王偉艷，劉 珊，李會芳，常銀霞，欒智華，蘇越蕊，魏硯明*

?藥理與臨床?

基于谷胱甘肽/谷胱甘肽過氧化物酶4軸探討雷公藤甲素引起肝細胞鐵死亡的作用機制

王偉艷1，劉 珊1，李會芳1，常銀霞1，欒智華2，蘇越蕊1，魏硯明1*

1. 山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院，山西 晉中 030619 2. 山西中醫(yī)藥大學實驗管理中心，山西 晉中 030619

觀察雷公藤甲素對鐵代謝和脂質(zhì)過氧化的影響，探討雷公藤甲素引起肝細胞鐵死亡的可能機制。利用雷公藤甲素處理人正常肝細胞HL7702和C57BL/6J小鼠，或利用鐵死亡抑制劑（ferrostatin-1，F(xiàn)er-1）和雷公藤甲素共同處理HL7702細胞，CCK-8法檢測細胞存活率；普魯士藍染色觀察鐵沉積；試劑盒檢測鐵離子、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性；qRT-PCR或Western blotting檢測轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、長鏈脂酰輔酶A合成酶4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）的表達。雷公藤甲素顯著降低細胞存活率（＜0.05），引起鐵沉積，升高血清中ALT、AST活性（＜0.05），增加HL7702細胞和小鼠肝組織中鐵離子、MDA含量（＜0.05），降低GSH含量、SOD活性和GPX4表達（＜0.05），上調(diào)TFR1、PTGS2及ACSL4表達（＜0.05）。Fer-1顯著上調(diào)細胞存活率和GPX4表達量（＜0.05），顯著下調(diào)鐵離子含量、TFR1、PTGS2及ACSL4表達（＜0.05）。雷公藤甲素可能通過GSH/GPX4軸引起鐵代謝異常和脂質(zhì)過氧化，誘導肝細胞鐵死亡。

雷公藤甲素；鐵死亡；肝細胞毒性；鐵超載；脂質(zhì)過氧化；谷胱甘肽/谷胱甘肽過氧化物酶4軸

雷公藤作為傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、祛風通絡、舒筋活血、消腫止痛、殺蟲止血等作用，臨床上對于類風濕性關節(jié)炎、腎病綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及自身免疫性肝炎等疾病具有獨特療效，然而其嚴重的肝臟毒性制約了臨床應用[1]。作為一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物，雷公藤甲素是雷公藤的主要藥理活性成分之一，亦是引起肝臟毒性反應的主要物質(zhì)基礎[2]。雷公藤甲素可導致斑馬魚、小鼠及大鼠肝細胞水樣變性、核萎縮，肝組織結構紊亂，出現(xiàn)灶狀壞死、炎性細胞浸潤、血清轉氨酶活性升高、膽汁淤積等癥狀[3]。體外條件下，雷公藤甲素可降低肝巨噬細胞、肝癌細胞和正常肝細胞活力，引起肝細胞死亡[4-5]。研究表明，雷公藤甲素導致肝損傷主要涉及氧化應激、細胞色素P450超家族代謝異常、細胞凋亡、細胞自噬、免疫穩(wěn)態(tài)失衡、腸道菌群失調(diào)等多種機制[6]。

鐵死亡是一種新型調(diào)節(jié)性細胞死亡形式，其特征是鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化引發(fā)的細胞膜氧化損傷，主要表現(xiàn)為細胞膜外膜起泡破裂、線粒體膜密度增加、嵴密度減少或消失等[7]。鐵死亡參與了多種疾病的病理發(fā)生過程，如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、急性腎衰竭、心臟缺血再灌注等[8]。多種藥物引起的肝毒性也與其干擾鐵離子代謝過程導致鐵死亡密切相關。解熱鎮(zhèn)痛藥對乙酰氨基酚可減低體外培養(yǎng)原代小鼠肝細胞中抗氧化物谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，抑制谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）表達，而鐵死亡抑制劑（ferrostatin-1，F(xiàn)er-1）則能夠明顯降低對乙酰氨基酚的肝細胞毒性作用，提高細胞存活率[9]；體內(nèi)條件下，F(xiàn)er-1可改善小鼠肝組織中鐵代謝紊亂，抑制鐵死亡相關基因長鏈脂酰輔酶A合成酶4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，）和前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，）的高表達，減輕對乙酰氨基酚引起的小鼠肝組織損傷[10]。川楝素在激活蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）-真核起始因子2α亞基（eukaryotic initiation factor 2α subunit，eIF2α）-激活轉錄因子4（activation transcription factor 4，ATF4）信號通路，引起ATF3介導的轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）表達上調(diào)的同時，可明顯抑制鐵輸出蛋白溶質(zhì)載體家族40成員1（solute carrier family 40 member 1，SLC40A1）的表達，導致肝細胞內(nèi)鐵超載，并通過下調(diào)GPX4的表達，引起肝細胞鐵死亡[11]。雷公藤甲素可呈劑量相關性地引起鐵離子聚集，導致大鼠肝組織損傷，表明鐵死亡可能是雷公藤甲素導致肝損傷的關鍵機制[12]。然而，目前對于雷公藤甲素調(diào)節(jié)肝細胞鐵死亡的作用途徑及鐵死亡在雷公藤甲素肝毒性中的功能仍有待闡明。

