丁歡歡，姜先梅，劉紅梅，齊 瑤，涂柯蓉，陳 琳，蔡璐璐*，周先禮*

·藥劑與工藝·

藤黃酸和雷帕霉素共載脂質(zhì)體的制備及協(xié)同抗腫瘤活性研究

丁歡歡1, 2，姜先梅2, 3，劉紅梅2, 3，齊 瑤2, 3，涂柯蓉2, 3，陳 琳1，蔡璐璐2, 3*，周先禮1*

1. 西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031 2. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，藥學(xué)部，四川 成都 610072 3. 電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072

制備共載藤黃酸和雷帕霉素的脂質(zhì)體（liposomes co-loaded with gambogic acid and rapamycin，GR@Lip）并優(yōu)化其處方，研究GR@Lip的體外抗腫瘤機(jī)制、體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和生物分布。以包封率、載藥量及粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)篩選GR@Lip的最佳處方，并對(duì)其進(jìn)行表征和穩(wěn)定性研究；通過(guò)CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)考察GR@Lip對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell實(shí)驗(yàn)考察GR@Lip對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲的影響，透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）和免疫熒光考察GR@Lip對(duì)腫瘤細(xì)胞自噬的影響，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromotography with mass spectrometry，LC-MS）和活體成像儀研究GR@Lip的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和生物分布。GR@Lip的最佳處方為制備溫度40 ℃，藥脂比1∶1∶20，磷脂與膽固醇比例4∶1，超聲功率195 W，超聲時(shí)間5 min，水化介質(zhì)為超純水，水相pH值為7.1；該方法制備的GR@Lip藤黃酸包封率為（97.27±2.76）%，雷帕霉素包封率為（96.58±3.82）%，藤黃酸載藥量為（3.29±0.44）%，雷帕霉素載藥量為（4.91±0.44）%。TEM形態(tài)觀察顯示GR@Lip呈球形，動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）檢測(cè)其平均粒徑為（157.19±1.74）nm、ζ電位為（?22.1±1.3）mV，且具有良好的穩(wěn)定性。體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藤黃酸和雷帕霉素聯(lián)用能協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)自噬。此外，體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和生物分布結(jié)果顯示，GR@Lip可在體內(nèi)滯留更長(zhǎng)時(shí)間且具有良好的腫瘤靶向性。成功制備了GR@Lip，揭示其具有通過(guò)多途徑協(xié)同抗腫瘤的活性，并顯著改善了藤黃酸和雷帕霉素的藥動(dòng)學(xué)行為，為進(jìn)一步體內(nèi)研究和未來(lái)臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

藤黃酸；雷帕霉素；共載脂質(zhì)體；抗腫瘤；聯(lián)合用藥；體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)；生物分布；增殖；凋亡；遷移；浸襲；自噬

惡性腫瘤是全球范圍的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。化療作為治療惡性腫瘤的重要手段之一，為腫瘤患者的生命健康做出了巨大的貢獻(xiàn)。雷帕霉素是雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的天然抑制劑，已被FDA批準(zhǔn)用于治療腎癌，其衍生物已用于腦腫瘤、胰腺癌和乳腺癌等的治療。由于腫瘤病理機(jī)制復(fù)雜多元，僅依靠單一抗腫瘤機(jī)制的藥物治療很難獲益。因此，探尋創(chuàng)新型高效低毒的藥物聯(lián)用模式已成為腫瘤治療的有效策略。中藥成分具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑的特點(diǎn)和較低的不良反應(yīng)，與化療藥物聯(lián)用可減輕臨床癥狀、降低不良反應(yīng)、防止耐藥和復(fù)發(fā)[1]，在腫瘤治療中具有巨大前景。藤黃酸是從中藥藤黃中提取的一種天然化合物，可有效抑制多種腫瘤生長(zhǎng)。藤黃酸也被證實(shí)可與化療藥物如多柔比星[2]、吉西他濱[3]等聯(lián)用，協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤療效[4]。因此，本研究旨在探索藤黃酸與雷帕霉素的組合策略是否可以改善腫瘤治療效果，并初步研究其協(xié)同抗癌機(jī)制。

然而，藤黃酸具有水溶性差、刺激性強(qiáng)且選擇性較低的缺點(diǎn)，雷帕霉素難溶于水且單用易產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致臨床應(yīng)用受到嚴(yán)重阻礙，基于納米技術(shù)的藥物共遞送系統(tǒng)在解決上述缺陷方面表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)[5]。研究顯示，多藥共載納米制劑可在保持藥物活性的同時(shí)顯著增強(qiáng)療效[6]。脂質(zhì)體作為目前研發(fā)比較成熟的裝載疏水性藥物的制劑，其磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)可以更有效地被細(xì)胞攝取，從而提高藥物遞送效能[7-8]。此外，基于脂質(zhì)體的被動(dòng)靶向作用，可以改善藥物在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為，增強(qiáng)腫瘤靶向性。本實(shí)驗(yàn)將藤黃酸和雷帕霉素共載于脂質(zhì)體中，通過(guò)單因素和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)處方工藝進(jìn)行優(yōu)化，研究其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲以及自噬的影響，并進(jìn)一步研究其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和生物分布，初步探索雙藥共載脂質(zhì)體的抗腫瘤作用機(jī)制，以期為藤黃酸臨床制劑的應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

XSE205型分析天平，梅特勒托利多儀器有限公司；RE-2010型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，成都康宇科技有限公司；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；WB-2000型水浴鍋，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SM-650A型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司；Litesizer 500型納米粒徑及Zeta電位分析儀，安東帕（上海）商貿(mào)有限公司；HT7820型低電壓透射電子顯微鏡（TEM），日本日立公司；Agilent 1260型高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)安捷倫公司；色譜柱Sun Fire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國(guó)Waters公司；SB25-12DTD型超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；i-Pure Pro2智能型純水/超純水機(jī)，杭州澤南科技有限公司；FD-1C-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；75004240型離心機(jī)，百樂(lè)科技有限公司；Herocell 240型二氧化碳培養(yǎng)箱，上海潤(rùn)度生物科技有限公司；Epoch2型酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；ICX41型生物顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；NovoCyte 2070R型流式細(xì)胞儀，安捷倫科技有限公司；AniView 100型多模式動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，廣州博鷺騰生物科技有限公司；AB Sciex Qtrap 5500型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司。

