孟雨婷，薛玉葉，劉 燕，萬志若，高翠蕓，杭凌宇*，袁海龍*

甘草新型自組裝納米粒的形成及抗炎作用評(píng)價(jià)

孟雨婷1, 2，薛玉葉2，劉 燕1, 2，萬志若2，高翠蕓2，杭凌宇2*，袁海龍1, 2*

1. 安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032 2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)空軍特色醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部，北京 100142

對(duì)傳統(tǒng)中藥煎煮自組裝現(xiàn)象進(jìn)行改良，應(yīng)用微沉淀法制備甘草新型自組裝納米粒（glycyrrhiza novel self-assembled nanoparticles，GN-SAN），將其與傳統(tǒng)水煎煮形成的甘草SAN（glycyrrhiza decoction self-assembled nanoparticles，GD-SAN）進(jìn)行系統(tǒng)比較，進(jìn)一步探究GN-SAN對(duì)2,4-二硝基氯苯（2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB）誘導(dǎo)的小鼠特應(yīng)性皮炎的治療作用。采用煎煮結(jié)合微沉淀法制備GN-SAN，以粒徑、PDI和ζ電位為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)聯(lián)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對(duì)煎煮時(shí)間、磁力攪拌轉(zhuǎn)速、磁力攪拌時(shí)間、磁力攪拌溫度、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度以及生藥質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，篩選最優(yōu)處方工藝。將優(yōu)化后的GN-SAN與GD-SAN進(jìn)行比較，掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）和透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察形態(tài)；高效液相色譜儀（HPLC）、紫外分光光度計(jì)（UV）以及bicinchoninic acid（BCA）試劑盒檢測各SAN中小分子活性成分（芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草酸、甘草查耳酮A）、多糖以及蛋白的含量。采用DNCB對(duì)小鼠背部皮膚刺激，建立特應(yīng)性皮炎模型。將小鼠分為空白組，模型組，陽性藥組，GN-SAN凝膠低、中、高劑量組，觀察各小鼠背部皮膚皮損變化，對(duì)皮損組織病理變化、炎癥因子表達(dá)、臟器指數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行檢測。GN-SAN的最佳處方工藝：甘草經(jīng)8倍量水煎煮1 h，得GD-SAN。再經(jīng)6倍70%乙醇煎煮1 h后得醇提液，合并2次提取液，600 r/min磁力攪拌20 min，60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除醇并濃縮至0.2 g/mL，即得GN-SAN。形成的SAN性質(zhì)穩(wěn)定，為形態(tài)均一的圓球形納米粒，粒徑為（189.5±0.3）nm，多分散指數(shù)為0.138±0.130，ζ電位為（?31.4±0.8）mV。其粒徑大小、均勻性、穩(wěn)定性及有效成分轉(zhuǎn)移率相對(duì)于傳統(tǒng)SAN均提高，且GN-SAN對(duì)皮炎有良好的治療效果。采用煎煮法結(jié)合微沉淀法制備GN-SAN，其工藝簡單、主要成分含量高，穩(wěn)定性好；制成的GN-SAN性能優(yōu)良、抗炎作用顯著，為甘草納米制劑進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

甘草；自組裝納米粒；Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；物質(zhì)基礎(chǔ)；特應(yīng)性皮炎；抗炎；微沉淀法；芹糖甘草苷；甘草苷；芹糖異甘草苷；異甘草苷；甘草酸；甘草查耳酮A；多糖；蛋白質(zhì)

中藥自組裝是近年各學(xué)者研究與探討的熱門話題，中藥在煎煮過程中，大量化合物從中藥材轉(zhuǎn)移到湯劑中，化學(xué)分子之間發(fā)生相互作用并形成自組裝納米粒（self-assembled nanoparticles，SAN）[1-2]。研究表明SAN可以包封難溶性小分子，提高溶解度及生物利用度，增強(qiáng)藥效[3-5]。如黃連湯中的SAN，能夠促進(jìn)細(xì)胞旁小檗堿運(yùn)輸，并通過主動(dòng)運(yùn)輸和胞吞作用改善細(xì)胞間小檗堿運(yùn)輸[6]。甘草通過煎煮可以包裹芍藥有效成分形成聚集體，增加其溶解度，延長在體內(nèi)發(fā)揮作用的時(shí)間[7-8]。從白虎湯湯液中發(fā)現(xiàn)的納米聚集體的解熱作用強(qiáng)于水溶液，該部位的細(xì)胞攝取率和靶向性也顯著增強(qiáng)[9]。中藥在經(jīng)過煎煮中天然成分自組裝形成納米粒很可能是一個(gè)很有前途現(xiàn)代制劑研究方向。

然而中藥SAN的臨床可行性、穩(wěn)定性是評(píng)估藥物是否可能用于臨床應(yīng)用的關(guān)鍵指標(biāo)，由于傳統(tǒng)方式煎煮獲得的SAN在常溫水相下長時(shí)間放置也會(huì)出現(xiàn)粒徑、ζ電位的變化[10-11]。若要保證中藥SAN的結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)與均一性，則需要在調(diào)控溫度、煎煮時(shí)間、pH值等因素變化，更重要的是，傳統(tǒng)水煎煮往往存在難溶性成分轉(zhuǎn)移率低的問題，限制了中藥活性成分的有效遞送。因此，需要通過有效的制劑技術(shù)，提高SAN的穩(wěn)定性及有效成分轉(zhuǎn)移率。

