★ 洪石希 楊思 楊輝 張浩朗 張芹 鐘瀾 王俊軍 熊耀坤（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004）

脂溢性脫發(fā)又稱雄激素源性脫發(fā)，臨床表現(xiàn)為頭皮油脂增多、頭皮屑大量形成、前額和頭頂頭發(fā)逐漸脫落，在男性中的發(fā)病率高達(dá)23.0%，占脫發(fā)總?cè)藬?shù)的84.8%［1-2］。其病機(jī)主要由雄激素及其受體異常引起，也與微生物感染、遺傳和心理等因素有關(guān)［3-6］；由糠秕馬拉色菌屬、痤瘡丙酸桿菌屬、金黃色葡萄球菌等屬引起的炎癥已成為脂溢性脫發(fā)發(fā)生的第三大因素［7-8］。中藥精油是一種天然綠色的植物芳香性物質(zhì)，具有廣譜抑菌、抗炎、抗病毒等作用［9-11］，其用于預(yù)防和治療由細(xì)菌引起相關(guān)疾病的作用正在被逐步研究。此外，薄荷精油和薰衣草精油還被發(fā)現(xiàn)具有促生發(fā)作用［12］。本實(shí)驗(yàn)選用具有廣譜抑菌的艾葉精油、肉桂精油、生姜精油和薄荷精油制成艾葉復(fù)方精油乳，研究其對(duì)脂溢性脫發(fā)相關(guān)致病菌的抑制作用，為中藥精油治療脂溢性脫發(fā)提供更多解決方法及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

艾葉油、生姜油（上海麥克林生化科技有限公司）；肉桂油、薄荷精油（廣州唐穗科技有限公司）；吐溫-80（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；MH肉湯培養(yǎng)基、MH 瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂粉（青島海博生物技術(shù)有限公司）；液體硫乙醇酸鹽（FT）培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；青霉素藥敏紙片（溫州康泰藥物原料有限公司）；金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌、痤瘡丙酸桿菌（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）。

FA2004N 電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），DSX-280B 手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安器械廠）；立式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海丙林電子科技有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司）；Medium-E400UF 實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 艾葉復(fù)方精油乳的制備 稱取艾葉油40.0 mg、薄荷油60.0 mg、肉桂油80.0 mg、生姜油60.0 mg、吐溫-80 185.0 mg 研磨混勻，加入18.1 mL 蒸餾水超聲混合均勻，即得濃度為13.0 mg/mL 的艾葉復(fù)方精油乳，備用。

1.2.2 菌種的活化 無菌移液槍吸取0.5 mL MH肉湯培養(yǎng)基，滴入金黃色葡萄球菌凍干粉安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。吸取全部菌體懸浮液，移植于MH 瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。連續(xù)培養(yǎng)至第三代，挑取2～3 個(gè)菌落轉(zhuǎn)入MH 肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用平板計(jì)數(shù)法確定細(xì)菌濃度，保存?zhèn)溆谩?/p>

無菌移液槍吸取0.5 mL MH 肉湯培養(yǎng)基，滴入糠秕馬拉色菌凍干粉安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。吸取全部菌體懸浮液，移植于MH 瓊脂培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。連續(xù)培養(yǎng)至第三代，挑取2～3 個(gè)菌落轉(zhuǎn)入MH 肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用平板計(jì)數(shù)法確定細(xì)菌濃度，保存?zhèn)溆谩?/p>

無菌移液槍吸取 1 mL FT 培養(yǎng)基，滴入痤瘡丙酸桿菌凍干粉安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。吸取全部菌體懸浮液，移植于10 mL 已滅菌FT 培養(yǎng)基中，搖勻，使用封口膜封口，置于厭氧袋中37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)72 h。連續(xù)培養(yǎng)至第三代，使用平板計(jì)數(shù)法確定細(xì)菌濃度，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抑菌圈的測(cè)定——牛津杯法 使用PBS 溶液稀釋供試菌溶液，制成 1×106CFU/mL 的細(xì)菌懸液，取各種細(xì)菌懸液100 μL 于培養(yǎng)皿平板上，涂布均勻。用鑷子夾取2 個(gè)牛津杯放入培養(yǎng)皿中，輕輕按壓，使牛津杯和培養(yǎng)基表面接觸緊實(shí)。吸取100 μL 艾葉復(fù)方精油乳加入牛津杯中，另一牛津杯中加入100 μL 1%吐溫-80 作為陰性對(duì)照，并以藥敏試紙作為陽性對(duì)照，每組平行實(shí)驗(yàn)3 次。金黃色葡萄球菌組37 ℃ 恒溫培養(yǎng)18 h 后觀察；糠秕馬拉色菌組30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 后觀察，痤瘡丙酸桿菌組37 ℃恒溫?zé)o氧條件下培養(yǎng)72 h 觀察；用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值［13］。