1.2 材料

藤黃酸，批號(hào)20210122，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，南京康滿林化工實(shí)業(yè)有限公司；藤黃酸對(duì)照品，批號(hào)M0802AS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%，大連美侖生物技術(shù)有限公司；卵磷脂（批號(hào)C14422665）、雷帕霉素（批號(hào)c12477612，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%），上海麥克林生化科技有限公司；雷帕霉素對(duì)照品，批號(hào)J17GB155257，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，上海源葉生物科技有限公司；和厚樸酚對(duì)照品，批號(hào)20221027，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院；子囊霉素對(duì)照品，批號(hào)PR230820-29，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.3%，廣州亮化化工有限公司；吲哚菁綠（indocyanine green，ICG），批號(hào)22Z144-D1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；膽固醇，批號(hào)B80859，艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司；無(wú)水乙醇，分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；甲醇，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；乙腈，色譜純，Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；冰乙酸，色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基，批號(hào)812338、8122762，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶，批號(hào)H20051277、SS1059，美國(guó)Gibco公司；CCK-8（批號(hào)CR2310019）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)23314817），武漢賽維爾生物科技有限公司。

小鼠胰腺癌Pan02細(xì)胞和小鼠宮頸癌U14細(xì)胞均購(gòu)自武漢華爾納生物科技有限公司，批號(hào)分別為SAc0135和CTCC-400-0316；小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，批號(hào)250362。Balb/c小鼠，雌性，5～6周齡，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量合格證編號(hào)為110324241101832765。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在同一環(huán)境下，環(huán)境溫度為（24.0±1.0）℃，相對(duì)濕度維持在55%～65%。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 藤黃酸與雷帕霉素聯(lián)用比例的篩選

通過(guò)CCK8法測(cè)定藤黃酸、雷帕霉素及不同聯(lián)用比例對(duì)4T1細(xì)胞的增殖毒性，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種在96孔板中，孵育24 h后棄去舊培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量濃度的藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后加入CCK-8增殖檢測(cè)試劑，37 ℃孵育2 h后，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（），并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50，單位為μg/mL）及聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI，CI＝A/IC,A＋B/IC,B）。其中，A和B代表2種不同藥物，IC,A和IC,B是表示A、B 2種藥物單獨(dú)使用使生長(zhǎng)抑制率達(dá)時(shí)的藥物質(zhì)量濃度，A和B是A藥和B藥聯(lián)合使用使生長(zhǎng)抑制率達(dá)時(shí)2種藥物的質(zhì)量濃度）[9]。CI＝1表示加和作用，CI＜1表示協(xié)同作用，CI＞1表示拮抗作用。結(jié)果見(jiàn)表1，當(dāng)藤黃酸與雷帕霉素物質(zhì)的量比為1∶1時(shí)，CI＝0.772＜1，協(xié)同效果最好，因此，后續(xù)選擇該比例制備共載脂質(zhì)體。

表1 藤黃酸與雷帕霉素聯(lián)用比例篩選

2.2 GR@Lip制備方法的考察

2.2.1 薄膜水化法 精密稱取藤黃酸5 mg、雷帕霉素7.28 mg、膽固醇9.23 mg與大豆卵磷脂72.43 mg（藥脂比為物質(zhì)的量比1∶1∶15，磷脂與膽固醇比例為物質(zhì)的量比4∶1），溶于3～5 mL無(wú)水乙醇中，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑，待圓底燒瓶?jī)?nèi)部形成均勻薄膜后，繼續(xù)旋蒸3 h以完全除去殘留溶劑。加入5 mL超純水水化1 h，超聲5 min（195 W），依次過(guò)0.45 μm及0.22 μm濾膜，即可得到GR@Lip。

2.2.2 逆向蒸發(fā)法 精密稱取藤黃酸5 mg、雷帕霉素7.28 mg、膽固醇9.23 mg與大豆卵磷脂72.43 mg（藥脂比為物質(zhì)的量比1∶1∶15，磷脂與膽固醇比例為物質(zhì)的量比4∶1），溶于3 mL氯仿中，加入1 mL超純水，采用功率為195 W的超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲5 min，成乳后蒸發(fā)除去溶劑，加入5 mL超純水水化1 h，超聲5 min（195 W），依次過(guò)0.45 μm及0.22 μm濾膜，即可得到GR@Lip。

2.2.3 乙醇注入法 精密稱取藤黃酸5 mg、雷帕霉素7.28 mg、膽固醇9.23 mg與大豆卵磷脂72.43 mg（藥脂比為物質(zhì)的量比1∶1∶15，磷脂與膽固醇比例為物質(zhì)的量比4∶1），溶于3 mL無(wú)水乙醇中，40 ℃攪拌30 min。5 mL超純水在40 ℃下攪拌30 min，將無(wú)水乙醇溶液緩慢滴入超純水中繼續(xù)攪拌30 min。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，定容至5 mL，超聲5 min（195 W），依次過(guò)0.45、0.22 μm濾膜，即可得到GR@Lip。

2.2.4 考察結(jié)果 結(jié)果如表2所示，與逆向蒸發(fā)法和乙醇注入法相比，薄膜水化法制備得到的脂質(zhì)體包封率最高，載藥量與逆向蒸發(fā)法相近，但高于乙醇注入法，且粒徑最小，表明薄膜水化法更適于制備GR@Lip，因此，后續(xù)選擇薄膜水化法進(jìn)一步優(yōu)化其制備方法。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中通過(guò)薄膜水化法制備空白脂質(zhì)體、藤黃酸脂質(zhì)體（gambogic acid liposomes，GA@Lip）、雷帕霉素脂質(zhì)體（rapamycin liposomes，Rap@Lip）與吲哚菁綠脂質(zhì)體（indocyanine green liposomes，ICG@Lip）。