甘草為豆科甘草屬植物甘草Fisch.、脹果甘草Bat.或光果甘草L.的干燥根和根莖[12]，具有解毒、調(diào)和諸藥、祛風(fēng)止癢的功效。甘草及其活性成分制劑作為經(jīng)驗(yàn)用藥在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療多種皮膚病，具有良好的抗病毒、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)等功效，效果顯著[13-15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甘草經(jīng)水煎煮可形成SAN，但在進(jìn)一步應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)其存在穩(wěn)定性不佳，難溶性成分轉(zhuǎn)移率較低等問題。采用微沉淀法改良自組裝過程，即藥材經(jīng)水煎煮后，以適當(dāng)濃度乙醇提取藥渣，水提液和醇提液合并，磁力攪拌后除醇，水煎液和醇提液發(fā)生分子識(shí)別并在過飽和驅(qū)動(dòng)力下形成自組裝納米粒[16]。該方法有效解決了SAN穩(wěn)定性差，易聚集及難溶性成分轉(zhuǎn)移率低的問題。本研究通過控制關(guān)鍵形成條件，并進(jìn)一步應(yīng)用微沉淀法制備甘草新型自組裝納米粒（novel self-assembled nanoparticles，GN-SAN），考察不同煎煮時(shí)間、磁力攪拌轉(zhuǎn)速、磁力攪拌時(shí)間、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度和生藥質(zhì)量濃度對(duì)SAN形成的影響，優(yōu)化最佳GN-SAN工藝。從粒徑分布、ζ電位、SAN形態(tài)、有效成分轉(zhuǎn)移率等方面，對(duì)傳統(tǒng)水煎煮形成的甘草SAN（decoction self-assembled nanoparticles，GD-SAN）與GN-SAN進(jìn)行系統(tǒng)對(duì)比研究，進(jìn)一步探究GN-SAN抗皮炎活性藥效，以期為中藥天然納米制劑的發(fā)展提供新的思路及見解。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BT125D型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；98-1-B型電子恒溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；N-1300D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DZF-6020型真空干燥箱，北京陸希科技有限公司；Lab-1A-50型凍干機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DF101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，北京恒豐長偉科技有限公司；TDA-8002型電熱恒溫水浴鍋，余姚市東方電工儀器廠；Nanotrac Wave II型納米粒度電位儀，美國麥奇克有限公司；LC-2030C 3D Plus型高效液相色譜儀，日本島津公司；Tecnai G2 F30型場發(fā)射高分辨透射電子顯微鏡（TEM），美國FEI公司；S-4800掃描電子顯微鏡（SEM），日本日立公司；CBGT-48型高速組織研磨機(jī)，上海測博科技有限公司。

1.2 藥物與試劑

對(duì)照品芹糖甘草苷（批號(hào)PS011457）、甘草苷（批號(hào)PS012028）、異甘草苷（批號(hào)PS020442），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%，成都普思生物科技股份有限公司；對(duì)照品甘草酸（批號(hào)HP200644F1）、芹糖異甘草苷（批號(hào)HR5168W4）、甘草查耳酮A（批號(hào)HS1970B1），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%，寶雞市辰光生物科技有限公司。

甘草購自北京仟草中藥飲片有限公司，經(jīng)空軍特色醫(yī)學(xué)中心袁海龍研究員鑒定，為豆科甘草屬植物脹果甘草Bat.的干燥根和根莖。1-氯-2,4-二硝基苯，批號(hào)GL100072，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；丁酸氫化可的松，批號(hào)23011009，天津金耀藥業(yè)有限公司；卡波姆940，批號(hào)20230812，廣州佰宇生物科技有限公司；薇婷脫毛膏，批號(hào)C261122001，利潔時(shí)家化有限公司；小鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6，批號(hào)AK04JBN85267）、IL-1β（批號(hào)PA048H480024）、免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE，批號(hào)PA054RX65181）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號(hào)KL07J8J64980），武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。甲醇、乙腈色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

BALB/c小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，SPF級(jí)，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供。許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理經(jīng)中國人民解放軍空軍特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：空特（科研）第2023-98-PJ01。

2 方法與結(jié)果

2.1 GD-SAN和GN-SAN的制備

2.1.1 GD-SAN的制備 采用傳統(tǒng)煎煮工藝提取GD-SAN。取甘草15 g，打碎成粗粉，加9倍量超純水，浸泡30 min，回流提取1 h，趁熱濾過，濾液迅速放入冷水中攪拌冷卻；藥渣重復(fù)提取1次，趁熱濾過；合并2次濾液，減壓濃縮至0.2 g/mL，即得GD-SAN。

