劉新穎，王富江，葛海濤*

野黃芩素納米晶體的制備及治療慢性瘙癢模型藥效評(píng)價(jià)

劉新穎1, 2，王富江2*，葛海濤1, 2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023 2. 江蘇蘇中藥業(yè)研究院有限公司，江蘇 南京 210031

制備野黃芩素納米晶體（scutellarein nanocrystals，Scu-NCs），進(jìn)行藥劑學(xué)性質(zhì)研究，并考察其對(duì)小鼠皮膚干燥瘙癢模型的治療效果。采用反溶劑沉淀技術(shù)制備Scu-NCs，并通過(guò)冷凍干燥技術(shù)將其固化成固體粉末；測(cè)定Scu-NCs的平均粒徑、分散系數(shù)、ζ電位并觀(guān)察其微觀(guān)結(jié)構(gòu)；差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）及傅里葉變換紅外光譜法（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析其晶型及化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化；測(cè)試其體外藥物溶出速率和其凝膠劑的體外釋放度；評(píng)價(jià)野黃芩素及Scu-NCs凝膠劑經(jīng)皮給藥對(duì)丙酮/乙醚和水（acetone-ether-water，AEW）誘導(dǎo)的小鼠干皮瘙癢模型的止癢作用。制備得到的Scu-NCs平均粒徑為（379.1±1.7）nm，多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）值為0.238±0.081，ζ電位為（25.50±0.25）mV；野黃芩素納米化后野黃芩素的晶型和化學(xué)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化；Scu-NCs冷凍干燥后粒徑無(wú)明顯變化；野黃芩素納米化后提高了藥物2 h內(nèi)的溶出速率、溶出度及Scu-NCs凝膠劑6 h內(nèi)的體外釋放度；與AEW模型組相比，野黃芩素、Scu-NCs凝膠劑給藥組可明顯降低小鼠1 h內(nèi)抓撓次數(shù)，抑制頸背部表皮增厚及皮膚中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達(dá)，且Scu-NCs對(duì)AEW模型抑制效果更明顯。Scu-NCs粒徑較小且均勻，其納米化后晶型和化學(xué)結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生明顯改變；將野黃芩素制備成納米晶體后，可明顯改善藥物的溶出度與體外釋放度，對(duì)皮膚局部慢性瘙癢具有更好的治療效果。

野黃芩素；納米晶體；凝膠；慢性瘙癢；外用制劑；反溶劑沉淀技術(shù)；冷凍干燥技術(shù)；白細(xì)胞介素；腫瘤壞死因子-α

黃芩是一種被廣泛應(yīng)用于呼吸道感染、肝臟炎癥、皮膚特別是上皮組織炎癥性疾病的傳統(tǒng)中藥[1]。野黃芩素是黃芩Georgi中的主要黃酮類(lèi)化合物之一，此外，野黃芩素也富含于治療皮膚炎癥性疾病的傳統(tǒng)中藥燈盞細(xì)辛(Vant.) -Mazz.和木蝴蝶(L.) Vent中[2-3]，因此推測(cè)野黃芩素對(duì)皮膚炎癥及瘙癢具有一定的治療效果。但是，野黃芩素水溶性差、吸收率低、生物利用度極低[4-5]，因此限制了其在經(jīng)皮給藥領(lǐng)域的應(yīng)用。劑型研究發(fā)現(xiàn)，納米混懸液（又稱(chēng)納米晶體、納米結(jié)晶）載藥量高、生物相容性好，可改善難溶性藥物的溶解度和生物利用度[6-7]。

慢性瘙癢是皮膚科疾病最常見(jiàn)的臨床癥狀，常與特應(yīng)性皮炎等病理性干燥皮膚病和腎病等系統(tǒng)性疾病有關(guān)，目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，且缺乏便捷有效的治療方法[8-10]。通過(guò)對(duì)小鼠采用丙酮/乙醚和水（acetone/ethyl ether and water，AEW）貫序涂抹的實(shí)驗(yàn)方法，可破壞皮膚屏障、增加經(jīng)皮水分損失，引起皮膚干燥、瘙癢，這也是目前研究慢性瘙癢疾病比較經(jīng)典的模型之一[11-12]。