表2 制備方法考察(, n = 3)

2.3 HPLC法測(cè)定GR@Lip包封率與載藥量分析方法的建立

2.3.1 雷帕霉素、藤黃酸對(duì)照品溶液的配制 精密稱取雷帕霉素對(duì)照品47.72 mg，藤黃酸對(duì)照品32.60 mg，以甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，混勻即得雷帕霉素/藤黃酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，按比例稀釋為所需質(zhì)量濃度。

2.3.2 供試品溶液及空白脂質(zhì)體對(duì)照溶液的配制 精密量取1 mL GR@Lip于量瓶中，加入適量甲醇，振蕩渦旋后用甲醇定容，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。同法配制空白脂質(zhì)體對(duì)照溶液。

2.3.3 色譜條件 色譜柱為Sun Fire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；體積流量1.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)288、361 nm；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相梯度洗脫見(jiàn)表3，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3.4 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取空白脂質(zhì)體溶液、雷帕霉素、藤黃酸對(duì)照品溶液（雷帕霉素119.30 μg/mL、藤黃酸81.50 μg/mL）進(jìn)樣分析。結(jié)果表明雷帕霉素、藤黃酸與相鄰組分分離度均大于1.5，拖尾因子小于1.5，對(duì)照品溶液連續(xù)5次峰面積的RSD小于2.0%，對(duì)照品溶液信噪比（/）大于10，表明方法系統(tǒng)適用性好。

表3 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.3.5 線性關(guān)系考察 取系列雷帕霉素、藤黃酸對(duì)照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以雷帕霉素、藤黃酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），雷帕霉素、藤黃酸的峰面積為縱坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為雷帕霉素＝14.753 4＋16.543 8，2＝0.999 9；藤黃酸＝5.364 7＋2.271 6，2＝0.999 9；結(jié)果表明，雷帕霉素在14.91～357.90 μg/mL，藤黃酸在10.18～244.50 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算日內(nèi)精密度，雷帕霉素日內(nèi)檢測(cè)RSD為0.13%，藤黃酸日內(nèi)檢測(cè)RSD為0.06%，表明方法精密度高。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一批GR@Lip樣品6份，加適量色譜級(jí)甲醇超聲溶解，制得供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣分析并平行測(cè)定3次。GR@Lip中雷帕霉素RSD為1.71%，藤黃酸RSD為1.47%，表明方法重復(fù)性良好。

圖1 雷帕霉素和藤黃酸對(duì)照品(A) 及GR@Lip樣品(B) 的HPLC圖譜

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取低、中、高質(zhì)量濃度雷帕霉素、藤黃酸對(duì)照品儲(chǔ)備液各5 mL，置于不同的10 mL量瓶中，再分別加入空白脂質(zhì)體5 mL，并用色譜級(jí)甲醇定容，平行制備3份，再根據(jù)“2.3.2”項(xiàng)下所述方法配制供試品溶液。按色譜條件進(jìn)樣分析并平行測(cè)定3次，雷帕霉素回收率為（102.99±3.63）%，回收率RSD值為（0.68±0.34）%，藤黃酸回收率為（101.13±0.05）%，回收率RSD值為（0.73±0.28）%，表明方法準(zhǔn)確度高。

2.4 GR@Lip包封率與載藥量的測(cè)定

藤黃酸和雷帕霉素在水中的溶解度均很?。ㄌ冱S酸溶解度約為0.5 μg/mL，雷帕霉素溶解度約為0.26 μg/mL），因此，認(rèn)為游離藥物已在制備過(guò)程中通過(guò)微孔濾膜濾過(guò)去除。精密量取100 μL GR@Lip，另精密稱取一定質(zhì)量的凍干的GR@Lip，分別加入甲醇定容至1 mL進(jìn)行破乳，靜置后，用0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定藤黃酸與雷帕霉素藥物含量。按下列公式分別計(jì)算包封率和載藥量。

包封率＝藥物實(shí)際質(zhì)量/藥物的投入量

載藥量＝藥物實(shí)際質(zhì)量/制劑的總質(zhì)量

2.5 GR@Lip處方工藝優(yōu)化

在文獻(xiàn)調(diào)研及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定以制備溫度（旋蒸及水化時(shí)的溫度）、藥脂比（脂總量代表磷脂與膽固醇總量）、磷脂-膽固醇比例、超聲功率、超聲時(shí)間、水化介質(zhì)及水相pH值作為考察對(duì)象，包封率、載藥量及粒徑作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素考察，并根據(jù)單因素篩選結(jié)果，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，篩選出最佳處方。

2.5.1 單因素考察

（1）制備溫度考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，藥脂比為1∶1∶15，磷脂-膽固醇比例為4∶1，超聲功率195 W，超聲時(shí)間5 min，超純水作為水化介質(zhì)，水相pH值為7.1的條件下，考察不同溫度對(duì)包封率、載藥量及粒徑的影響。結(jié)果見(jiàn)表4，隨著溫度升高，包封率和載藥量呈先上升后下降的趨勢(shì)，綜合考慮最佳制備溫度為40 ℃，這可能是由于溫度較低時(shí)無(wú)法引發(fā)磷脂相變，溫度過(guò)高時(shí)影響磷脂穩(wěn)定性造成的[10]。

表4 制備溫度的考察(, n = 3)

（2）藥脂比考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，溫度為40 ℃，磷脂-膽固醇比例為4∶1，超聲功率195 W，超聲時(shí)間5 min，超純水作為水化介質(zhì)，水相pH值為7.1的條件下，考察藥脂比對(duì)GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響。結(jié)果見(jiàn)表5，隨著脂質(zhì)用量的增加，藤黃酸和雷帕霉素的包封率逐漸增加，藤黃酸的載藥量呈逐漸下降趨勢(shì)，而雷帕霉素的載藥量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，不同藥脂比制得的脂質(zhì)體粒徑均小于200 nm，綜合考慮最佳藥脂比為1∶1∶20。這是由于增加脂質(zhì)用量有利于增加包封率，但脂質(zhì)用量較多時(shí)會(huì)降低載藥量[11]。

