樣回收率和RSD值。結(jié)果顯示，葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖3個(gè)成分的平均加樣回收率分別為98.30%、102.11%、101.76%，RSD分別為2.52%、2.08%、1.79%，且均小于3%，加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果良好。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 GDNPs的表征及穩(wěn)定性測(cè)試

GDNPs是由人參細(xì)胞分泌的一種具有膜結(jié)構(gòu)的小泡，能夠攜帶蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和代謝物等成分，在植物機(jī)體中參與生長(zhǎng)代謝過(guò)程。對(duì)GDNPs進(jìn)行表征如圖1-A所示，在透射電鏡下可以看出GDNPs呈雙層膜結(jié)構(gòu)的圓形小泡，獨(dú)特空間結(jié)構(gòu)可作為載體運(yùn)載人參的活性成分靶向受體部位，介導(dǎo)一系列的生物學(xué)功能。使用納米顆粒跟蹤分析儀測(cè)定GDNPs的粒徑，結(jié)果見(jiàn)圖1-B，GDNPs的粒徑分布在60～320 nm。本研究利用納米顆粒跟蹤分析儀連續(xù)7 d監(jiān)測(cè)GDNPs在4 ℃環(huán)境存放過(guò)程中的粒徑變化，結(jié)果如圖1-C所示，GDNPs的粒徑并無(wú)明顯變化，表明在4 ℃條件下GDNPs可以儲(chǔ)存7 d，且穩(wěn)定性良好。

A-GDNPs超微結(jié)構(gòu)；B-GDNPs粒徑；C-GDNPs在4 ℃環(huán)境存放過(guò)程中的粒徑變化。

3.2 GDNPs的含量測(cè)定

2.46×1011顆粒的GDNPs含有4.31 mg蛋白質(zhì)、4.46 mg多糖、1.22 mg皂苷，結(jié)果顯示多糖成分的含量最高。在目前的研究報(bào)道中，人參中多糖成分與皂苷均具有逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞表型，調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境的作用[3,24]。前期研究已經(jīng)證明GDNPs脂質(zhì)和蛋白質(zhì)導(dǎo)致了M2型巨噬細(xì)胞極化的改變[17]。本研究進(jìn)一步對(duì)GDNPs中的皂苷與多糖是否為調(diào)控巨噬細(xì)胞表型活性成分進(jìn)行研究。

3.3 不同成分對(duì)M2型BMDM極化的影響

3.3.1 不同成分對(duì)M2型BMDM、mRNA表達(dá)的影響 為探究GDNPs逆轉(zhuǎn)M2巨噬細(xì)胞表型的活性成分，分別提取了GDNPs的多糖與皂苷成分。CD206為M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD86為M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物。由圖2可知，GP組可以改變巨噬細(xì)胞表型，向M1方向極化，而GG組不能逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細(xì)胞的極化表型。

3.3.2 不同成分對(duì)M2型BMDM CD206、CD86熒光表達(dá)的影響 如圖3所示，GP組與GG組結(jié)果同qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，GP組誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86和CD206均呈顯著性升高和降低（＜0.05、0.01）。其中GDNPs組對(duì)于逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細(xì)胞表型藥理效應(yīng)最佳，這可能與GDNPs具有納米囊泡結(jié)構(gòu)有關(guān)，提高了生物利用度。GG組雖然沒(méi)有對(duì)M2型巨噬細(xì)胞表型起逆轉(zhuǎn)作用，但其驅(qū)使巨噬細(xì)胞繼續(xù)向替代激活的M2抗炎表型極化，其抗炎作用可能協(xié)同其他活性成分，防止過(guò)度逆轉(zhuǎn)M2表型，避免GDNPs對(duì)機(jī)體造成炎癥損傷。

與空白組比較：##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，圖3同。

3.4 活性成分處理的巨噬細(xì)胞CM抑制B16F10細(xì)胞增殖

為了進(jìn)一步驗(yàn)證GP是否為GDNPs介導(dǎo)調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境發(fā)揮抗癌效應(yīng)的活性成分，制備不同成分誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞CM，使用不同CM處理B16F10細(xì)胞24 h，通過(guò)CCK-8法評(píng)價(jià)不同CM對(duì)B16F10細(xì)胞增殖作用的影響。如圖4所示，M2-CM無(wú)明顯抑制B16F10細(xì)胞增殖的作用，GP-CM能夠顯著抑制B16F10細(xì)胞的增殖。