2.1.2 GN-SAN的制備 采用微沉淀法[16]制備GN-SAN。取甘草15 g，打碎成粗粉，加8倍量超純水，浸泡30 min，回流提取1 h，趁熱濾過。取甘草水提后的藥渣，加6倍70%乙醇回流提取1 h，濾過，得醇提液。合并2次提取液，600 r/min、25 ℃條件下磁力攪拌20 min，60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除醇，并濃縮至0.2 g/mL，即得GN-SAN。

2.1.3 甘草藥材溶液的制備 取甘草粉末（過三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 指標(biāo)成分檢測方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Inertsil?ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫：0～10 min，19%乙腈；10～12 min，19%～20%乙腈；12～21 min，20%～33%乙腈；21～35 min，33%～51%乙腈；35～46 min，51%乙腈；46～50 min，51%～19%乙腈；變波長檢測：0～15 min，275 nm；15～30 min，360 nm；30～35 min，250 nm；35～50 min，375 nm；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草酸和甘草查耳酮A對(duì)照品適量，加入甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為783.0、296.0、148.0、54.5、1 391.0、99.0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，4 ℃冰箱冷藏，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取“2.2.1”項(xiàng)下的GN-SAN溶液0.5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解后，定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.4 專屬性考察 分別取空白甲醇溶液（陰性對(duì)照組）、混合對(duì)照品溶液、GN-SAN供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1?？瞻兹芤何闯霈F(xiàn)干擾峰，且GN-SAN供試品溶液和混合對(duì)照品溶液中各個(gè)成分的出峰時(shí)間一致，表明該色譜方法專屬性良好。

1-芹糖甘草苷；2-甘草苷；3-芹糖異甘草苷；4-異甘草苷；5-甘草酸；6-甘草查耳酮A。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，等比稀釋，加甲醇定容至刻度，搖勻。HPLC進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)（），各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：芹糖甘草苷＝12 725.0＋40 450.0，2＝0.999 9，線性范圍48.94～783.00 μg/mL；甘草苷＝191 861.0＋20 573.0，2＝0.999 9，線性范圍18.50～296.00 μg/mL；芹糖異甘草苷＝30 883.0＋23 264.0，2＝0.999 9，線性范圍9.25～148.00 μg/mL；異甘草苷＝36 666.0＋9 073.5，2＝0.999 9，線性范圍3.41～54.50 μg/mL；甘草酸＝7 847.7－54 818.0，2＝0.999 8，線性范圍86.94～1 391.00 μg/mL；甘草查耳酮A＝ 44 516.0＋15 686.0，2＝0.999 9，線性范圍6.19～99.00 μg/mL；結(jié)果表明6個(gè)成分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取質(zhì)量濃度分別為芹糖甘草苷783.0 μg/mL、甘草苷296.0 μg/mL、芹糖異甘草苷148.0 μg/mL、異甘草苷54.5 μg/mL、甘草酸1 391.0 μg/mL、甘草查耳酮A 99.0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，平行測定6次，計(jì)算得到芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草酸、甘草查耳酮A峰面積的RSD分別為0.43%、0.41%、0.39%、0.40%、0.39%、0.37%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取GN-SAN供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、12、24 h，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積，計(jì)算得到芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草酸、甘草查耳酮A峰面積的RSD分別為1.39%、1.35%、1.88%、0.72%、1.36%、1.86%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批GN-SAN供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積。計(jì)算得到芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草酸、甘草查耳酮A質(zhì)量濃度的RSD分別為0.94%、0.94%、1.18%、1.19%、1.20%、1.18%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取適量已測定指標(biāo)成分質(zhì)量濃度的供試品溶液9份，根據(jù)樣品中各成分質(zhì)量濃度的80%、100%、120%的比例加入各對(duì)照品，渦旋混合均勻后，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算得到芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草酸、甘草查耳酮A的平均加樣回收率分別為101.99%、101.19%、101.33%、101.00%、100.95%、100.29%，RSD分別為0.53%、0.75%、1.64%、0.63%、0.77%、1.18%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 BBD-RSM因素和水平設(shè)計(jì)（單因素實(shí)驗(yàn)）

前期實(shí)驗(yàn)表明，甘草用水和乙醇各提取1次，有效成分轉(zhuǎn)移率可達(dá)到60%以上，因此固定提取次數(shù)各1次，以GN-SAN的平均粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）、ζ電位為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)甘草煎煮時(shí)間、磁力攪拌轉(zhuǎn)速、磁力攪拌時(shí)間、磁力攪拌溫度、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度和生藥質(zhì)量濃度進(jìn)行單因素考察，初步篩選對(duì)GN-SAN制備過程中影響較大的實(shí)驗(yàn)因素。

2.3.1 煎煮時(shí)間的影響 固定磁力攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min、磁力攪拌時(shí)間20 min、磁力攪拌溫度25 ℃、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度60 ℃和生藥質(zhì)量濃度0.2 g/mL，考察煎煮時(shí)間分別為10、20、30、60、90、120 min時(shí)對(duì)GN-SAN的平均粒徑、PDI和ζ電位的影響，結(jié)果見表1?？芍煌逯髸r(shí)間對(duì)SAN的粒徑影響較大，在10～60 min內(nèi)，隨著煎煮時(shí)間的增加，粒徑逐漸減??；60 min之后，煎煮時(shí)間越長，粒徑越大。當(dāng)煎煮時(shí)間為60 min時(shí)，SAN粒徑最小，且粒子分布均勻。故選擇煎煮時(shí)間60 min。