本研究采用反溶劑沉淀技術(shù)制備野黃芩素納米晶體（scutellarein nanocrystals，Scu-NCs）混懸液[13]，將其冷凍干燥形成固體粉末后作為制劑中間體，并進(jìn)行凝膠化，并考察Scu-NCs對(duì)小鼠AEW模型的治療效果。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

Scientz-10N/D?80 ℃型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Talos F200X G2型透射電子顯微鏡（TEM）、Vanquish Core型高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技公司；RYJ-12B型智能透皮儀，上海黃海藥檢儀器有限公司；Nano-ZS型納米激光粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；TGL-16c型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；ZKT-18F型智能溶出儀，上海富科思分析儀器有限公司；RT-6100型酶標(biāo)分析儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；Q2000型差示掃描量熱儀，美國(guó)TA儀器公司；Alpha II型傅里葉紅外光譜儀，北京布魯克科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

野黃芩素原料藥，批號(hào)047-09-20，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.7%，江蘇蘇中藥業(yè)研究院有限公司；卡泊三醇倍他米松軟膏（calcipotriol betamethasone，Cal B），批號(hào)C81922，愛(ài)爾蘭利奧制藥有限公司；泊洛沙姆（Poloxamer 188，P188，批號(hào)N20220205）、聚山梨酯80（Tween-80，T80，批號(hào)20210904-01），南京威爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），批號(hào)C2131028，阿拉丁試劑（上海）有限公司；大豆卵磷脂，批號(hào)202206041，上海太偉藥業(yè)股份有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone K30，PVP K30），批號(hào)210601，安徽山河藥用輔料有限公司；,-二甲基甲酰胺（,-dimethylformamide，DMF，批號(hào)K95760602）、甲醇（批號(hào)L121907224），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；無(wú)水乙醚（批號(hào)20220630）、丙酮（批號(hào)20180606），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；羥丙甲基纖維素（hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC），批號(hào)PDR504180，卡樂(lè)康包衣技術(shù)（上海）有限公司。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠50只，6周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司；生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)生物制藥有限公司動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度50%～80%，所有動(dòng)物均正常飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。本研究經(jīng)過(guò)江蘇蘇中生物制藥有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審查批號(hào)為SZSW-2023050901。

2 方法與結(jié)果

2.1 Scu-NCs凍干粉的制備

采用反溶劑沉淀技術(shù)制備Scu-NCs。精密稱(chēng)取處方量的野黃芩素原料藥于燒杯中，加入一定質(zhì)量的DMF充分溶解，另外稱(chēng)取處方量的卵磷脂加入到同一燒杯中，加入一定質(zhì)量的甲醇充分溶解卵磷脂，取完全溶解的SCU和卵磷脂混合溶液過(guò)0.22mm濾膜，作為有機(jī)相；取處方量的穩(wěn)定劑溶解于純水中，充分溶脹后過(guò)0.22mm濾膜，作為水相。將18 mL水相置于冰水浴中，在超聲的條件下，將2 mL有機(jī)相勻速滴入水相中，加入過(guò)程中持續(xù)攪拌，超聲頻率為40 kHz，超聲時(shí)間為2 min，即得到Scu-NCs混懸液。

取上述Scu-NCs混懸液，于?80 ℃冷凍干燥機(jī)中預(yù)凍12 h后，繼續(xù)減壓干燥48 h，即得到Scu-NCs凍干粉。

2.2 Scu-NCs制備條件優(yōu)化

2.2.1 穩(wěn)定劑種類(lèi)篩選 在“2.1”項(xiàng)工藝條件下，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的穩(wěn)定劑（Poloxamer 188、HPMC、SDS、Tween-80、PVP K30）引入水相，單因素考察不同穩(wěn)定劑對(duì)納米晶體粒徑及多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）的影響，篩選納米晶體制備時(shí)所用穩(wěn)定劑種類(lèi)。穩(wěn)定劑種類(lèi)篩選結(jié)果見(jiàn)表1，當(dāng)選用穩(wěn)定劑為Poloxamer 188時(shí)，所制得Scu-NCs平均粒徑較?。郏?01.3±1.4）nm］的同時(shí)PDI值較低（0.265±0.016）。