（3）磷脂與膽固醇比例考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，溫度為40 ℃，藥脂比為1∶1∶20，超聲功率195 W，超聲時(shí)間5 min，超純水作為水化介質(zhì)，水相pH值為7.1的條件下，考察藥脂比對(duì)GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響。結(jié)果見(jiàn)表6，隨著磷脂比例的增加，藤黃酸和雷帕霉素的包封率略有下降，載藥量先增加后下降，粒徑逐漸增加，但均小于200 nm，綜合考慮磷脂與膽固醇的最佳比例為4∶1。

表5 藥脂比考察(, n = 3)

（4）超聲功率考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，溫度為40 ℃，藥脂比為1∶1∶20，磷脂與膽固醇比例4∶1，超聲時(shí)間5 min，超純水作為水化介質(zhì)，水相pH值為7.1的條件下，考察超聲功率對(duì)GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響。結(jié)果見(jiàn)表7，隨著功率的增加，藤黃酸和雷帕霉素的包封率和載藥量逐漸增加，粒徑逐漸減小。綜合考慮，確定超聲功率為195 W。

表6 磷脂與膽固醇比例考察(, n = 3)

表7 超聲功率考察(, n = 3)

（5）超聲時(shí)間考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，溫度為40 ℃，藥脂比為1∶1∶20，磷脂與膽固醇比例4∶1，超聲時(shí)間功率195 W，超純水作為水化介質(zhì)，水相pH值為7.1的條件下，考察超聲時(shí)間對(duì)GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響。結(jié)果見(jiàn)表8，隨著超聲時(shí)間的增加，藤黃酸和雷帕霉素的載藥量和粒徑逐漸減小，這可能是由于過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲破壞了GR@Lip。超聲5 min時(shí)的包封率、載藥量及粒徑均較為理想。綜合考慮，確定超聲時(shí)間為5 min。

表8 超聲時(shí)間考察(, n = 3)

（6）水化介質(zhì)考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，溫度為40 ℃，藥脂比為1∶1∶20，磷脂與膽固醇比例4∶1，超聲時(shí)間功率195 W，超聲時(shí)間5 min，水相pH值為7.1的條件下，考察水化介質(zhì)對(duì)GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響。結(jié)果見(jiàn)表9，選擇超純水作為水化介質(zhì)時(shí)，包封率及載藥量均明顯優(yōu)于PBS和生理鹽水，且粒徑較小。此外，生理鹽水作為水化介質(zhì)時(shí)，靜置數(shù)小時(shí)便析出沉淀，表明其穩(wěn)定性較差。綜合考慮，確定超純水作為水化介質(zhì)。

（7）水相pH值考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，溫度為40 ℃，藥脂比為1∶1∶20，磷脂與膽固醇比例4∶1，超聲時(shí)間功率195 W，超聲時(shí)間5 min，超純水作為水化介質(zhì)的條件下，考察水相pH值對(duì)GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響。結(jié)果見(jiàn)表10，當(dāng)水化介質(zhì)呈弱酸性和近中性時(shí)，包封率及載藥量均較高，呈弱堿性時(shí)略低，這可能是因?yàn)樘冱S酸呈酸性，在堿性溶液中不穩(wěn)定。在弱酸性條件下，共載脂質(zhì)體的粒徑略大。綜合考慮，確定水相pH值為7.1。

表9 水化介質(zhì)考察(, n = 3)

表10 水相pH值考察(, n = 3)

2.5.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn) 綜合比較單因素實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果，選擇對(duì)包封率和載藥量影響較為顯著的3個(gè)因素，即制備溫度（A）、藥脂比（B）、磷脂-膽固醇比例（C）作為正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的主要影響因素，其他因素采用單因素考察的最佳結(jié)果，確定超聲功率為195 W，超聲時(shí)間為5 min，水化介質(zhì)為超純水，水相pH為7.1。在3個(gè)主要因素水平上以藤黃酸包封率（1）、雷帕霉素包封率（2）、藤黃酸載藥量（3）、雷帕霉素載藥量（4）及粒徑（5）作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，篩選出最優(yōu)處方，正交因素設(shè)計(jì)水平見(jiàn)表11。

本研究因有多個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，故采用綜合評(píng)分法。通過(guò)SPSS AUA分析軟件確定藤黃酸包封率（1）、雷帕霉素包封率（2）、藤黃酸載藥量（3）、雷帕霉素載藥量（4）及粒徑（5）權(quán)重分別為20.10%、18.81%、18.22%、17.59%和25.27%，進(jìn)行綜合評(píng)分。正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表11，方差結(jié)果見(jiàn)表12。極差為A＞B＞C，說(shuō)明A因素的影響最大，即制備溫度，其次是藥脂比，磷脂與膽固醇的比例的影響較小，最佳制備工藝為A1B2C2，即GR@Lip的最優(yōu)處方為制備溫度40 ℃，藥脂比1∶1∶20，磷脂與膽固醇比例4∶1。

表11 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表12 方差結(jié)果分析

2.5.3 處方驗(yàn)證 根據(jù)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，篩選出最優(yōu)處方并平行制備3組，測(cè)定其包封率、載藥量及粒徑，對(duì)處方工藝進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，GR@Lip中藤黃酸包封率為（97.27±2.76）%，雷帕霉素包封率為（96.58±3.82）%，藤黃酸載藥量為（3.29±0.44）%，雷帕霉素載藥量為（4.91±0.44）%，平均粒徑為（157.19±1.74）nm，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 GR@Lip的表征及穩(wěn)定性