3.5 活性多糖成分的單糖組成分析

采用PMP柱前衍生法對(duì)活性GP進(jìn)行單糖組成分析，圖5-A、B分別為單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖、GDNPs活性多糖成分水解液的色譜圖。經(jīng)HPLC測(cè)定GDNPs活性多糖由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，其物質(zhì)的量比為4.72∶1.07∶2.15。

與空白組比較：***P＜0.001。

A-單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（1-PMP，2-巖藻糖，3-半乳糖，4-葡萄糖醛酸，5-阿拉伯糖，6-半乳糖醛酸，7-鼠李糖，8-葡萄糖，9-木糖）；B-水解GDNPs多糖樣品的色譜圖（1-PMP，2-葡萄糖，3-半乳糖，4-阿拉伯糖）。

4 討論

目前，治療癌癥方法不再專注于靶向腫瘤細(xì)胞本身，因?yàn)榘┌Y的進(jìn)展是由腫瘤細(xì)胞和腫瘤部位環(huán)境之間的相互作用調(diào)控的，腫瘤微環(huán)境是一個(gè)以腫瘤為主體，由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成的復(fù)雜的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)。在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的密集對(duì)話可以驅(qū)動(dòng)促或抗腫瘤表型。反之，腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中強(qiáng)烈塑造細(xì)胞因子和代謝物水平，因此在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)支持1型T輔助性細(xì)胞（1 type helper T-lymphocyte，Th1）介導(dǎo)的抗癌反應(yīng)和促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的招募來(lái)促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)[25-28]。

植物來(lái)源的EVs相較于動(dòng)物細(xì)胞外囊泡展示出一系列顯著的優(yōu)越性[29-32]。這些優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在植物EVs的低免疫原性上，這一特性在治療應(yīng)用中顯得尤為重要，因?yàn)樗鼧O大降低了引發(fā)免疫系統(tǒng)反應(yīng)的可能性。此外，從經(jīng)濟(jì)和可持續(xù)發(fā)展的角度來(lái)看，植物細(xì)胞的批量培養(yǎng)過(guò)程既經(jīng)濟(jì)又高效，相比之下，動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)更為復(fù)雜和成本較高。植物EVs在極端環(huán)境條件下展現(xiàn)出的穩(wěn)定性，如高溫和干燥條件下的穩(wěn)定性，對(duì)于藥物的長(zhǎng)期儲(chǔ)存和運(yùn)輸是一個(gè)不可忽視的優(yōu)點(diǎn)。從藥物遞送的角度來(lái)看，植物EVs作為天然的載體，能夠有效地運(yùn)輸包括RNA、DNA和蛋白質(zhì)在內(nèi)的多種藥物分子。這種生物相容性強(qiáng)的特性，減少了在臨床應(yīng)用中產(chǎn)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。而且，選擇植物源的EVs作為遞送載體，可以避免與動(dòng)物源相關(guān)的污染和病原體傳播的風(fēng)險(xiǎn)。在某些情況下，特定植物的EVs還可能包含有獨(dú)特的生物活性成分，這為開(kāi)發(fā)新型治療策略提供了潛在的途徑[33]。

植物EVs在藥物輸送系統(tǒng)中的應(yīng)用尤其引人注目。它們被認(rèn)為是一種生物兼容、可生物降解且來(lái)源廣泛的納米輸送系統(tǒng)，可用于無(wú)細(xì)胞治療。在臨床前和臨床研究中，植物EVs已顯示出比傳統(tǒng)合成載體更多的優(yōu)勢(shì)，為新型藥物輸送系統(tǒng)開(kāi)辟了新的前沿領(lǐng)域。例如，姜源EVs在改變腸道菌群和調(diào)節(jié)宿主生理以抑制結(jié)腸炎方面展現(xiàn)出了潛力[34]。Umezu等[35]證明了針葉櫻桃衍生的納米囊泡在封裝和保護(hù)核酸方面的可行性，以及它們?cè)趯⑦@些化合物遞送至體內(nèi)靶位點(diǎn)的有效性。Pomatto等[36]研究了來(lái)源于柑橘汁的EVs作為口服給藥的編碼嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型S1蛋白亞基的信使核糖核酸疫苗的載體，該疫苗具有胃抗性口服膠囊制劑。加載到EVs中的mRNA受到保護(hù)，并且在冷凍干燥和封裝后在室溫下穩(wěn)定1年。