2.2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化處方 結(jié)合穩(wěn)定劑種類(lèi)篩選結(jié)果與預(yù)實(shí)驗(yàn)中納米晶體制備過(guò)程中對(duì)粒徑影響較大因素，以水相中穩(wěn)定劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B），有機(jī)相中野黃芩素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、卵磷脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C），有機(jī)相中DMF與甲醇（DMF/甲醇）的體積比（D）為4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，以平均粒徑為篩選指標(biāo)，按L9(34)正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行Scu-NCs制備處方篩選。正交試驗(yàn)因素與水平及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 穩(wěn)定劑種類(lèi)對(duì)Scu-NCs的粒徑、PDI的影響(, n = 3)

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

0.05(2, 2)＝19.000.01(2, 2)＝99.00。

根據(jù)表2中極差值可知，各因素對(duì)Scu-NCs平均粒徑影響的順序?yàn)锳＞B＞C＞D，說(shuō)明有機(jī)相中野黃芩素質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Scu-NCs粒徑影響最大。根據(jù)考察指標(biāo)平均粒徑，選擇平均粒徑小的處方，即A1B2C1D1，正交試驗(yàn)所得最佳工藝參數(shù)為水相中P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 mg/g，有機(jī)相中野黃芩素、卵磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 mg/g，有機(jī)相中DMF/甲醇比例為1∶5。

2.2.3 處方工藝驗(yàn)證 采用“2.2.2”項(xiàng)下確定的處方制備Scu-NCs混懸液及凍干粉各3批，分別將新制備的Scu-NCs混懸液及復(fù)溶后的Scu-NCs凍干粉稀釋10倍，使用激光粒度儀測(cè)定平均粒徑，分散系數(shù)及ζ電位。測(cè)定參數(shù)：室溫；水折光率1.33；野黃芩素折光率1.59。由檢測(cè)結(jié)果可知，Scu-NCs混懸液凍干前后平均粒徑及分散系數(shù)變化不大，多分散系數(shù)均＜0.30，表明Scu-NCs粒度分布較窄，分散性良好，黏附和聚集情況較少[14]；Scu-NCs混懸液凍干后ζ電位變小，但均＞20 mV，表明Scu-NCs穩(wěn)定性較好[15]。粒徑、PDI、ζ電位檢測(cè)結(jié)果顯示，3批Scu-NCs混懸液及凍干粉制備處方工藝穩(wěn)定，重復(fù)性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Scu-NCs混懸液及凍干粉粒徑、分散系數(shù)及ζ電位(, n = 3)

2.3 外觀(guān)形態(tài)觀(guān)察

將1滴Scu-NCs懸浮液滴加在銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸染色2 min，在TEM下觀(guān)察Scu-NCs的大小和形態(tài)。由圖1可知，Scu-NCs呈棒狀規(guī)則晶體形態(tài)，分散性良好，其粒徑相比于野黃芩素原料藥顯著減小，在300～500 nm。

2.4 晶形及結(jié)構(gòu)

2.4.1 差示掃描量熱分析（differential scanning calorimetry，DSC） 將野黃芩素、Scu-NCs、空白輔料及處方量比例的野黃芩素、泊洛沙姆、卵磷脂物理混合物用差示掃描量熱儀分別測(cè)定其吸熱峰。測(cè)定條件：參比物Al2O3；氣氛：N2；升溫程序：初溫25 ℃，終溫280 ℃，升溫速率10 ℃/min。DSC圖譜見(jiàn)圖2，由圖可知，野黃芩素原料藥無(wú)明顯峰，空白輔料在50 ℃左右有1個(gè)吸熱峰，野黃芩素物理混合物及Scu-NCs除50 ℃左右空白輔料吸熱峰外無(wú)特別明顯的峰。結(jié)果表明，野黃芩素納米晶體化后晶型沒(méi)有發(fā)生明顯變化，仍以晶體形式存在。