2.6.1 表征 通過(guò)納米粒徑及ζ電位分析儀測(cè)定GR@Lip的粒徑和ζ電位，采用TEM對(duì)GR@Lip進(jìn)行形貌表征，考察GR@Lip在4 ℃條件下放置1個(gè)月的粒徑和PDI變化情況。結(jié)果見(jiàn)圖2和表13，GR@Lip的平均粒徑為（157.19±1.74）nm，PDI為0.224±0.033，ζ電位為（?22.1±1.3）mV。TEM圖像顯示，共載藥脂質(zhì)體呈球形形態(tài)，在4 ℃條件下放置1個(gè)月粒徑及PDI均無(wú)明顯變化，表明脂質(zhì)體的粒徑具有良好的穩(wěn)定性。

2.6.2 穩(wěn)定性

（1）包封率及滲漏率的測(cè)定：將制備得到的GR@Lip放置于在4 ℃條件下，每3天通過(guò)HPLC測(cè)定包封率，并計(jì)算滲漏率（滲漏率＝1－儲(chǔ)存過(guò)程中測(cè)得的藥物包封率/第0天測(cè)得的藥物包封率）。結(jié)果如表14所示，隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，脂質(zhì)體存在一定程度的泄露，但儲(chǔ)存15 d包封率仍大于80%，符合脂質(zhì)體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

（2）氧化產(chǎn)物的測(cè)定：磷脂氧化程度是脂質(zhì)體穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，本研究采用氧化產(chǎn)物評(píng)價(jià)磷脂的氧化程度。由于磷脂中含不飽和類脂，可被氧化為共軛二烯，形成過(guò)氧化脂質(zhì)，進(jìn)一步分解為丙二醛及溶血磷脂。丙二醛在酸性條件下與硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）反應(yīng)生成一種紅色染料（TBA-pigment），在532 nm處有最大吸收峰，吸光度（）值大小可以反映磷脂的氧化程度。因此，將制備得到的GR@Lip放置于在4 ℃條件下，每3天通過(guò)丙二醛檢測(cè)試劑盒測(cè)定532 nm處的值。結(jié)果如表15所示，GR@Lip在15 d內(nèi)值無(wú)明顯變化，表明脂質(zhì)體具有良好的穩(wěn)定性。

圖2 GR@Lip的粒徑分布(A)、ζ電位(B) 和TEM圖(C)

表13 粒徑穩(wěn)定性結(jié)果(, n = 3)

表14 包封率及滲漏率測(cè)定結(jié)果(, n = 3)

表15 氧化產(chǎn)物測(cè)定結(jié)果(, n = 3)

2.7 體外抗腫瘤活性

2.7.1 細(xì)胞增殖毒性檢測(cè) 通過(guò)CCK-8法測(cè)定GR@ Lip對(duì)3種不同癌細(xì)胞的增殖毒性，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Pan02、U14及4T1細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種在96孔板中，孵育24 h后棄去舊培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量濃度的脂質(zhì)體（GA@Lip、Rap@Lip、GR@ Lip）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后加入CCK-8增殖檢測(cè)試劑，37 ℃孵育2 h后，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的值，并計(jì)算IC50及CI。結(jié)果如表16所示，與GA@Lip組和Rap@Lip組相比，GR@Lip處理后3種癌細(xì)胞的IC50均顯著降低，分別為（0.37＋0.54）、（0.54＋0.78）、（0.34＋0.48）μg/mL。此外，GR@Lip對(duì)Pan02、U14及4T1細(xì)胞的CI值分別為0.65±0.01、0.96±0.02、0.86±0.01，均小于1，表明藤黃酸與雷帕霉素聯(lián)用具有協(xié)同作用。

表16 IC50及CI值計(jì)算結(jié)果(, n = 3)

2.7.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Pan02、U14及4T1細(xì)胞以6×106個(gè)/孔接種在6孔板中，孵育24 h后棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗滌。加入藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用PBS清洗后消化細(xì)胞，離心，收集細(xì)胞。加入500 μL的binding buffer（1×）重懸細(xì)胞，加入2.5 μL的Annexin-V-FITC和2.5 μL的PI染色液輕輕混勻染色，避光孵育15 min后置于冰上，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖3和表17，在Pan02、U14及4T1細(xì)胞中，與對(duì)照組的凋亡率［（4.20±0.42）%、（4.03±0.46）%、（1.95±0.30）%］及單藥組的凋亡率［GA@Lip：（22.24±0.22）%、（9.28±0.35）%、（15.45±1.79）%；Rap@Lip： （13.38±0.76）%、（11.95±0.42）%、（0.52±0.13）%］相比，GR@Lip的凋亡率分別為（32.56±1.44）%、（22.15±0.44）%和（25.62±1.58）%，均顯著高于其他3組，表明藤黃酸與雷帕霉素聯(lián)用具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用。

圖3 GR@Lip對(duì)Pan02 (A)、U14 (B) 及4T1 (C) 細(xì)胞凋亡的影響

表17 細(xì)胞凋亡分析(, n = 3)

與對(duì)照組比較：***＜0.001。

***< 0.001control group.

2.7.3 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)研究對(duì)細(xì)胞遷移的影響，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Pan02、U14及4T1細(xì)胞，以8×106個(gè)/孔接種在12孔板中，孵育24 h后棄去舊培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞后，采用200 μL移液槍槍頭在單層細(xì)胞上劃一字劃痕，PBS清洗，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，記錄為0 h。隨后加入藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS清洗1次后，在倒置熒光顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞的遷移情況。使用Image J軟件分析劃痕面積，并計(jì)算遷移率［遷移率＝(0 h劃痕面積－24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積］。結(jié)果見(jiàn)圖4和表18，在無(wú)藥物干預(yù)的情況下，左右兩側(cè)細(xì)胞逐漸向中間劃痕區(qū)域靠攏，Pan02、U14及4T1細(xì)胞的遷移率達(dá)到（51.86±2.35）%、（29.37±8.57）%和（46.96±2.94）%，而給藥組向劃痕區(qū)域遷移情況均受到一定程度抑制，尤其給予GR@Lip后，各組細(xì)胞遷移率分別降至（3.21±1.01）%、（5.98±2.69）%和（12.39±6.43）%，且顯著低于單藥組，表明藤黃酸與雷帕霉素聯(lián)用具有協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用。