表1 煎煮時(shí)間考察(, n = 3)

2.3.2 磁力攪拌轉(zhuǎn)速的考察 固定煎煮時(shí)間為60 min，磁力攪拌時(shí)間20 min、磁力攪拌溫度25 ℃、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度60 ℃和生藥質(zhì)量濃度0.2 g/mL，考察磁力攪拌轉(zhuǎn)速為400、600、800 r/min時(shí)對(duì)GN-SAN的平均粒徑、PDI和ζ電位的影響，結(jié)果見表2。當(dāng)磁力攪拌轉(zhuǎn)速從400 r/min增至600 r/min時(shí)，粒徑和PDI無明顯變化，ζ電位增加粒子趨于穩(wěn)定；繼續(xù)增加磁力攪拌速度，粒徑增加，并且穩(wěn)定性降低。故選擇磁力攪拌轉(zhuǎn)速為600 r/min。

2.3.3 磁力攪拌時(shí)間的考察 固定煎煮時(shí)間為60 min，磁力攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min、磁力攪拌溫度25 ℃、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度60 ℃和生藥質(zhì)量濃度0.2 g/mL?？疾齑帕嚢钑r(shí)間為10、20、30 min時(shí)對(duì)GN-SAN的平均粒徑、PDI和ζ電位的影響，結(jié)果見表3。當(dāng)磁力攪拌時(shí)間從10 min增至20 min時(shí)，平均粒徑無明顯變化，穩(wěn)定性增加。但攪拌時(shí)間增加至30 min時(shí)，較長的攪拌時(shí)間破壞了納米體系的穩(wěn)定性，導(dǎo)致粒徑顯著增大，故選擇攪拌時(shí)間為20 min。

2.3.4 磁力攪拌溫度的考察 固定煎煮時(shí)間為60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，磁力攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min、磁力攪拌時(shí)間20 min、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度60 ℃和生藥質(zhì)量濃度0.2 g/mL?？疾齑帕嚢铚囟葹?5、50、75 ℃時(shí)對(duì)GN-SAN的平均粒徑、PDI和ζ電位的影響，結(jié)果見表4。磁力攪拌溫度對(duì)粒徑和ζ電位都沒有顯著影響，故選擇磁力攪拌溫度為25 ℃。

表2 磁力攪拌轉(zhuǎn)速考察(, n = 3)

表3 磁力攪拌時(shí)間考察(, n = 3)

表4 磁力攪拌溫度考察(, n = 3)

2.3.5 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度的考察 固定煎煮時(shí)間為60 min，磁力攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min、磁力攪拌時(shí)間20 min、磁力攪拌溫度25 ℃和生藥質(zhì)量濃度0.2 g/mL?？疾煨D(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為40、60、80 ℃時(shí)對(duì)GN-SAN的平均粒徑、PDI和ζ電位的影響，結(jié)果見表5。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度對(duì)粒徑無顯著影響；當(dāng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度從40 ℃增加至60 ℃時(shí)，ζ電位明顯增大，繼續(xù)升高溫度對(duì)ζ電位無顯著影響。故選擇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為60 ℃。

2.3.6 生藥質(zhì)量濃度的考察 固定煎煮時(shí)間為60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，磁力攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min、磁力攪拌時(shí)間20 min、磁力攪拌溫度25 ℃和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度60 ℃?？疾焐庂|(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3 g/mL時(shí)對(duì)GN-SAN的平均粒徑、PDI和ζ電位的影響，結(jié)果見表6。有研究發(fā)現(xiàn)[17]，中藥湯劑中化學(xué)成分達(dá)到一定質(zhì)量濃度即臨界生藥質(zhì)量濃度時(shí)才會(huì)聚集形成SAN，當(dāng)大于臨界生藥質(zhì)量濃度時(shí)，小分子過度聚集導(dǎo)致粒徑增大。由表6可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2 g/mL時(shí)，GN-SAN處于臨界生藥質(zhì)量濃度，粒子粒徑最小且趨于穩(wěn)定；繼續(xù)增大質(zhì)量濃度，SAN的粒徑和PDI都顯著增加，并且電位降低，粒子變大且穩(wěn)定性降低。故選擇質(zhì)量濃度為0.2 g/mL。

表5 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度考察(, n = 3)

表6 生藥質(zhì)量濃度考察(, n = 3)

2.4 Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.4.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)GN-SAN制備過程中影響較大的3個(gè)因素作為考察因素，分別為煎煮時(shí)間（1）、磁力攪拌時(shí)間（2）和生藥質(zhì)量濃度（3），以平均粒徑（1）和PDI（2）2者作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，使用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，并驗(yàn)證優(yōu)化后的工藝。因素與水平見表7。