本研究擬在體外和體內(nèi)條件下觀察雷公藤甲素對肝細胞鐵代謝和脂質(zhì)過氧化的影響，探討雷公藤甲素對鐵死亡的調(diào)控途徑，以期為揭示雷公藤甲素肝毒性的作用機制，尋找抑制雷公藤甲素肝毒性的作用靶點提供線索。

1 材料

1.1 細胞及動物

人源正常肝細胞HL7702購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司。SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量16～18 g，6周齡，購自北京斯貝福生物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。小鼠飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學SPF級動物房，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度55%～65%，自由進食飲水，適應性喂養(yǎng)7 d。動物實驗經(jīng)山西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（批準號2021DW207）。

1.2 藥品與試劑

雷公藤甲素（質(zhì)量分數(shù)＞98%，批號230903）購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；鐵死亡抑制劑Fer-1（批號149105）購自美國MedChemExpress公司；RPMI 1640完全培養(yǎng)基（批號2305002）、PBS稀釋液（批號20230517JH）、胰酶（批號2305002）、普魯士藍染色試劑盒（批號20220316）、BCA蛋白濃度試劑盒（批號2307001）購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒（批號MA0218-2-Mar-29H）、飛克特超敏ECL發(fā)光液（批號MA0186-Apr-041）購自大連美侖生物技術有限公司；鐵離子含量檢測試劑盒（批號20220321）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號20231020）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號20231018）、GSH檢測試劑盒（批號20231016）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測試劑盒（批號C009-2-1）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號C010-2-1）購自南京建成生物工程研究所；胎牛血清（批號J825FC0251）、Trizol試劑（批號G921KA7072）、HRP標記的山羊抗兔二抗（批號J804AA0007）購自上海生工生物工程公司；MonScriptTM RTIII AII-in-One Mix試劑盒（批號140713）、MonAmpTM ChemoHS qPCR Mix試劑盒（批號00007547-110721）均購自莫納生物科技有限公司；GPX4抗體（批號10026631）、ACSL4抗體（批號00108861）、PTGS2抗體（批號00104008）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；TFR1抗體（AF8136）、蛋白酶抑制劑（批號CR2303056）、RIPA蛋白裂解液（批號011921210824）、HRP標記的山羊抗小鼠二抗（批號090523231228）購自上海碧云天生物技術有限公司；β-actin抗體（批號AC220227004）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器

Galaxy 170s型CO2培養(yǎng)箱（德國Eppendorf公司）；Multiskan FC型酶標儀（美國Thermo公司）；QuickDrop微量紫外分光光度計（美國Molecular Devices公司）；Powercycler 普通PCR儀（英國Analylik Jena公司）；Archimed X4型實時熒光定量PCR儀（北京鯤鵬基因科技有限責任公司）；ImageQuant LAS 500型化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國GE公司）；Allegra X-30R型臺式冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）；DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40DN型轉印槽、DYY-7C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

HL7702細胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細胞實驗分組和處理

取對數(shù)生長期的HL7702細胞，以1.5×105個/孔接種于96孔板或以3×106個/mL接種于6孔板中，加入25、50、100 nmol/L的雷公藤甲素，處理細胞24 h，或者加入50 nmol/L雷公藤甲素處理12、24、48 h，同時設置對照組（加入不含藥物的培養(yǎng)基），采用CCK-8法檢測細胞存活率，利用鐵離子含量檢測試劑盒測定鐵離子含量，普魯士藍染色觀察鐵沉積情況，qRT-PCR檢測、和mRNA表達，Western blotting檢測TFR1、GPX4、PTGS2和ACSL4蛋白表達，試劑盒檢測GSH、MDA含量和SOD活性。

