★ 陳靜 熊潤萍 帥品花 黃麗君 鄧文靜（江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南昌 330006）

隨著交通工具及工業(yè)的不斷發(fā)展，脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的發(fā)生率逐年升高［1］，是導致神經(jīng)功能障礙和殘疾的主要疾病之一。目前臨床上治療SCI 主要依靠藥物和外科手術［2］，雖在一定程度上緩解病情，但解決不了病患的根本問題，因此脊髓損傷仍是學者們研究的熱點問題。近年來隨著醫(yī)學的發(fā)展，對脊髓損傷的病理機制研究不斷加深，并且在脊髓損傷的防治過程中更加重視中醫(yī)藥治療SCI 的機制探究［3］。補陽還五湯是治療中樞神經(jīng)損傷疾病的代表方，其中黃芪為君藥，具有補益元氣、促血行、祛瘀通絡的作用［4］。毛蕊異黃酮是黃芪的黃酮類主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗病毒等作用，研究發(fā)現(xiàn)其對脊髓損傷具有潛在治療作用［5］。但毛蕊異黃酮治療脊髓損傷的詳細作用機理尚未明確，值得進一步深入研究。相關研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路與脊髓修復機制緊密相關［6］。本研究通過改良Allen 重物打擊法建立大鼠脊髓損傷模型，觀察脊髓組織中病理情況和p-Akt、gp130、IL-6 蛋白表達，探討毛蕊異黃酮治療脊髓損傷的潛在作用機制。

1 材料

1.1 動物

30只8～10周齡大鼠（SPF級，雌性，200～250 g），購自江西中醫(yī)藥大學實驗動物科技中心，生產(chǎn)許可證SCXK（贛）2018-0003。大鼠飼養(yǎng)于潔凈環(huán)境中，溫度（23±2）℃，濕度40%～70%，自由飲食攝水，12 h光暗交替，所有動物適應性喂養(yǎng)7 d后開始試驗。

1.2 儀器與試劑

毛蕊異黃酮（成都普菲德生物技術有限公司，含量≥98%，批號JOT-10389）；山羊抗兔GAPHD多克隆抗體、gp130 抗體、IL-6 抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；免疫組化試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；DAB 顯色試劑盒（北京中山生物技術有限公司）；熒光顯微鏡、倒置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）。

2 方法

2.1 脊髓損傷模型的建立

采用改良Allen 重物打擊法制備脊髓損傷模型。造模組20 只大鼠均腹腔注射60 mg/kg 氯胺酮麻醉，俯臥位固定大鼠，在背部以T10 為中心，縱向切一3 cm 的小口，充分暴露T10 段脊髓。在T10 脊髓的表面放置一個直徑為3 mm 的圓形薄片，用10 g 的砝碼自由墜落12.5 cm 打擊該墊片，造成T10 段脊髓的沖擊傷，逐層縫合大鼠皮膚。當撞擊脊髓時大鼠出現(xiàn)身體抖動，打擊局部脊髓表面迅速呈瘀紫色，術后雙下肢出現(xiàn)完全癱瘓時視為脊髓損傷模型制備成功。假手術組10 只大鼠只暴露T10段脊髓并不打擊脊髓，其他步驟和造模大鼠相同。

2.2 分組、給藥和術后護理

將30只大鼠分為假手術組10只和造模組20只，造模成功后隨機分為模型組、毛蕊異黃酮組，各10 只。參考文獻［7］，毛蕊異黃酮組每天給予毛蕊異黃酮20 mg/kg，假手術組、模型組每天以等量生理鹽水灌胃，每天2 次；連續(xù)干預5 周。造模結束后，將所有大鼠置于25 ℃的動物房內統(tǒng)一飼養(yǎng)，將墊有鋸末的平板置于大鼠籠中，以吸收排尿及防止肢體或骶部壓瘡，并及時更換。手術結束后人工排尿，2 次/d，各大鼠均連續(xù)排尿2 周，直至大鼠恢復自主排尿時停止。

2.3 行為學觀察

采用雙盲雙人獨立觀察記錄，在術后5 周進行行為學評分，采用改良Tarlov 評分［8］和斜板試驗。改良Tarlov 評分標準：沒有自主性的運動，只限于非反射性的髖、膝關節(jié)運動，0 和1 分；髖、膝、踝3 個關節(jié)的肢體運動，2 分；行走時可主動支撐體重和不協(xié)調步態(tài)或偶爾出現(xiàn)協(xié)調步態(tài)，3 分；活動時呈現(xiàn)前后肢協(xié)調步態(tài)，行動時有趾間關節(jié)的肢體運動，4 分；正常步態(tài)，5 分。斜板試驗：取一塊長方形木板，將2 mm 的橡膠墊墊于木板上，將大鼠頭向前，身體縱軸與斜面板縱軸垂直放置，將木板與水平面之間的角度逐漸增大，直至大鼠在原定位置上剛好可以維持 5 s，將這一個角度稱為傾斜平面臨界角度。

2.4 皮層體感誘發(fā)電位檢測

大鼠麻醉固定后，在腓腸肌中部置入刺激電極，用1.5～4 mA 刺激強度和1.9 Hz 刺激頻率刺激大鼠。在頭頂部中線與冠狀縫交處頭皮下置入記錄電極，在其后方0.5 cm 處置入?yún)⒖茧姌O，將動物尾部用0.9%氯化鈉浸濕并連接地線。于術后5 周用肌電圖誘發(fā)電位儀檢測大鼠的感覺誘發(fā)電位（SEP），觀察皮層體感誘發(fā)電位波潛伏期變化。