2.4.2 回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn) 以Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化其工藝參數(shù)[18]，因素水平及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。采用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合。以1和2作為響應(yīng)值，1、2和3為自變量，建立的2次回歸方程為1＝188.72＋11.761－7.892＋14.223－0.9312＋8.4013－4.2023＋35.1512＋29.4022＋28.6832，12＝0.998 9，adj12＝0.997 5，＜0.000 1；2＝0.16＋0.006 151－0.0282＋0.0293－0.004 82512－0.000 22513＋0.01923＋0.04512＋0.02622＋0.03632，22＝0.992 2，adj22＝0.982 1，＜0.000 1。擬合方程2均大于0.9，由此可證明模型擬合良好。各因素之間具有良好的相關(guān)性。自變量與響應(yīng)值的三維圖如圖2所示。

表7 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

根據(jù)Design-Expert V8.0.6實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件綜合評(píng)價(jià)后給出的最佳制備條件：煎煮時(shí)間57.35 min，磁力攪拌時(shí)間23.07 min，生藥質(zhì)量濃度0.17 g/mL，3批驗(yàn)證試驗(yàn)與模型優(yōu)選的最佳處方條件，測得GN-SAN的粒徑和PDI。

2.4.3 優(yōu)化處方及驗(yàn)證 為了方便實(shí)驗(yàn)操作，根據(jù)Design-Expert V8.0.6實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件綜合評(píng)價(jià)后給出的GN-SAN的最佳制備工藝和處方進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，將最佳工藝參數(shù)修正為煎煮時(shí)間57 min，磁力攪拌時(shí)間23 min，生藥質(zhì)量濃度0.17 g/mL。按照“2.2”項(xiàng)下方法制備最優(yōu)處方GN-SAN 3批，分別測定GN-SAN平均粒徑和PDI，計(jì)算偏差［偏差＝(預(yù)測值－實(shí)際值)/預(yù)測值］，實(shí)測值與模型預(yù)測值結(jié)果見表8，可知實(shí)測值和模型預(yù)測值比較接近，說明模型預(yù)測性良好，可靠性高。

通過單因素分析對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終得出GN-SAN的最佳制備方法為采用傳統(tǒng)煎煮工藝結(jié)合微沉淀法優(yōu)化GN-SAN，取甘草15 g，打碎成粗粉，加8倍量超純水，浸泡30 min，回流提取1 h，趁熱濾過得甘草SAN。取甘草水提后藥渣，加6倍70%乙醇回流提取1 h，濾過，得醇提液。合并2次提取液，600 r/min磁力攪拌20 min，60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除醇并濃縮至0.2 g/mL，即得GN-SAN。

2.5 GD-SAN和GN-SAN的表征

2.5.1 粒徑分析 取適量GD-SAN、GN-SAN溶液，加超純水稀釋后，測定平均粒徑、PDI及ζ電位。其粒徑分布見圖3。GD-SAN的粒徑平均粒徑為（320.5±2.3）nm，PDI為0.116±0.090，ζ電位值為（?20.4±2.8）mV。GN-SAN的粒徑分布較為均一，體系較為穩(wěn)定，平均粒徑為（189.5±0.3）nm，PDI為0.138±0.130，ζ電位值為（?31.35±0.80）mV。

圖2 自變量與響應(yīng)值的三維圖

表8 預(yù)測值和實(shí)際值的比較(, n = 3)

圖3 GD-SAN和GN-SAN的粒徑分布

2.5.2 SEM形態(tài)觀察 取適量GD-SAN、GN-SAN溶液，適當(dāng)稀釋后滴于錫箔紙上，室溫下自然干燥，噴金處理后，于SEM下觀察其形態(tài)，結(jié)果見圖4。

2.5.3 TEM形態(tài)觀察 取適量GD-SAN、GN-SAN溶液滴于銅網(wǎng)上，用濾紙吸去邊緣多余液體，紅外燈干燥后TEM觀察形態(tài)，結(jié)果見圖5。所制備的GN-SAN粒徑在100～300 nm，形態(tài)完整，呈規(guī)則的圓球形，分布均勻。GD-SAN粒徑在200～500 nm，形態(tài)也呈規(guī)則的圓球形，但有聚集現(xiàn)象。

圖4 GD-SAN和GN-SAN的SEM圖

圖5 GD-SAN和GN-SAN的TEM圖

2.6 含量測定

2.6.1 小分子活性成分 取按“2.1”項(xiàng)下方法制備的GD-SAN、GN-SAN溶液各0.5 mL，加甲醇定容至10 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下HPLC方法測定其中6種活性成分含量，記錄色譜圖。計(jì)算所含活性成分的含量，結(jié)果見表9。

2.6.2 蛋白質(zhì)的含量 使用BCA試劑盒測定湯劑中蛋白類成分的含量。以牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）稀釋至標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。取“2.1”項(xiàng)下制備的GD-SAN、GN-SAN溶液各3份，用PBS稀釋10倍，精密吸取20 μL至96孔板，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)對(duì)照品孔和樣品孔數(shù)量，將BCA試劑A和BCA試劑B按體積比為50∶1配制適當(dāng)體積的工作液，充分混勻，精密吸取200 μL至各標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中，37 ℃孵育0.5 h后，562 nm波長下測定吸光度（）值，根據(jù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量。

表9 各組分有效成分的含量分析(, n = 3)