取對數(shù)生長期的HL7702細胞，以1.5×105個/孔接種于96孔板或以3×106個/mL接種于6孔板中，設置對照組（加入不含藥物的培養(yǎng)基）、雷公藤甲素組、Fer-1組、雷公藤甲素＋Fer-1組，用Fer-1（2 μmol/L）預處理細胞24 h后，再用50 nmol/L的雷公藤甲素處理細胞24 h。采用CCK-8法檢測細胞存活率，利用鐵離子含量檢測試劑盒測定鐵離子含量，Western blotting檢測TFR1、GPX4、PTGS2和ACSL4蛋白表達。

2.3 CCK-8檢測細胞存活率

為了觀察雷公藤甲素不同濃度和不同處理時間對細胞存活率的影響，按“2.2”項下方法處理細胞，按照CCK-8試劑盒說明書測定各孔吸光度（）值，并計算細胞存活率。

細胞存活率＝(給藥－空白)/(對照－空白)

2.4 普魯士藍染色觀察鐵沉積情況

按“2.2”項下方法處理細胞，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用Perls染色液染色30 min，充分沖洗，再用伊紅染色液染色15 s，封片，光學顯微鏡下觀察鐵沉積。參照文獻方法[13]用Image J軟件分析普魯士藍染色藍色區(qū)域面積占總面積的百分比。

2.5 鐵離子、GSH、MDA含量及SOD活性測定

按“2.2”項下方法處理細胞，按照試劑盒說明書分別測定鐵離子、GSH、MDA含量和SOD活性。

2.6 qRT-PCR檢測TFR1、PTGS2和ACSL4 mRNA表達

按“2.2”項下方法處理細胞，按照試劑盒說明書提取細胞總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western blotting檢測TFR1、GPX4、PTGS2和ACSL4蛋白表達。

按“2.2”項下方法處理細胞，經(jīng)PBS漂洗后，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解15 min后，23號針頭反復吹打破碎細胞，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。將上清液與SDS上樣緩沖液混勻，95 ℃加熱5 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉的TBST，室溫封閉1 h，按照1∶1 000的稀釋比例分別加入TFR1、GPX4、PTGS2、ACSL4及β-actin一抗，4 ℃孵育過夜后，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。采用ECL化學發(fā)光試劑盒在化學發(fā)光成像系統(tǒng)下進行曝光，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件定量目的條帶。

2.8 動物實驗分組、給藥及指標檢測

C57BL/6J小鼠隨機分為對照組和雷公藤甲素（0.8 mg/kg）[2,14]組，每組10只，雷公藤甲素組ip雷公藤甲素，對照組ip等體積的生理鹽水，每隔2天注射1次，連續(xù)注射3次，末次給藥24 h后，眼眶取血，分離血清，按照試劑盒說明書檢測血清中ALT、AST、SOD活性和鐵離子、GSH、MDA含量。取相同部位的肝臟，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片經(jīng)脫蠟、蘇木素-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)變化。qRT-PCR檢測肝組織、和mRNA表達，Western blotting檢測肝組織TFR1、GPX4、PTGS2和ACSL4蛋白表達。

2.9 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 雷公藤甲素抑制HL7702細胞存活率

HL7702細胞經(jīng)25、50、100 nmol/L的雷公藤甲素處理24 h后，隨著給藥濃度升高，細胞存活率逐漸下降（＜0.05，圖1-A）。HL7702細胞經(jīng)50 nmol/L雷公藤甲素處理12、24、48 h后，細胞存活率隨著給藥時間延長逐漸降低（＜0.05，圖1-B）。