圖4 GR@Lip對(duì)Pan02 (A)、U14 (B) 及4T1 (C) 細(xì)胞遷移的影響

表18 細(xì)胞遷移分析(, n = 3)

與對(duì)照組比較：**＜0.01***＜0.001。

**< 0.01***< 0.001control group.

2.7.4 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞侵襲的影響，將Matrigel基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)基，分別按1∶8、1∶12、1∶14的比例進(jìn)行稀釋，以100 μL/孔加到Transwell上室中，置于培養(yǎng)箱中恒溫孵育5 h至其完全凝固。吸去多余液體，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Pan02、U14及4T1細(xì)胞分別以2×104、5×104、6×104個(gè)/孔接種于Transwell上室，并加入100 μL含藥無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加入750 μL的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去Transwell上室的培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌，0.5%結(jié)晶紫染色5 min。染色結(jié)束后，PBS漂洗3次，自然晾干，于顯微鏡下選取隨機(jī)視野，觀察并拍照。結(jié)果見(jiàn)圖5，與對(duì)照組相比，給藥組穿過(guò)Transwell小室聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，其中GR@Lip組細(xì)胞數(shù)量最少，表明藤黃酸與雷帕霉素聯(lián)用可以發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的協(xié)同作用。

圖5 GR@Lip對(duì)Pan02 (A)、U14 (B) 及4T1 (C) 細(xì)胞侵襲的影響

2.7.5 自噬小體檢測(cè) 通過(guò)TEM觀察GR@Lip對(duì)誘導(dǎo)自噬的影響。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Pan02、U14及4T1細(xì)胞以1.5×106個(gè)/孔接種在60 mm培養(yǎng)皿中，孵育24 h后棄去舊培養(yǎng)基，PBS清洗，加入藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h。除去舊培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，用胰酶消化，收集細(xì)胞懸液至15 mL離心管中，1 500 r/min離心（離心半徑為16.8 cm）10 min，棄去上清。

加入0.5%戊二醛固定液重懸，4 ℃靜置10 min， 12 000 r/min離心（離心半徑為8.6 cm）15 min，棄去上清。加入3%戊二醛固定液固定，1%四氧化鋨進(jìn)行再固定，丙酮逐級(jí)脫水，Epon812包埋，半薄切片用甲苯胺藍(lán)染色作光學(xué)定位，用鉆石刀作超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色后通過(guò)透射電鏡觀察并拍照。結(jié)果見(jiàn)圖6，與對(duì)照組相比，藥物干預(yù)后各組均可觀察到自噬小體的產(chǎn)生（紅色箭頭），其中GR@Lip組自噬小體數(shù)量最多，表明藤黃酸與雷帕霉素聯(lián)用可以協(xié)同增強(qiáng)自噬。

圖6 GR@Lip對(duì)Pan02 (A)、U14 (B) 及4T1 (C) 自噬小體形成的影響

2.7.6 自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin1的表達(dá) 采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin1的表達(dá)情況。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Pan02、U14及4T1細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種在鋪好細(xì)胞爬片的12孔板中，孵育24 h后棄去舊培養(yǎng)基并用PBS清洗，加入藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定。結(jié)果見(jiàn)圖7，GA@Lip和Rap@Lip處理后，在3種癌細(xì)胞中均可觀察到紅色熒光（LC3B）或綠色熒光（Beclin1）有所增強(qiáng)，表明藤黃酸與雷帕霉素均可激活自噬。同時(shí)，GR@Lip組中紅色熒光和綠色熒光均顯著增強(qiáng)，表明藤黃酸與雷帕霉素聯(lián)合可以協(xié)同誘導(dǎo)自噬。

2.8 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.8.1 給藥方案與樣品處理 Balb/c小鼠購(gòu)進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白組、游離藤黃酸組4 mg/kg、游離雷帕霉素組6 mg/kg、GR@Lip組（4＋6）mg/kg，尾靜脈給藥1次后，分別于0.25、0.50、2.00、4.00、8.00、12.00、24.00 h通過(guò)小鼠眼球取血，3 500 r/min離心15 min（離心半徑為8.6 cm），取上層血漿于?80 ℃保存。

2.8.2 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液與對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制 精密稱取內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和厚樸酚、子囊霉素和對(duì)照品藤黃酸、雷帕霉素各5 mg，于10 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)儲(chǔ)備液和對(duì)照品儲(chǔ)備液。

（1）內(nèi)標(biāo)溶液配制：精密量取和厚樸酚內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液20 μL、子囊霉素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液20 μL到960 μL乙腈中，混勻，再移取50 μL到24.95 mL乙腈中，配制成20 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃貯存。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：精密量取藤黃酸和雷帕霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別用乙腈稀釋為1 000、400、100、40、10、4、1 ng/mL，作為對(duì)照品溶液。按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以雷帕霉素、藤黃酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），以雷帕霉素、藤黃酸峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比值為縱坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為雷帕霉素＝8 798.467 5＋ 5 691.288 7，2＝0.992 0；藤黃酸＝23 967.095 9－11 876.545 8，2＝0.994 7。

2.8.3 色譜條件 色譜柱為Waters UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.01%氨水溶液，梯度洗脫：0～1.00 min，40%～90%乙腈；1.00～2.80 min，90%乙腈；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量1 μL；體積流量0.5 mL/min。