按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的說明書操作，將10 μL待測樣品加入到微孔板中，并用PBS補(bǔ)足到20 μL，向微孔板中加入200 μL工作液，混勻，37 ℃放置30 min，在562 nm波長處測定值，并記錄讀數(shù)；以BSA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到BSA的線性回歸方程為＝0.788 8＋0.122 2；2＝0.996 0，線性范圍為0.025～1 000 μg/mL。將樣品的值代入線性方程，計(jì)算GD-SAN、GN-SAN溶液中蛋白含量，結(jié)果見表9。

2.6.3 糖類成分的含量 以苯酚-硫酸法測定GD-SAN、GN-SAN中多糖含量[19]。精密稱取適量的無水葡萄糖，置25 mL量瓶中，加水溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為103.6 μg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL對(duì)照品溶液至試管中，加蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，分別加4%苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入硫酸7 mL，搖勻，40 ℃水浴30 min后，冰水浴5 min，充分搖勻，放置25 min，以不含對(duì)照品的溶液為空白，使用紫外分光光度法，在490 nm波長處測定不同質(zhì)量濃度對(duì)照品的值，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。結(jié)果葡萄糖的回歸方程為＝5.700＋0.101，2＝0.999 8，結(jié)果表明葡萄糖在10.36～103.60 μg/mL線性關(guān)系良好。

取“2.1”項(xiàng)下制備的GD-SAN、GN-SAN溶液3份，稀釋至適宜質(zhì)量濃度，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下方法，自“加4%苯酚溶液1 mL”起，依法測定值，計(jì)算樣品的多糖含量，結(jié)果見表9。

2.7 轉(zhuǎn)移率測定

取按“2.1”項(xiàng)下制備的GD-SAN、GN-SAN、甘草藥材溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下HPLC方法測定，計(jì)算6種活性成分由甘草藥材到GD-SAN、GN-SAN溶液的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表10。

轉(zhuǎn)移率＝GD-SAN或GN-SAN中指標(biāo)成分的含量/甘草藥材中指標(biāo)成分的含量

表10 轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果(, n = 3)

2.8 GN-SAN治療特應(yīng)性皮炎小鼠的藥效評(píng)價(jià)

2.8.1 不同質(zhì)量濃度GN-SAN凝膠的制備 取卡波姆940加水至卡波姆940質(zhì)量濃度為2%[20]，充分溶脹均勻，按“2.2”項(xiàng)下方法分別制備質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3 g/mL的GN-SAN溶液加入已溶脹均勻的凝膠體系中，邊加邊攪拌均勻，滴加三乙醇胺調(diào)節(jié)值至pH 5.5～6.5，可得低、中、高劑量GN-SAN凝膠樣品，平行制備3份。

2.8.2 分組 將經(jīng)檢疫合格的SPF級(jí)BALB/c小鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為空白組，模型組，陽性對(duì)照（丁酸氫化可的松）組，凝膠低、中、高劑量組。

2.8.3 造模 小鼠經(jīng)2 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后，建立經(jīng)典的DNCB誘導(dǎo)特應(yīng)性皮炎樣皮損模型[21]。在實(shí)驗(yàn)前一天使用脫毛膏脫去背部毛發(fā)（約2 cm×2 cm面積）。空白組小鼠每日在背部皮膚涂抹生理鹽水。模型組及各給藥組在第1、3天用200 μL 1% DNCB（溶解在3∶1的丙酮和橄欖油的混合物）涂抹小鼠的背部皮膚，在第5、7、9、11、13、15、17、19天采用同法涂抹200 μL 0.5% DNCB基質(zhì)溶液于小鼠背部相同位置。

2.8.4 給藥 根據(jù)小鼠與人的劑量換算，GN-SAN凝膠低、中、高劑量0.2 g，丁酸氫化可的松乳膏劑量為0.1 g[22]，造模第5天開始給藥，空白組背部單位面積涂抹生理鹽水，每天1次，連續(xù)10 d，隔1 d拍照1次，記錄小鼠背部皮膚情況。連續(xù)20 d邊造模邊給藥，最后一次給藥后，將小鼠脫頸處死。

2.8.5 小鼠背部皮損評(píng)分 每天對(duì)小鼠背部皮膚拍照留存并按照皮損面積和嚴(yán)重程度（psoriasis area and severity index，PASI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)皮損部位紅斑/出血，干燥、結(jié)痂，剝脫/糜爛，水腫4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分。PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0，無明顯癥狀；1，輕度；2，中度；3，重度。癥狀評(píng)分之和即為皮損嚴(yán)重程度，得分越高，皮損越嚴(yán)重。各組小鼠第20天皮損情況見圖6。空白組小鼠皮膚脫毛處毛發(fā)生長正常；模型組小鼠致敏皮膚處有紅斑、局部水腫并大量結(jié)痂、無新生毛發(fā)，表明造模成功；陽性對(duì)照組小鼠皮膚生長良好，AD樣癥狀消失；GN-SAN凝膠低、中劑量組紅腫緩解，有少量出血點(diǎn)、表皮結(jié)痂逐漸開始掉落、新生皮膚良好；GN-SAN凝膠高劑量組未見出血，結(jié)痂大部分脫落，皮膚水腫緩解；給藥組小鼠皮損顯著改善，且隨著給藥質(zhì)量濃度增大，治療效果越明顯。