圖1 野黃芩素原料藥(a) 和Scu-NCs (b) 的微觀(guān)形貌

圖2 野黃芩素、Scu-NCs、野黃芩素物理混合物及空白輔料DSC圖譜

2.4.2 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析 將野黃芩素和Scu-NCs壓片后分別用紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)定。取少量待測(cè)樣品，碾碎后加入溴化鉀（KBr）混合均勻、研磨后壓片。紅外光譜測(cè)定掃描范圍4 000～500 cm?1。分別對(duì)野黃芩素、Scu-NCs進(jìn)行紅外光譜分析，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，Scu-NCs的酚羥基（OH伸縮振動(dòng)峰，3 294.10、2 888.74、2 360.13 cm?1）發(fā)生了一定程度的藍(lán)移，推測(cè)是由于Scu-NCs形成過(guò)稱(chēng)中，野黃芩素與輔料分子之間形成氫鍵作用。此外，Scu-NCs相較野黃芩素其他特征峰的峰形和位置基本相似，說(shuō)明野黃芩素納米化后化學(xué)結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生明顯改變。

2.5 溶出度考察

2.5.1 野黃芩素含量測(cè)定方法

（1）色譜條件：Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5mm）；流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽水溶液（pH 3.0的0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液）（25∶75）；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)336 nm；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣體積20mL。

圖3 野黃芩素、Scu-NCs的FTIR圖

（2）線(xiàn)性關(guān)系考察：精密稱(chēng)取野黃芩素對(duì)照品20 mg于量瓶中，加入甲醇超聲溶解后定容搖勻，用甲醇將對(duì)照品溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為12、16、20、24、28mg/mL的系列梯度溶液。精密稱(chēng)取上述不同質(zhì)量濃度梯度溶液，HPLC測(cè)定含量，以峰面積（）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（）為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程＝0.960 8－0.338 1，＝0.999 7，線(xiàn)性范圍為12～28mg/mL。

2.5.2 溶出度檢測(cè)方法 分別稱(chēng)取Scu-NCs凍干粉與相同處方物理混合物，選擇槳法評(píng)價(jià)其體外溶出行為[16]，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溶出介質(zhì)為含SDS濃度為10 mg/mL的pH 6.8磷酸鹽水溶液，溶出體積為900 mL，溫度為（37.0±0.5）℃。分別于第5、15、30、45、60、90、120分鐘取10 mL溶出介質(zhì)，同時(shí)補(bǔ)充等體積等溫度空白介質(zhì)。取樣后用0.22mm濾膜濾過(guò)，用HPLC法計(jì)算藥物溶出度，繪制溶出度-時(shí)間曲線(xiàn)。結(jié)果如圖4所示，與野黃芩素相比，Scu-NCs溶出速率顯著增加，2 h內(nèi)溶出度顯著增加。Scu-NCs在5 min時(shí)累積溶出度達(dá)到72.50%，15 min時(shí)累積溶出度達(dá)到83.89%，而野黃芩素原料藥5、15 min累積溶出度分別為10.39%、21.84%。120 min時(shí)野黃芩素原料藥累積溶出度只有30.50%，而Scu-NCs可達(dá)到85.64%，是野黃芩素原料的2.8倍。結(jié)果表明，野黃芩素制備成納米晶體可明顯改善藥物的溶出度，提高藥物溶出速率。

2.6 野黃芩素凝膠的制備

2.6.1 Scu-NCs凝膠及野黃芩素凝膠制備 稱(chēng)取0.3%的卡波姆于適量純化水溶脹24 h，稱(chēng)取不同濃度的Scu-NCs及野黃芩素于適量純化水中分散均勻后加入到溶脹后的卡波姆中，加入8%丙二醇、0.3%三乙醇胺、10%甘油、0.1%羥苯甲酯及處方量純化水后攪拌均勻，即得到野黃芩素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10、20、40 mg/g的Scu-NCs凝膠和野黃芩素凝膠。