2.8.4 質(zhì)譜條件 電離方式：電噴霧離子源，離子源溫度500 ℃，氣簾氣（CUR）137.895 kPa（20 psi），噴霧電壓（IS）?4 500 V，霧化氣（GS1）413.685 kPa（60 psi），加熱氣（GS2）413.685 kPa（60 psi），去簇電壓（DP）?100 V，離子束聚焦電壓（EP）?10 V，碰撞池出口電壓（CXP）?10 V，總掃描時(shí)間0.315 s，監(jiān)測(cè)模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。定量分析的離子反應(yīng)對(duì)為藤黃酸/627.2→583.2，碰撞能?22 V；雷帕霉素/912.6→321.2，碰撞能?49 V。

2.8.5 液質(zhì)聯(lián)用分析 精密量取30 μL待測(cè)血漿樣品，加入120 μL含和厚樸酚和子囊霉素20 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，13 000 r/min離心15 min（離心半徑為8.6 cm），取上清液至進(jìn)樣小瓶，采用上述色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行含量檢測(cè)。

2.8.6 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖8，采用DAS 2.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算分析，得出相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表19。與游離藥物組相比，GR@Lip組中藤黃酸和雷帕霉素的AUC0～t分別是游離藤黃酸和游離雷帕霉素的1.51和1.29倍，AUC0～∞分別是游離藤黃酸和游離雷帕霉素的1.64和1.34倍。

藤黃酸和雷帕霉素的達(dá)峰濃度（max）分別由（27.29±4.61）μg/L和（148.19±5.07）μg/L提高至（36.43±1.53）μg/L和（179.69±25.78）μg/L。更重要的是，藤黃酸和雷帕霉素的半衰期1/2分別由3.67 h和6.82 h延長(zhǎng)至8.48 h和8.12 h，且平均滯留時(shí)間（MRT0～∞）較游離組也有所延長(zhǎng)。以上結(jié)果表明GR@Lip較游離藥物可在體內(nèi)滯留更長(zhǎng)時(shí)間，具有更高的生物利用率。

2.9 體內(nèi)生物分布

采用熒光染料ICG代替藥物進(jìn)行脂質(zhì)體的體內(nèi)生物分布研究，Balb/c小鼠購(gòu)進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞以3×105個(gè)/100 μL接種于小鼠第2乳腺墊皮下，建立小鼠乳腺癌原位模型。待腫瘤生長(zhǎng)至200 mm3時(shí)，隨機(jī)分為2組，靜脈給予1 μg/mL的ICG Lip與游離ICG，分別于1、2、4、6、8、10、24、48 h置于活體成像儀拍攝。待小鼠體內(nèi)熒光染料完全清除后（大于72 h），再次通過(guò)尾靜脈給予相同劑量的ICG@Lip與游離ICG，于8 h時(shí)處死小鼠，解剖出心、肝、脾、肺、腎及腫瘤組織，采用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行離體成像，分析各組織中ICG的熒光強(qiáng)度。結(jié)果見(jiàn)圖9，隨著時(shí)間的推移，游離ICG組中腫瘤部位的ICG熒光強(qiáng)度逐漸減弱且下降速度較快，24 h時(shí)熒光幾乎完全消失。而ICG@Lip組的ICG熒光強(qiáng)度下降速度相對(duì)緩慢，且從4 h起顯著高于游離ICG組，甚至在48 h時(shí)仍舊保留部分熒光。

圖7 GR@Lip對(duì)Pan02 (A)、U14 (B) 及4T1 (C) 細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin1表達(dá)的影響

圖8 血藥濃度-時(shí)間曲線(, n = 3)

心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織的離體成像結(jié)果顯示，ICG@Lip組在腫瘤部位的熒光明顯強(qiáng)于游離ICG組。上述結(jié)果顯示，與游離ICG相比，ICG@ Lip可更長(zhǎng)時(shí)間富集于腫瘤部位，表明脂質(zhì)體可通過(guò)被動(dòng)靶向改善藥物在體內(nèi)的分布，增強(qiáng)腫瘤靶向性，增加蓄積量，這可能依賴于納米顆粒的高通透性和滯留（enhanced permeability and retention effect，EPR）效應(yīng)。

表19 主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(, n = 3)

與游離雷帕霉素比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001。

*< 0.05**＜0.01***< 0.001free rapamycin.

3 討論

脂質(zhì)體制備方法通常包括溶劑注入法、薄膜水化法和逆向蒸發(fā)法等。本研究首先考察了3種不同制備方法對(duì)GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響，確定薄膜水化法為GR@Lip的最佳制備方法，并進(jìn)一步通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行篩選，得到了最優(yōu)的處方工藝，實(shí)現(xiàn)了2藥的高效包載。然而，薄膜水化法制備所得脂質(zhì)體通常粒徑較大且不均一[12]，影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，而脂質(zhì)體的穩(wěn)定性決定了其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間與到達(dá)作用靶點(diǎn)的藥物量，從而對(duì)藥物的治療效果產(chǎn)生重要影響[13]。因此，在水化后采用超聲破碎方式使脂質(zhì)體的平均粒徑控制在200 nm以內(nèi)，能在30 d內(nèi)維持粒徑和PDI基本不變化，改善了該制備方法的不足，并通過(guò)考察滲漏率和磷脂氧化程度證明了其具有良好的穩(wěn)定性。此外，在藤黃酸檢測(cè)方法[14]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，建立了一種準(zhǔn)確度高、可靠性強(qiáng)的HPLC分析方法，可用于同時(shí)檢測(cè)藤黃酸和雷帕霉素的含量。

A-不同時(shí)間點(diǎn)下荷瘤小鼠的活體熒光圖；B-8 h后離體臟器及腫瘤熒光圖；C-腫瘤部位熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線(, n = 3, *P＜0.05 ***P＜0.001)。