3.2 雷公藤甲素引起HL7702細胞鐵超載

鐵代謝紊亂是鐵死亡發(fā)生的必要條件[15]。TFR1作為鐵代謝過程中關鍵的細胞表面受體，通過內(nèi)吞作用負責鐵離子的攝取[16]。HL7702細胞經(jīng)不同濃度雷公藤甲素處理24 h后，隨著給藥濃度升高，細胞內(nèi)鐵離子含量逐漸增加（＜0.05，圖2-A），并且對照組未觀察到明顯的鐵沉積，而雷公藤甲素可使鐵沉積面積明顯增加（圖2-B）。此外，qRT-PCR和Western blotting檢測結果顯示，隨著雷公藤甲素給藥濃度升高，mRNA和蛋白表達量較對照組顯著增加（＜0.05，圖2-C、D）。

與對照組或0 h比較：*P＜0.05，圖2～4、6同。

圖2 雷公藤甲素對HL7702細胞中鐵離子含量(A)、鐵沉積(B，×200) 和TFR1表達(C、D) 的影響(, n = 3)

3.3 雷公藤甲素引起HL7702細胞中脂質(zhì)過氧化損傷

脂質(zhì)過氧化損傷作為鐵死亡的主要特征之一，是鐵死亡檢測的重要指標。GSH和SOD是體內(nèi)關鍵的抗氧化劑，MDA作為脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)物，可以間接反映過氧化損傷程度[8]。HL7702細胞經(jīng)不同濃度雷公藤甲素處理24 h后，雷公藤甲素可顯著降低GSH的含量，抑制SOD活性，提高MDA含量，且呈現(xiàn)濃度相關性（＜0.05，圖3）。

3.4 雷公藤甲素對HL7702細胞中鐵死亡相關蛋白表達的影響

GPX4是構成應對脂質(zhì)過氧化防御系統(tǒng)的關鍵抗氧化酶[8]；PTGS2和ACSL4被認為是鐵死亡的生物標志物。PTGS2負責將花生四烯酸代謝為前列腺素，細胞發(fā)生鐵死亡時PTGS2表達明顯上調(diào)[17]。ACSL4是鐵死亡的關鍵調(diào)控因子，可激活花生四烯酸和腎上腺素等多不飽和脂肪酸生成酰基輔酶A，后者進入質(zhì)膜磷脂中促使細胞發(fā)生鐵死亡[18]。HL7702細胞經(jīng)不同濃度雷公藤甲素處理24 h后，雷公藤甲素可顯著抑制GPX4的表達（＜0.05，圖4-A），促進PTGS2和ACSL4表達（＜0.05，圖4-B、C）。

圖3 雷公藤甲素對HL7702細胞GSH、MDA含量和SOD活性的影響(, n = 3)

3.5 Fer-1逆轉雷公藤甲素引起的HL7702細胞鐵死亡

為了觀察Fer-1對雷公藤甲素肝細胞毒性的影響，采用雷公藤甲素與Fer-1共同處理HL7702細胞。結果顯示，與雷公藤甲素組比較，F(xiàn)er-1與雷公藤甲素聯(lián)合處理組細胞存活率和GPX4表達量顯著升高（＜0.05，圖5-A、C），鐵離子含量、TFR1、PTGS2及ACSL4蛋白表達量顯著降低（＜0.05，圖5-B、C）。

圖4 雷公藤甲素對HL7702細胞中GPX4(A)、PTGS2和ACSL4(B、C) 表達的影響(, n = 3)

與對照組比較：*P＜0.05；與雷公藤甲素組比較：#P＜0.05。

3.6 雷公藤甲素引起小鼠肝組織鐵死亡

課題組前期研究與本研究結果均表明，小鼠ip雷公藤甲素后，肝組織結構受損明顯，細胞腫脹、壞死，局部可見炎癥浸潤，血清ALT、AST活性明顯升高[2,14]（＜0.05，圖6-A、B）。體內(nèi)觀察雷公藤甲素對肝細胞鐵死亡的影響，結果顯示，與對照組比較，雷公藤甲素組GSH含量、SOD活性和GPX4表達量顯著降低（＜0.05，圖6-C、F），鐵離子、MDA含量及TFR1、PTGS2、ACSL4表達量顯著升高（＜0.05，圖6-C～F）。

圖6 雷公藤甲素對小鼠肝功能(A)、肝組織病理形態(tài)(B，×200)、氧化損傷指標(C)、鐵離子含量(D) 及鐵死亡相關蛋白表達(E、F) 的影響(, n = 3)