圖4 野黃芩素物理混合物和Scu-NCs溶出曲線(xiàn)(, n = 6)

2.6.2 體外釋放度考察 使用Franz擴(kuò)散池在35 ℃條件下考察野黃芩素、Scu-NCs凝膠劑及Scu-NCs純水混懸液通過(guò)尼龍膜（0.22mm）的體外釋放度[16]。擴(kuò)散面積為2.2 cm2，接收池體積為8.0 mL，使用pH 6.8磷酸鹽水溶液/PEG400（體積比1∶1）的混合物作為滲透介質(zhì)，磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為500 r/min。精密稱(chēng)取野黃芩素及Scu-NCs制備的凝膠劑200 mg涂敷于尼龍膜上，于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后1、2、3、4、5、6 h于接收池中取樣150mL，并同時(shí)補(bǔ)充等體積等溫度空白介質(zhì)。用HPLC法計(jì)算藥物釋放度，繪制累積釋放度曲線(xiàn)。圖5顯示了3種制劑6 h內(nèi)體外釋放曲線(xiàn)，Scu-NCs混懸液組體外釋放速度于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始2 h內(nèi)較快，3 h左右變得緩慢；Scu-NCs凝膠組體外釋放速度1～6 h內(nèi)較均勻；Scu-NCs混懸液及Scu-NCs凝膠劑實(shí)驗(yàn)6 h內(nèi)累積釋放度分別為162.38、152.46mg/cm2，而野黃芩素凝膠劑滲透非常緩慢，6 h內(nèi)累積釋放度為0.94mg/cm2。結(jié)果表明，未經(jīng)處理過(guò)的野黃芩素粗粉體外釋放效率低，藥物納米結(jié)晶化可增加藥物體外釋放度，Scu-NCs凝膠化有助于延緩藥物的釋放，起到緩釋作用。

2.7 藥效考察

2.7.1 動(dòng)物分組、建立模型與給藥 50只BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，空白凝膠組，陽(yáng)性藥組，野黃芩素凝膠1%、2%、4%劑量組，Scu-NCs凝膠1%、2%、4%劑量組，每組5只。實(shí)驗(yàn)前2 d剃除小鼠頸背部約2 cm×3 cm面積區(qū)域毛發(fā)。空白組除外，其余各組于每天8:00時(shí)和16:00時(shí)用浸泡過(guò)丙酮乙醚混合液（acetone and ethyl ether，AE，丙酮-乙醚1∶1）的棉片于小鼠剃毛區(qū)域涂敷15 s，再使用浸泡過(guò)超純水的面片于同一部位涂敷30 s，空白組小鼠使用純水進(jìn)行處理，每天2次，連續(xù)7 d[17]；下午造膜處理90 min后，各劑量給藥組分別給予含量1%、2%、4%野黃芩素凝膠及野黃芩素納米結(jié)晶凝膠60 mg，陽(yáng)性藥組給予卡泊三醇倍他米松軟膏60 mg，空白凝膠組給予空白凝膠60 mg，空白組使用純水涂抹小鼠皮膚，連續(xù)處理7 d。

圖5 野黃芩素、Scu-NCs凝膠劑及Scu-NCs混懸液體外滲透曲線(xiàn)(, n = 6)

2.7.2 各組小鼠背部皮膚觀(guān)察 各組小鼠實(shí)驗(yàn)第7天造模及給藥區(qū)域皮膚皮損情況見(jiàn)圖6，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組小鼠背部皮膚較光滑，AEW組及空白凝膠組相較于空白對(duì)照組出現(xiàn)嚴(yán)重的皮膚干燥、結(jié)痂、鱗屑，陽(yáng)性藥及各給藥組較模型組皮損情況有所減輕，相較于各濃度野黃芩素凝膠組，陽(yáng)性藥組及1%、2%、4% Scu-NCs凝膠組皮膚結(jié)痂及鱗屑較少。