實(shí)體瘤具有高度異質(zhì)性，單一藥物的療效有限，加大藥物劑量易帶來(lái)不良反應(yīng)以及多藥耐藥性等問(wèn)題[15]，聯(lián)合療法可以通過(guò)作用不同通路以及不同靶點(diǎn)，減少耐藥的發(fā)生，并可通過(guò)藥物的協(xié)同作用進(jìn)一步提高藥物療效?；谀[瘤病理復(fù)雜性，抗腫瘤藥物聯(lián)合使用已成為臨床上的主要策略[16]。本研究將天然化合物藤黃酸與mTOR抑制劑雷帕霉素聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了協(xié)同抗胰腺癌、宮頸癌及乳腺癌的作用，與空白對(duì)照及單藥組相比，GR@Lip在誘導(dǎo)凋亡、抑制遷移和侵襲方面均展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。此外，研究表明自噬在控制癌癥的發(fā)生發(fā)展，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌治療反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬已被證明是有效的干預(yù)措施[17]。雷帕霉素作為一種經(jīng)典的自噬激活劑，可負(fù)性調(diào)控PI3K/Akt/ mTOR通路，激活自噬介導(dǎo)的死亡。研究表明，藤黃酸也能夠通過(guò)上調(diào)自噬蛋白Beclin1、Atg和LC3的表達(dá)，誘導(dǎo)自噬小體的形成[18]。

此外，大量證據(jù)表明Akt/mTOR信號(hào)通路的抑制可激活自噬關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Beclin1[19]，這表明藤黃酸可能上調(diào)Beclin1和LC3B的表達(dá)協(xié)同雷帕霉素抑制Akt/mTOR信號(hào)通路，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞自噬。本研究結(jié)果也證實(shí)藤黃酸和雷帕霉素可協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬。有研究報(bào)道，雷帕霉素可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬性凋亡[20]，雷帕霉素單獨(dú)使用時(shí)，腫瘤細(xì)胞僅發(fā)生少量凋亡，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)凋亡率顯著增加。這提示藤黃酸聯(lián)合雷帕霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用可能是通過(guò)協(xié)同增強(qiáng)自噬介導(dǎo)的，但具體機(jī)制需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

綜上，本研究采用薄膜水化法制備藤黃酸和雷帕霉素共載脂質(zhì)體GR@Lip，并進(jìn)行體外抗腫瘤作用、體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)及生物分布研究。結(jié)果表明GR@Lip在胰腺癌、宮頸癌及乳腺癌細(xì)胞模型上可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制遷移和侵襲以及激活自噬等多種途徑發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，與游離藥物相比在體內(nèi)和腫瘤部位可滯留更長(zhǎng)時(shí)間，顯示出用于治療惡性腫瘤的潛力，為后續(xù)體內(nèi)抗腫瘤研究奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation of gambogic acid and rapamycin co-loaded liposomes and study on the synergistic antitumor effect

DING Huanhuan1, 2, JIANG Xianmei2, 3, LIU Hongmei2, 3, QI Yao2, 3, TU Kerong2, 3, CHEN Lin1, CAI Lulu2, 3, ZHOU Xianli1

1. School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China 2. Department of Pharmacy, Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s hospital, Chengdu 610072, China 3. Personalized Drug Therapy Key Laboratory of Sichuan Province, School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 610072, China

To prepare liposomes co-loaded with gambogic acid and rapamycin (GR@Lip), optimize its prescription, perform anti-tumor mechanism research, pharmacokinetics and biodistribution.The entrapment efficiency, drug loading, particle size were used as evaluation indicators. Single factor investigation method and orthogonal design experiments were used to optimize the optimum formulation of GR@Lip, and its characterization and stability were studied. The effects of GR@Lip on the proliferation and apoptosis of tumor cells were investigated by CCK-8 and flow cytometry. The effects of GR@Lip on the migration and invasion of tumour cells were investigated by cell scratching, Transwell. The effects of GR@Lip on the autophagy of tumour cells were investigated by transmission electron microscope (TEM) and immunofluorescence. The effects of GR@Lip on the pharmacokinetics and biodistributionwere investigated by liquid chromotography with mass spectrometry (LC-MS) and living body imager.The optimal conditions were determined as follows: temperature is 40 ℃, ratio of drug to lipid is 1:1:20, the phospholipid-cholesterol ratio is 4:1, ultrasonic power is 195 W, ultrasonic time is 5 min, hydration medium is ultrapure water and aqueous pH value is 7.1. The entrapment efficiency and drug loading of gambogic acid and rapamycin were (97.27 ± 2.76)%, (96.58 ± 3.82)%, (3.29 ± 0.44)% and (4.91 ± 0.44)%, respectively. GR@Lip showed a spherical under TEM with an average particle size of (157.19 ± 1.74) nm, ζ potential was (?22.1 ± 1.3) mV by dynamic light scattering (DLS), and had good stability.anti-tumor activity experiment showed that gambogic acid combination rapamycin can inhibit the proliferation, migration and invasion of tumor cells, and also significantly promote apoptosis and autophagy. In addition, pharmacokinetics and biodistribution resultsshowed that GR@Lip can remain for long time and had good tumor targeting.This study successfully prepare GR@Lip, revealing that it has synergistic anti-tumor activity through multiple pathways, and significantly improving the pharmacokinetic behavior of gambogic acid and rapamycin, providing a basis for furtherresearch and future clinical applications.

gambogic acid; rapamycin; co-loaded liposomes; anti-tumor; drug combination;pharmacokinetics;biodistribution;proliferation; apoptosis; migration; invasion; autophagy

R283.6

A

0253 - 2670(2024)09 - 2896 - 16

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.005

2023-10-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U2230123）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82304969）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82304789）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81972901）；四川省科技項(xiàng)目（2022ZYD0080）；四川省科技項(xiàng)目（2023YFS0110）；四川省科技項(xiàng)目（2023YFS0131）；四川省科技項(xiàng)目（2023YFS0125）；四川省科技項(xiàng)目（2023NSFSC0033）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（2022M710623）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（2022M720670）

丁歡歡，碩士研究生，研究方向?yàn)樗巹W(xué)。E-mail: 2467091987@qq.com

通信作者：周先禮，教授，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail: zhouxl@swjtu.edu.cn

蔡璐璐，教授，研究方向?yàn)槟[瘤靶向藥物制劑研究。E-mail: cailulu@med.uestc.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]