2.5 HE 染色觀察脊髓損傷的情況

造模干預5 周后麻醉大鼠并開胸，大鼠心臟用4%多聚甲醛灌注固定，將損傷區(qū)的脊髓組織切取2～3 mm，制成3 μm 的切片。樣本切片經(jīng)過HE 染色后置于顯微鏡下觀察脊髓損傷的情況。

2.6 Western blot 檢測各組大鼠脊髓損傷組織中p-Akt、gp130、IL-6 蛋白表達

處死各組大鼠，取20 mg 脊髓組織，在冰上研磨組織呈粉末狀，將裂解液加入到組織中，制成組織懸液后離心，對蛋白樣本總濃度進行測定。轉移蛋白樣品至PVDF 膜，倒入5%脫脂奶粉，封閉樣品2 h。蛋白樣品中分別加入一抗p-Akt、gp130、IL-6 和內參GAPHD 蛋白（1∶1000），孵育后洗滌蛋白樣品，將二抗（1∶2000）加入到蛋白樣品中，室溫孵育1 h，用ECL 液顯色。用Image J 軟件觀察條帶灰度值并計算蛋白表達。

2.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 毛蕊異黃酮對SCI 大鼠行為學及皮層體感誘發(fā)電位波潛伏期的影響

5 周后，與假手術組比較，模型組中改良Tarlov評分及斜板試驗傾斜角度顯著降低（P＜0.05），皮層體感誘發(fā)電位波潛伏期均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，毛蕊異黃酮干預后改良Tarlov 評分及斜板試驗傾斜角度顯著上升（P＜0.05），皮層體感誘發(fā)電位波潛伏期均顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠改良Tarlov評分、斜板實驗、皮層體感誘發(fā)電位波潛伏時長比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠改良Tarlov評分、斜板實驗、皮層體感誘發(fā)電位波潛伏時長比較（±s，n=10）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

斜板實驗傾斜角度/°組別 改良Tarlov評分/分皮層體感誘發(fā)電位波潛伏期時長/ms假手術組 4.77±0.38 64.38±3.21 17.23±1.12模型組 0.16±0.08* 21.04±0.25* 38.22±2.08*毛蕊異黃酮組 3.21±0.25# 33.82±5.22# 35.23±1.82#

3.2 毛蕊異黃酮對SCI 大鼠損傷組織結構的影響

在5 周時，假手術組見脊髓組織結構清晰，無明顯細胞結構的破壞，灰、白質明顯區(qū)分；模型組脊髓組織結構不清晰，少見完整的細胞結構，灰、白質較難區(qū)分；毛蕊異黃酮組脊髓組織結構較清晰，見少量細胞結構的破壞，灰、白質可區(qū)分。見圖1。

圖1 脊髓損傷HE染色觀察（×100）

3.3 毛蕊異黃酮對SCI 大鼠損傷組織中p-Akt、gp130、IL-6 蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組中p-Akt、gp130、IL-6 蛋白水平顯著上升（P＜0.05）；與模型組比較，毛蕊異黃酮干預后p-Akt、gp130、IL-6 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 Western blot法檢測脊髓損傷組織中p-Akt、gp130、IL-6相對蛋白表達

表2 各組大鼠p-Akt、gp130、IL-6蛋白表達水平比較（±s，n=10）

表2 各組大鼠p-Akt、gp130、IL-6蛋白表達水平比較（±s，n=10）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 IL-6/GAPHD gp130/GAPHD p-Akt/GAPHD假手術組 2.01±0.08 1.63±0.04 0.50±0.03模型組 5.06±0.13* 2.11±0.08* 2.54±0.09*毛蕊異黃酮組 0.53±0.02# 0.73±0.01# 1.07±0.06#

4 討論

目前脊髓損傷的治療與干預措施是基礎和臨床研究的熱點之一［9］，臨床常以手術治療脊髓損傷，但治療效果并不十分理想，且治療費用相對較高，導致患者及家庭難以接受。近年來隨著中醫(yī)學的發(fā)展，對脊髓損傷的病理機制研究不斷加深，并且在脊髓損傷的防治過程中更加重視中醫(yī)藥治療SCI 的機制探究［10-11］。

本實驗結果顯示，毛蕊異黃酮能促進脊髓損傷后大鼠后肢功能的恢復，降低了脊髓損傷后肢皮層體感誘發(fā)電位波潛伏期時長，證明毛蕊異黃酮有利于脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復，與有關研究結果一致［12-13］。

涉及脊髓損傷修復的信號通路及引導因子有多種，PI3K/Akt 信號通路的激活已經(jīng)被證實參與脊髓損傷的發(fā)生發(fā)展［14］。IL-6 作為炎癥細胞分化的重要影響因子，在正常腦組織中表達較少，在神經(jīng)疾病腦組織中高表達較高［15］。并且gp130 作為IL-6 等多種細胞因子的信號傳導鏈，兩者共同參與調節(jié)急性繼發(fā)性SCI［5］。本研究結果表明，毛蕊異黃酮抑制了gp130、IL-6 蛋白表達及PI3K/Akt信號通路磷酸化。究其原因是，脊髓損傷后本身可以釋放出一些能夠將具有多種細胞因子的信號傳導鏈，如gp130、IL-6 等受體，經(jīng)過其磷酸化以后會特異性結合信號通路的調節(jié)亞基，從而將激活細胞信號通路。本研究發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮抑制脊髓損傷組織gp130、IL-6 的表達，進一步說明毛蕊異黃酮可能通過PI3K/Akt 信號通路降低脊髓損傷區(qū)域炎癥反應，從而改善脊髓功能。

綜上所述，毛蕊異黃酮通過PI3K/Akt 信號通路恢復脊髓神經(jīng)功能，為臨床治療脊髓損傷提供實驗和理論依據(jù)。