圖6 實(shí)驗(yàn)第7天各組小鼠背部皮膚情況

2.7.3 小鼠瘙癢行為學(xué)觀(guān)察 通過(guò)小鼠1 h內(nèi)抓撓行為次數(shù)的對(duì)比來(lái)評(píng)價(jià)瘙癢的嚴(yán)重程度。實(shí)驗(yàn)第7天上午10:00時(shí)，將各只小鼠單獨(dú)放置于透明觀(guān)察籠內(nèi)，等待20 min讓小鼠適應(yīng)陌生環(huán)境。通過(guò)攝像記錄小鼠1 h內(nèi)的抓撓行為，由不知情人員統(tǒng)計(jì)小鼠的抓撓次數(shù)。一次抓撓行為指的是小鼠抬起后爪抓撓頸背部造膜及給藥部位的一次或多次動(dòng)作，前爪及后爪對(duì)其他部位的抓撓動(dòng)作不計(jì)。小鼠1 h內(nèi)抓撓次數(shù)，如表5所示，與空白對(duì)照組相比，AEW模型組及空白凝膠組由瘙癢引起的抓撓行為顯著增加（＜0.001）。相較于AEW模型組，陽(yáng)性藥組及低、中、高劑量野黃芩素、Scu-NCs凝膠組由瘙癢引起的抓撓行為顯著減少（＜0.001）。進(jìn)一步比較相同濃度Scu-NCs凝膠組與野黃芩素凝膠組小鼠，1 h內(nèi)Scu-NCs凝膠組抓撓次數(shù)明顯減少。

表5 小鼠抓撓行為學(xué)觀(guān)察(, n = 5)

與空白組比較：###＜0.001；與模型組比較：***＜0.001；Scu-NCs組與相同濃度野黃芩素組比較：D＜0.05。

###< 0.001blank group;***< 0.001model group;D< 0.05the same concentration of scutellarein in the Scu-NCs group.

2.7.4 皮膚組織病理檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第8天，頸椎脫臼法處死各組小鼠，取小鼠頸背部造膜區(qū)域皮膚，10%福爾馬林溶液固定48 h以上，常規(guī)脫水處理、石蠟包埋并進(jìn)行3mm切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察皮膚組織病理變化，拍照后應(yīng)用Image J軟件分析表皮厚度。由圖7可知，空白組小鼠背部皮膚結(jié)構(gòu)較完整，角質(zhì)層、表皮層無(wú)增厚，表皮平坦，真皮層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少；模型組出現(xiàn)了明顯的表皮層增厚，角質(zhì)層廣泛角化過(guò)度及角化不全，表皮不平坦，呈波浪狀起伏，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多現(xiàn)象；各給藥組表皮層增厚現(xiàn)象減輕，表皮較平坦，除低劑量給藥組，其余給藥組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。

表皮厚度的增加是AEW模型成功的標(biāo)志。由表6可知，AEW、blank gel、1%野黃芩素、2%野黃芩素組與空白對(duì)照組表皮厚度相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.05、0.01、0.001），其余各組與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與野黃芩素組相比，相同濃度下Scu-NCs組表皮厚度較小但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；濃度為1% Scu-NCs組與濃度為4%野黃芩素組表皮厚度相當(dāng)；在濃度為4%時(shí)，Scu-NCs組表皮厚度小于陽(yáng)性對(duì)照組。這表明，野黃芩素原料藥制成納米晶體后藥效更好，與陽(yáng)性對(duì)照藥相當(dāng)。

圖7 小鼠頸背部皮膚病理學(xué)切片(HE, ×200)

表6 小鼠頸背部皮膚表皮厚度統(tǒng)計(jì)(, n = 5)

與空白組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001；與模型組比較：***＜0.001。

#< 0.05##< 0.01###< 0.001blank group;***< 0.001model group.