1.2.4 最小抑菌濃度——肉湯稀釋法 在96 孔板中使用營養(yǎng)肉湯梯度稀釋艾葉復(fù)方精油乳，使?jié)舛葹?.50、3.25、1.62、0.812、0.406、0.203、0.101、0.0508、0.0254、0.0126 mg/mL。在孔板第11 孔和12 孔加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。于1～10 孔和12 孔加入10 μL 的供試菌菌液，第11 孔作為陰性對(duì)照，第12 孔為陽性對(duì)照。將各組在合適的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后觀察結(jié)果，藥物最大稀釋管中菌株不生長（溶液不渾濁）者為艾葉復(fù)方精油乳的最小抑菌濃度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾葉復(fù)方精油乳的抑菌圈直徑

艾葉復(fù)方精油乳對(duì)金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌、痤瘡丙酸桿菌的抑菌圈結(jié)果見表1、圖1。

圖1 艾葉復(fù)方精油乳對(duì)脂溢性脫發(fā)相關(guān)病菌的抑菌圈結(jié)果

表1 不同藥物對(duì)脂溢性脫發(fā)相關(guān)病菌的抑菌圈直徑比較mm

以美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》判斷細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性，抑菌圈試驗(yàn)的判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑＞20 mm 為最敏感，10～20 mm 為中度敏感，5～10 mm 為低度敏感，抑菌圈直徑≤5 mm者為不敏感［14］。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌和痤瘡丙酸桿菌對(duì)艾葉復(fù)方精油乳有中度敏感性，說明有抑制作用。

2.2 艾葉復(fù)方精油乳的抑菌MIC 值

采用肉湯稀釋法，進(jìn)行艾葉復(fù)方精油乳的最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)，確定艾葉復(fù)方精油乳對(duì)金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌、痤瘡丙酸桿菌的最小抑菌濃度，結(jié)果見表2、圖2。

圖2 艾葉復(fù)方精油乳對(duì)脂溢性脫發(fā)相關(guān)細(xì)菌的最小抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 不同濃度艾葉復(fù)方精油乳對(duì)細(xì)菌的抑制效果比較

由表2 可知，艾葉復(fù)方精油乳對(duì)不同細(xì)菌的最小抑菌濃度不同。當(dāng)艾葉復(fù)方精油乳濃度為0.050 mg/mL 時(shí)，金黃色葡萄球菌與糠秕馬拉色菌出現(xiàn)菌落，使肉湯渾濁，所以艾葉復(fù)方精油乳對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度是0.101 mg/mL。當(dāng)艾葉復(fù)方精油乳的濃度稀釋到0.101 mg/mL 時(shí)，痤瘡丙酸桿菌開始生長，所以艾葉復(fù)方精油乳對(duì)痤瘡丙酸桿菌的最小抑菌濃度為0.203 mg/mL。

3 討論

微生物感染可引起頭皮皮炎并加重脂溢性脫發(fā)，主要致病菌包括金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌和痤瘡丙酸桿菌等，這些細(xì)菌數(shù)量的失調(diào)增多還會(huì)引發(fā)毛囊炎及痤瘡等。目前治療藥物主要是酮康唑乳膏，已有研究表明中藥精油對(duì)多種細(xì)菌有抑制作用，這為擴(kuò)大臨床用藥提供了更多選擇，而中藥精油對(duì)脂溢性脫發(fā)相關(guān)病菌的研究卻寥寥無幾。艾葉精油、肉桂精油、生姜精油、薄荷精油等已被發(fā)現(xiàn)對(duì)多種致病菌有抑制作用。

本研究選用艾葉精油、肉桂精油、薄荷精油、生姜精油制成艾葉復(fù)方精油乳，測(cè)定艾葉復(fù)方精油乳對(duì)金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌和痤瘡丙酸桿菌的抑制效果及MIC 值。研究結(jié)果表明金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌和痤瘡丙酸桿菌對(duì)艾葉復(fù)方精油乳表現(xiàn)為中敏感度，抑菌圈直徑分別為13.0、16.3、11.0 mm，最小抑菌濃度分別為0.101、0.101、0.203 mg/mL。結(jié)果表明艾葉復(fù)方精油乳對(duì)3 種脂溢性脫發(fā)相關(guān)細(xì)菌都有抑制作用，通過抑制脂溢性脫發(fā)致病菌的生長與繁殖，減少炎癥發(fā)生，治療脂溢性脫發(fā)。目前課題組正進(jìn)行動(dòng)物防脫育發(fā)實(shí)驗(yàn)，初步結(jié)果表明其對(duì)毛發(fā)生長長度的促進(jìn)率為15%，以上研究為艾葉復(fù)方精油乳防脫育發(fā)的新藥和特殊化妝品的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和研究基礎(chǔ)。