4 討論

本研究中，雷公藤甲素在降低肝細胞活性的同時，能夠明顯提高正常肝細胞和小鼠肝組織中的鐵離子含量，引起鐵代謝紊亂，導致鐵超載，這可能與雷公藤甲素能夠增加TFR1表達有關。TFR1的過量表達可促進鐵離子向細胞內(nèi)轉運，大量的鐵離子則通過芬頓反應產(chǎn)生羥基和氫過氧自由基等大量活性氧，驅動破壞性的過氧化鏈式反應[16]。本研究還觀察到雷公藤甲素可明顯降低肝細胞中GSH含量，抑制SOD活性，下調(diào)GPX4表達量，提高脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，促進肝細胞鐵死亡，導致鐵死亡標記物ACSL4、PTGS2的表達明顯升高。GPX4是一種清除脂質(zhì)過氧化物的關鍵酶，在GSH存在的條件下，將其轉化為氧化型谷胱甘肽并將有毒的脂質(zhì)過氧化物還原為無毒的脂質(zhì)醇以防止鐵死亡的發(fā)生[19]。GPX4失活或表達量下調(diào)可誘導鐵死亡，常作為鐵死亡的參考標記物[20]。Fer-1作為人工合成的自由基捕獲劑，可有效清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，阻斷鐵死亡[21]。體外條件下，F(xiàn)er-1處理可以逆轉雷公藤甲素引起的鐵超載，減輕脂質(zhì)過氧化，明顯緩解雷公藤甲素引起的肝細胞鐵死亡和細胞毒性。因此，雷公藤甲素可能通過GSH/GPX4軸干預鐵代謝和脂質(zhì)過氧化，引起肝細胞鐵死亡，導致細胞活性降低。Fer-1則通過下調(diào)TFR1和上調(diào)GPX4表達抑制鐵死亡。然而，本研究僅在體外條件下觀察了Fer-1對雷公藤甲素肝細胞毒性的改善作用，今后將嘗試利用多種動物模型和包括Fer-1在內(nèi)的不同類型鐵死亡調(diào)節(jié)劑，如RSL3、索拉非尼、Liproxstatin-1、去鐵胺等[22]，進一步驗證鐵死亡對雷公藤甲素肝毒性的調(diào)控效應和作用途徑。

鐵死亡存在高度復雜和精細的調(diào)控網(wǎng)絡，多種信號通路直接或間接影響鐵代謝或脂質(zhì)過氧化影響鐵死亡過程，參與雷公藤甲素藥理作用[6]。溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）作為多通道跨膜蛋白負責將細胞外的胱氨酸和細胞內(nèi)的谷氨酸等比例輸入或輸出，輸入的胱氨酸隨即被還原成半胱氨酸，用于GSH的合成。雷公藤甲素一方面可通過干預心肌細胞鐵離子代謝，導致細胞內(nèi)鐵超載，并抑制抗氧化系統(tǒng)，導致細胞內(nèi)活性氧累積；另一方面，雷公藤甲素直接結合SLC7A11，導致GSH耗竭，從而抑制SLC7A11/GPX4信號軸，最終引起脂質(zhì)過氧化物MDA水平升高，觸發(fā)心肌細胞鐵死亡[23]。雷公藤甲素可抑制體內(nèi)抗氧化反應的主要調(diào)節(jié)因子核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的表達，上調(diào)活性氧和脂質(zhì)過氧化水平，降低GPX4表達，從而促進白血病細胞鐵死亡，克服對阿霉素的耐藥性[24]。另外，雷公藤甲素還可同時抑制Nrf2和SLC7A11表達，引起活性氧聚集和鐵離子超載，與鐵死亡促進劑Erastin共用協(xié)同促進頭頸部腫瘤細胞鐵死亡[25]。納米材料包裹的雷公藤甲素可通過抑制Nrf2表達，導致活性氧累積和GSH耗竭，促進脂質(zhì)過氧化，引起黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞鐵死亡[26-27]。后續(xù)工作將探討上述分子機制或信號通路是否在雷公藤甲素引起肝細胞鐵死亡過程中發(fā)揮作用。