2.7.5 炎癥因子水平檢測(cè) 取適量小鼠頸背部造膜區(qū)域皮膚制成勻漿，2 000～3 000 r/min離心取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各組小鼠背皮中IL-6、IL-1b、TNF-α炎癥因子水平。與空白對(duì)照都相比，AEW模型組炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平顯著升高（＜0.001）；與模型組相比，陽(yáng)性藥組、1%、2%、4%濃度野黃芩素組及Scu-NCs組炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平降低（＜0.05、0.01、0.001）。相同濃度Scu-NCs凝膠組較野黃芩素凝膠組炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)較低（＜0.05、0.01），結(jié)果見(jiàn)表7。相同藥物濃度下，背部皮膚中IL-6表達(dá)水平在Scu-NCs組表達(dá)均低于野黃芩素組，1%低劑量Scu-NCs組IL-6水平甚至低于4%高劑量野黃芩素組。背部皮膚中IL-1β表達(dá)水平在Scu-NCs組表達(dá)均低于野黃芩素組，4% Scu-NCs組甚至低于陽(yáng)性對(duì)照組。背部皮膚中TNF-α表達(dá)水平在Scu-NCs組表達(dá)均低于野黃芩素組，1%低劑量Scu-NCs組TNF-α表達(dá)水平甚至低于4%高劑量野黃芩素組，4% Scu-NCs組低于陽(yáng)性藥組與空白對(duì)照組。這表明，野黃芩素納米晶體對(duì)炎癥因子的降低具有更好的效果。

表7 各組小鼠頸背部皮膚炎癥因子表達(dá)水平(, n = 5)

與空白組比較：###＜0.001；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；Scu-NCs組與相同濃度野黃芩素組比較：D＜0.05DD＜0.01。

###< 0.001blank group;*< 0.05**< 0.01***< 0.001model group;D< 0.05DD< 0.01the same concentration of scutellarein in the Scu-NCs group.

3 討論

為防止藥物聚集、晶體長(zhǎng)大，通常使用適量的穩(wěn)定劑來(lái)抑制納米晶體粒子的成長(zhǎng)速率。良好的穩(wěn)定劑能夠有效的與藥物納米晶體的疏水性表面吸附，提供給納米晶體粒子足夠的空間位阻或靜電排斥力，以防止粒子聚集[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，穩(wěn)定劑種類(lèi)、濃度對(duì)Scu-NCs粒徑有一定的影響。

通過(guò)正交試驗(yàn)篩選得到最佳工藝參數(shù)后，制得的Scu-NCs粒徑遠(yuǎn)小于原料藥，且分布均勻，晶型及結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯變化。納米晶體其具有較大的比表面積和較高的表觀(guān)溶解度，因此，具有較大的溶出度[19]。本研究通過(guò)漿法證明Scu-NCs體外溶出度遠(yuǎn)高于原料藥，通過(guò)擴(kuò)散池法證明Scu-NCs凝膠體外擴(kuò)散度遠(yuǎn)高于野黃芩素普通凝膠。

野黃芩素可抑制銀屑病、特異性皮炎等皮膚病引起的瘙癢[20]，Wang等[21]和Um等[22]的研究已證實(shí)野黃芩素可以通過(guò)選擇性抑制瞬時(shí)受體電位離子通道香草素3（transient receptor potential vanilloid-3，Trpv3）來(lái)減輕特異性皮炎癥狀，sc野黃芩素可以抑制香芹酚誘導(dǎo)的小鼠皮膚瘙癢、增生和炎癥。而IL-6、IL-1β、TNF-α是參與慢性瘙癢發(fā)生的重要炎癥因子[23-24]，本研究將Scu-NCs、野黃芩素制備成皮膚外用凝膠劑應(yīng)用于AWE小鼠模型，藥效實(shí)驗(yàn)表明，Scu-NCs及野黃芩素均可明顯降低小鼠抓撓次數(shù)、頸背部表皮增厚及炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平，說(shuō)明二者對(duì)AEW模型均有一定的治療效果。