GDNPs在調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境方面已顯示出顯著的潛力，Han等[37]研究證明GDNPs可以重組腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，增加CC類(lèi)趨化因子5（CC chemokine ligand 5，CCL5）和趨化因子CXC配體9（C-X-C motif chemokine 9，CXCL9）的分泌，招募CD8+T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤床，將冷腫瘤微環(huán)境轉(zhuǎn)換為熱腫瘤微環(huán)境改善免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療效果。Lv等[10]研究發(fā)現(xiàn)由于GDNPs改變了精氨酸酶-1的表達(dá)，從而激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活性，同時(shí)上調(diào)由mTOR活性調(diào)節(jié)的T-bet表達(dá)。而促進(jìn)T細(xì)胞耗竭的T細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Eomes和Tox的表達(dá)受到抑制，最終降低了免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)，改善了T細(xì)胞耗竭，恢復(fù)了T細(xì)胞的抗腫瘤作用，更好地治療癌癥。為了進(jìn)一步研究GDNPs的藥理學(xué)作用機(jī)制，本研究對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了分析討論，GDNPs多糖相較于蛋白質(zhì)、皂苷含量最多，可以有效逆轉(zhuǎn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的表型，同時(shí)GDNPs多糖作用巨噬細(xì)胞后的培養(yǎng)基可有效抑制B16F10細(xì)胞的增殖能力。M1型巨噬細(xì)胞主導(dǎo)的免疫微環(huán)境有助于炎癥反應(yīng)，但也可能導(dǎo)致周?chē)】到M織的損傷。此外發(fā)現(xiàn)，GDNPs皂苷能夠調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境，促進(jìn)腫瘤環(huán)境中的巨噬細(xì)胞向抗炎表型極化，可以避免持續(xù)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致組織損傷與功能障礙。綜上，本研究揭示了GDNPs中多糖成分的關(guān)鍵作用，為進(jìn)一步的機(jī)制研究和臨床應(yīng)用提供了有價(jià)值的信息。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探討GDNPs的其他活性成分，以及如何優(yōu)化其在腫瘤治療中的應(yīng)用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Active components of ginseng vesicles regulating tumor immune microenvironment

XIAO Lianlian1, 2, YU Lingjing1, 2, LIU Yipeng1, 2, HU Yang1, 2, ZHANG Yunyu1, 2, JI Jing1, 2, CHENG Jianming1, 2

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Classic Famous Formula Engineering Research Center, Nanjing 210023, China

To explore the potential material basis of ginseng-derived nanoparticles (GDNPs) in regulating tumor-associated macrophage phenotype and inhibiting melanoma growth.GDNPs and their major components (proteins, polysaccharides and saponins) were comprehensively characterized using nanoparticle tracking analyzer, transmission electron microscopy test and UV-Vis spectrophotometry. The regulatory effects of GDNPs and their polysaccharide and saponin components on the phenotype of bone marrow-derived macrophages (BMDM) were examined by qRT-PCR and flow cytometry experiments. B16F10 cells were incubated in BMDM conditioned medium (CM) with different degrees of polarization, and the viability of B16F10 cells was determined by CCK-8 assay to verify the modulation of the tumor immune microenvironment by the active ingredients. The active ingredient composition of GDNPs was quantified by PMP pre-column derivatization.The morphology and structure of GDNPs were well observed under transmission electron microscopy. 2.46 × 1011particles of GDNPs contained 4.31 mg of protein, 4.46 mg of polysaccharides, and 1.22 mg of saponins. qRT-PCR and flow cytometry experiments showed that the polysaccharide group of GDNPs reversed the phenotype of the M2-type macrophage cells, which were polarized toward M1. GDNPs polysaccharides induced macrophage polarization after CM significantly inhibited the viability of B16F10 cells. PMP pre-column derivatization analysis of the polysaccharide components of GDNPs consisted of glucose, galactose, arabinose, and the substance amount ratio was 4.72∶1.07∶2.15.The experimental results reveal the key role of the polysaccharide components of GDNPs in the modulation of the tumor immune microenvironment, and provide the experimental basis for further mechanism study and clinical application.

ginseng extracellular vesicles; tumor immune microenvironment; macrophage polarization; polysaccharides; glucose; galactose; arabinose

R285.5

A

0253 - 2670(2024)09 - 3006 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.015

2023-10-18

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81803391）

肖蓮蓮，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹扑幖夹g(shù)與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。E-mail: 20210939@njucm.edu.cn

通信作者：程建明，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥新劑型、新技術(shù)研究及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。E-mail: 320320@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]