全基因組芯片分析結果顯示，雷公藤甲素可明顯改變氧化應激途徑中多種關鍵基因表達，表明氧化應激與雷公藤甲素藥理作用密切相關[28]。除了肝毒性和心臟毒性外[23]，氧化應激也是雷公藤甲素導致其他多種器官毒性的關鍵機制。雷公藤甲素能夠降低大鼠腎臟中抗氧化酶活性，引起體內(nèi)活性氧累積和脂質(zhì)過氧化物MDA含量異常升高，誘發(fā)腎臟氧化應激損傷[29]。雷公藤甲素可引起卵母細胞線粒體功能障礙，導致活性氧過度累積，降低抗氧化酶活性，影響卵母細胞發(fā)育[30]。雷公藤甲素還可通過破壞雄性生殖系統(tǒng)氧化還原平衡，引起氧化應激，導致睪丸組織損傷[31]。另外，雷公藤甲素能夠通過明顯降低食管癌細胞Nrf2的表達，抑制其進入細胞核與抗氧化反應元件的結合，改變細胞氧化應激水平，促進細胞凋亡[32]。雷公藤甲素可升高鼻咽癌細胞中活性氧水平，誘導氧化應激，從而抑制蛋白激酶B的表達與活化，抑制細胞生長[33]。由于氧化應激引起的脂質(zhì)過氧化是引起鐵死亡的關鍵機制，未來有必要觀察在上述病理生理條件下氧化應激能否引起鐵死亡，以及鐵死亡是否在上述藥理作用中發(fā)揮相似作用。

綜上，本研究觀察了雷公藤甲素對正常肝細胞和小鼠肝組織中鐵死亡途徑相關指標的影響，結果驗證了雷公藤甲素可能通過GSH/GPX4軸引起鐵代謝異常和脂質(zhì)過氧化，誘導肝細胞鐵死亡，抑制鐵死亡則可在體外條件下有效緩解肝細胞毒性，為揭示雷公藤甲素肝毒性的作用機制及鐵死亡作為抑制雷公藤甲素肝毒性的潛在靶點提供了依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of triptolide-induced ferroptosis in liver cells based on glutathione/ glutathione peroxidase 4 axis

WANG Weiyan1, LIU Shan1, LI Huifang1, CHANG Yinxia1, LUAN Zhihua2, SU Yuerui1, WEI Yanming1

1.College of Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China 2.Experimental Management Center, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China

To investigate the effect of triptolide on iron metabolism and lipid peroxidation and evaluate the underlying mechanism of triptolide-induced ferroptosis in hepatic cells.HL7702 cells and C57BL/6J mice were treated with triptolide, or HL7702 cells were co-treated with ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 (Fer-1) and triptolide, and then cell survival rate was detected by CCK-8 method; Iron deposition was detected by Prussian blue staining; Iron, glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA) contents and superoxide dismutase (SOD), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) activities were detected by kit; Transferrin receptor 1 (TFR1), glutathione peroxidase 4 (GPX4), prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), acyl-CoA synthetase long-chain family member 4 (ACSL4) expressions were detected by qRT-PCR or Western blotting.Triptolide significantly decreased cell viability (< 0.05), increased ALT and AST activities in serum (< 0.05), and resulted in iron deposition, increased iron, MDA contents (< 0.05), decreased GSH content, SOD activity and GPX4 expression (< 0.05), and up-regulated TFR1, PTGS2 and ACSL4 expressions in HL7702 cells and liver tissues (< 0.05). Fer-1 significantly reversed the decreased cell viability induced by triptolide, and increased GPX4 expression (< 0.05), as well as down-regulated iron content, TFR1, PTGS2 and ACSL4 expressions (< 0.05).Triptolide may induce iron overload and lipid peroxidation via GSH/GPX4 axis which ultimately leading to ferroptosis in hepatic cells.

triptolide; ferroptosis; hepatotoxicity; iron overload; lipid peroxidation; GSH/GPX4 axis

R285.5

A

0253 - 2670(2024)09 - 2967 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.011

2023-11-20

山西省科技廳基礎研究課題資助項目（202103021224295）；山西中醫(yī)藥大學毒效關系研究創(chuàng)新團隊（2022TD1016）；山西省衛(wèi)生健康委科研課題（2022133）；山西中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新能力培養(yǎng)計劃“基礎研究專項”課題資助項目（2020PY-JC-17）

王偉艷，碩士研究生，研究方向為中藥臨床藥學與藥事管理。E-mail: 1686880829@qq.com

通信作者：魏硯明，副教授，碩士生導師，從事中藥藥理與毒理研究。Tel: (0351)3179717 E-mail: weiyanming2005@aliyun.com

[責任編輯 李亞楠]