各實(shí)驗(yàn)組在第2、4、6、8、12、16、18天皮損嚴(yán)重程度評(píng)分比較見表11。實(shí)驗(yàn)第0天，各組小鼠皮膚正常，評(píng)分均為0分。在實(shí)驗(yàn)第8天，各組小鼠評(píng)分達(dá)到最高，明顯有炎癥癥狀，說明造模成功。實(shí)驗(yàn)第18天，與模型組相比，凝膠組和陽性對(duì)照組PASI評(píng)分均有所降低（＜0.01）。隨著劑量增大，凝膠組PASI評(píng)分逐漸降低。

圖6 各組AD模型小鼠皮損情況

表11 各組小鼠皮損PASI評(píng)分比較(, n = 8)

與空白組比較：##＜0.01；與模型組比較：**＜0.01。

##< 0.01normal group;**< 0.01model group.

2.8.6 小鼠皮損組織病理變化 小鼠脫頸處死后，剪下一半皮損組織，放在4%多聚甲醛中固定，而后經(jīng)過脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，每個(gè)標(biāo)本選3張切片進(jìn)行觀察并拍照。各組鼠染色結(jié)果見圖7。HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)完整清晰，真皮層無血管擴(kuò)張及炎癥細(xì)胞。模型組角質(zhì)層角化過度，顆粒層明顯減少，棘細(xì)胞間水腫，棘層肥厚并伴有表皮突起延伸，真皮層可見毛細(xì)血管增生和明顯炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。氫化可的松陽性對(duì)照組表皮層較為完整，少量表皮突起下延，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。SAN各劑量組表皮增厚降低，表皮突起延伸、毛細(xì)血管增生、炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，且呈現(xiàn)出劑量相關(guān)現(xiàn)象。

2.8.7 小鼠血清和織中炎癥因子含量測定 小鼠摘眼球取血，血液流盡時(shí)脫頸處死小鼠，采集后的全血立即放入離心管中，室溫靜置30 min后，在相對(duì)離心力14000×下離心血樣15 min，用移液槍吸取分離上層血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測IgE的含量。將小鼠余下皮損組織放在試管中置于?20 ℃冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)前提前取出解凍，稱定質(zhì)量后剪碎，按1∶9加入生理鹽水，再往試管中加入鋼珠，用組織勻漿機(jī)進(jìn)行破碎，離心后取上清液，采用ELISA法檢測其中炎癥因子IL-1β、IL-6的含量，結(jié)果見表12。由表可知，與空白組相比，模型組小鼠3種炎癥因子含量均顯著增加（＜0.01），說明造模成功。與模型組相比，陽性對(duì)照組與凝膠各劑量組炎癥因子含量顯著降低（＜0.01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7 各組小鼠皮損組織病理變化

2.8.8 小鼠臟器指數(shù)測定 小鼠稱定質(zhì)量后處死，依次取出脾臟、胸腺并記錄其質(zhì)量，按公式計(jì)算臟器指數(shù)。各組小鼠脾臟、胸腺指數(shù)變化見表12。由表可知，與空白組相比，模型組脾臟指數(shù)顯著升高（＜0.01），說明造模成功；與模型組相比，陽性對(duì)照組、SAN凝膠高中低劑量組脾臟指數(shù)均顯著降低（＜0.01）。與空白組相比，模型組胸腺指數(shù)顯著降低（＜0.01）；與模型組相比，陽性對(duì)照組胸腺指數(shù)降低（＜0.01），而其余各給藥組胸腺指數(shù)變化不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量/體質(zhì)量

表12 各組小鼠IgE、IL-1β和IL-6的含量比較及臟器指數(shù)變化(, n = 8)

與空白組比較：##＜0.01；與模型組比較：**＜0.01。

##< 0.01normal group;**< 0.01model group.