納米晶體在經(jīng)皮給藥后可以在皮膚表面形成較高的濃度梯度；此外，納米晶體較小的粒徑可以蓄積在毛囊中，且具有好的生物黏附性，可延長(zhǎng)其在皮膚表面的滯留時(shí)間[25]，因此，藥物納米晶體化是促進(jìn)難溶藥物經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)的重要途經(jīng)。對(duì)原料藥和納米晶體藥效比較，Scu-NCs體現(xiàn)出更好的止癢藥效，與陽(yáng)性對(duì)照藥卡泊三醇倍他米松相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明野黃芩素納米結(jié)晶化可改善其經(jīng)皮給藥作用效果。

納米晶體技術(shù)用于難溶性藥物經(jīng)皮給藥，具有良好的臨床應(yīng)用前景，由于載藥量大，其經(jīng)皮遞藥能力比傳統(tǒng)納米載體更具優(yōu)勢(shì)。本研究為Scu-NCs應(yīng)用于外用制劑領(lǐng)域提供了重要參考，但本研究仍具有一定的局限性，如Scu-NCs治療干皮性慢性瘙癢模型的具體機(jī)制及Scu-NCs的促滲機(jī)制需進(jìn)一步考察。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation of scutellarein nanocrystals and evaluation of its efficacy in treatment of chronic pruritus model

LIU Xinying1, 2, WANG Fujiang2, GE Haitao1, 2

1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Suzhong Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd., Nanjing 210031, China

To prepare scutellarein nanocrystals (Scu-NCs), investigate their pharmaceutical characteristics and their therapeutic effects on a mouse model of dry and itchy skin.The Scu-NCs were prepared by anti-solvent precipitation technique and solidified into solid powder by freeze-drying technique; The average particle size, dispersion coefficient, ζ potential, and microstructure of Scu-NCs were determined; Differential scanning calorimetry (DSC) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) were used to analyze the changes in crystalline shape and chemical structure of Scu-NCs; The dissolution rate of the drug and the release degree of the gelwere tested; and the itch-relieving effects of the transdermal administration of scutellarein and Scu-NCs gel on the mouse model of dry and itchy skin induced by acetone/ethyl ether and water (AEW) were evaluated.The average particle size of the prepared Scu-NCs was (379.1 ± 1.7) nm, the polydispersity index (PDI) value was 0.238 ± 0.081, and the ζ potential was (25.50 ± 0.25) mV; The crystalline shape and chemical structure of scutellarein after nano conversion did not change significantly; There was no significant change in the particle size of Scu-NCs after freeze-drying; The nano conversion of scutellarein improved the drug dissolution rate within 2 h, dissolution degree and the release degree of the Scu-NCs gelwithin 6 h; Compared with the AEW model group, the scutellarein and Scu-NCs gel administration group could significantly reduce the number of scratching within 1 h, inhibit epidermal thickening of the nape of the neck and expression of interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β), and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the skin, and the inhibitory effect of Scu-NCs was more obvious on the AEW model.The particle size of Scu-NCs was small and uniform, and there was no significant change in the crystal shape and chemical structure after its nano conversion; The preparation of scutellarein into nanocrystals significantly improved the dissolution andrelease degree of the drug, and provided a better therapeutic effect on local chronic itching of the skin.

scutellarein; nanocrystals; gel; chronic itching; external preparations; anti-solvent precipitation technique; freeze-drying technique; interleukin; tumor necrosis factor-α

R283.6

A

0253 - 2670(2024)09 - 2946 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.009

2023-10-19

泰州市“鳳城英才計(jì)劃”青年科技人才托舉工程；南京中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（XZR2020099）

劉新穎（1999—），女，碩士，從事中藥制藥技術(shù)與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究。Tel: 13770824736 E-mail: liuxinying016@163.com

通信作者：葛海濤（1974—），男，博士，高級(jí)工程師，從事中藥新藥研究及中藥大品種二次開(kāi)發(fā)研究。Tel: 13851872795 E-mail: geht@suzhongyy.com

王富江，（1987—），男，博士，高級(jí)工程師，從事新藥創(chuàng)新藥研發(fā)研究。Tel: 18351834272 E-mail: wangfj@suzhongyy.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]