3 討論

中藥水煎液中普遍存在自組裝聚集體，不僅可發(fā)揮生物活性，也可作為天然載體用于藥物遞送，提高藥物的生物利用度，對(duì)藥效發(fā)揮起到重要作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。甘草經(jīng)煎煮后中藥化學(xué)成分子間發(fā)生相互作用，形成甘草SAN，從而發(fā)揮增溶、增效的作用，但粒徑較大且穩(wěn)定性不高的問題有待解決。本研究采用微沉淀法改良傳統(tǒng)湯劑的自組裝過程，系統(tǒng)地對(duì)新型納米粒GN-SAN及傳統(tǒng)水煎煮SAN進(jìn)行了比較，研究表明所形成的新型納米粒GN-SAN粒徑遠(yuǎn)小于GD-SAN，且大小均一，呈現(xiàn)圓球型結(jié)構(gòu)，其ζ電位高于GD-SAN，穩(wěn)定性增強(qiáng)。新型納米粒GN-SAN的有效成分轉(zhuǎn)移率均大于GD-SAN，其中黃酮類小分子成分的轉(zhuǎn)移率顯著提升，異甘草苷的轉(zhuǎn)移率在GN-SAN中可達(dá)到92.6%，是GD-SAN的1.33倍；甘草查耳酮A的轉(zhuǎn)移率是GD-SAN的7.8倍。新型GN-SAN有效改善了傳統(tǒng)湯劑自組裝納米粒粒徑大、不穩(wěn)定以及轉(zhuǎn)移率不高的問題。藥效實(shí)驗(yàn)顯示，與模型組相比，氫化可的松組、SAN凝膠各劑量組PASI評(píng)分、炎癥因子含量、脾臟指數(shù)均顯著降低（＜0.05）。且SAN組各項(xiàng)指標(biāo)顯示，SAN凝膠高劑量組略優(yōu)于低、中劑量組。皮損病理變化結(jié)果顯示，氫化可的松組和SAN各劑量組表皮厚度降低，表皮突起下延、炎性細(xì)胞浸潤及毛細(xì)血管增生減少。可見甘草SAN凝膠對(duì)DNCB誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎小鼠具有顯著的治療作用，并且有劑量依賴性。本研究在甘草提取物的基礎(chǔ)上，改良了傳統(tǒng)湯劑自組裝過程，優(yōu)化GN-SAN的制備工藝，提高了中藥SAN的穩(wěn)定性及難溶性成分轉(zhuǎn)移率，對(duì)其進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)及初步作用機(jī)制探討。為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的高效利用提供了制劑學(xué)思路。對(duì)于GN-SAN具體的形成機(jī)制及體內(nèi)過程，有待進(jìn)一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Formation of novel self-assembled nanoparticles ofand anti-inflammatory evaluation

MENG Yuting1, 2, XUE Yuye2, LIU Yan1,2, WANG Zhiruo2, GAO Cuiyun2, HANG Lingyu2, YUAN Hailong1, 2

1. School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230032, China 2. Department of Pharmacy, Air Force Medical Center, Air Force Medical University, PLA, Beijing 100142, China

To refine the traditional decoction self-assembly phenomenon, thenovel self-assembled nanoparticles (GN-SAN) were constructed by microprecipitation method, and compared withdecoction self-assembled nanoparticles (GD-SAN) in detail, and to further explore the therapeutic effect of GN-SAN on 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB)-induced atopic dermatitis in mice.GN-SAN was prepared by decoction combined with microprecipitation, and the particle size, PDI and ζ potential were used as evaluation indexes, and the decoction time, magnetic stirring speed, magnetic stirring time, magnetic stirring temperature, rotary steaming temperature and mass concentration of raw materials were optimized by single factor test combined with Box-Behnken design-response surface method, and the optimal prescription process was screened. Compare the optimized GN-SAN with GD-SAN, the morphology of SAN was observed by scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM), and the contents of small molecule active components (liquiritin apioside, liquiritin, isoliquiritin apioside, isoliquiritin, glycyrrhetinic acid, licochalcone A), polysaccharides and proteins were detected by high-performance liquid chromatography (HPLC), ultraviolet spectrophotometer (UV) and bicinchoninic acid (BCA) kit. DNCB was used to stimulate the dorsal skin of mice, and an atopic dermatitis model was established. The mice were divided into blank group, model group, positive drug group, GN-SAN gel low, medium and high dose groups, and the changes of skin lesions on the back of the mice were observed, and the histopathological changes, inflammatory factor expression, organ index and other indicators of skin lesions were detected.The optimal prescription process of GN-SAN was as follows:was decocted with 8 times the amount of water for 1 h to obtain the GD-SAN. After decoction of 6 times of 70% ethanol for 1 h, the alcohol extract was obtained. Combining the two extracts, stirring magnetically at 600 r/min for 20 min, removing alcohol by rotary evaporation at 60 ℃ and concentrating to 0.2 g/mL to obtain GN-SAN. The formed SAN is a stable spherical nanoparticle with a morphological homogeneous particle size of (189.5 ± 0.3) nm, a polydispersity index of 0.138 ± 0.130, and a ζ potential of (?31.4 ± 0.8) mV. Compared with traditional SAN, the particle size, uniformity, stability and effective component transfer rate were improved, and GN-SAN had a good therapeutic effect on dermatitis.The preparation of GN-SAN by decoction method combined with microprecipitation method is simple and the content of main components is high and stable, and the prepared GN-SAN has excellent performance and significant anti-inflammatory effect, which lays a foundation for the further development and application ofnano-preparations.

Fisch.; self-assembled nanoparticles; Box-Behnken design-response surface method; material basis; atopic dermatitis; antiinflammatory;microprecipitation method; liquiritin apioside; liquiritin; isoliquiritin apioside; isoliquiritin; glycyrrhetinic acid; licochalcone A; polysaccharides; proteins

R283.6

A

0253 - 2670(2024)09 - 2912 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.006

2023-11-26

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（82174074）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81873092）；優(yōu)秀青年人才項(xiàng)目（22YXQN027）

孟雨婷，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹W(xué)。E-mail: uoouooy@163.com

通信作者：袁海龍，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮滦徒o藥系統(tǒng)。E-mail: yhlpharm@ 126.com

杭凌宇，博士，研究方向?yàn)橹兴幮滦徒o藥系統(tǒng)。E-mail: 445914871@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]