★ 熊紫微 溫泉 吳佳輝 馮育林,2 楊世林,2 鐘國躍（.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；2.創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國家重點實驗室 南昌 330006）

鳳尾草為鳳尾蕨科鳳尾蕨屬藥用植物［1］，在我國分布廣泛，主要集中在我國的西南地區(qū)［2］，又名 “大葉鳳尾蕨” “井邊草”［3］。苗醫(yī)用鳳尾草最早記載于《本草拾遺》古籍中，主要功效為清熱利濕、涼血止血、消腫解毒［4］，用于治療黃疸型肝炎［5-6］，已有中成藥或者方劑中使用鳳尾草治療該病。經(jīng)品種整理發(fā)現(xiàn)，鳳尾草存在 “同物異名” “異名同物” 等問題［7］，較多地區(qū)以井欄邊草作為鳳尾草使用［6］。經(jīng)查閱相關(guān)文獻，鳳尾草主要有鳳尾蕨Pteris creticaL.var.nervosa、井欄邊草Pteris multifidaPoir.、劍葉鳳尾蕨Pteris ensiformisBurm、溪邊鳳尾蕨Pteris excelsaGaud.及蜈蚣草Pteris vittataL.等［8］。據(jù)相關(guān)標準記載，1977 年版《中國藥典》［9］、1992 年版《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》［10］、第3 版《臺灣中藥典》［11］以井欄邊草為基原收入標準中，而2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》［8］以井欄邊草、鳳尾蕨、劍葉鳳尾蕨、溪邊鳳尾蕨、蜈蚣草為基原收入標準中，而目前為止2020 年版《中國藥典》并未將其收載。前面3 個標準基原收載單一，2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》對其基原進行了擴充，但是以上標準質(zhì)量標準的完善還存明顯不足，性狀與鑒別描述較簡單，鑒別檢查項不完善，含量測定也未納入其中。

目前大多數(shù)對于井欄邊草或者其飲片的含量測定以木犀草素-7-O-葡萄糖苷為定量化合物［12］，而鳳尾蕨基原研究較少。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，鳳尾蕨與井欄邊草均含有木犀草素-7-O-蕓香糖苷與木犀草素-7-O-葡萄糖苷［13-14］，且前者具有抗關(guān)節(jié)炎與抗真菌作用［15-16］，后者具有消炎、預(yù)防心肌肥厚等功效［17-18］。所以通過描述鳳尾蕨與井欄邊草的植株形態(tài)與根莖葉及粉末的顯微鑒別［19］、蕨素C 的薄層色譜鑒別，鳳尾蕨藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分，醇溶性浸出物測定以及木犀草素-7-O-蕓香糖苷與木犀草素-7-O-葡萄糖苷的含量測定，制定合理的限度，為鳳尾草質(zhì)量控制提供合理的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-30A 型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；薄層色譜硅膠板（青島海洋化工廠）；METTLER AB104-N 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；石蠟包埋機（湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；組織石蠟切片機（德國萊卡公司）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈、三氯甲烷、二氯甲烷、正丁醇、乙酸、乙醇（國藥試劑有限公司）；甲酸（分析純，西亞試劑有限公司）；伊紅染色液（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司）；氨基半乳糖（阿拉丁生物技術(shù)有限公司）；谷草轉(zhuǎn)氨酶（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶、丙二醛、腫瘤壞死因子-α（南京建成生物工程研究所）；地塞米松（麥克林生物公司）；組織固定液（大連美侖生物科技有限公司）；木犀草素-7-O-云香糖苷（本實驗室自制，經(jīng)NMR 和MS 等波譜法鑒定結(jié)構(gòu)，純度≥99.1%）；木犀草素-7-O-葡萄糖苷（批號1111720-201609，純度≥94.9%，中國食品藥品檢定研究院）；蕨素C（批號CFN6802，Chem Faces 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鳳尾草浸膏的制備

將鳳尾蕨與井欄邊草干燥藥材分別加10 倍量70%的乙醇溶液回流提取30 min，過濾蒸干，得到浸膏。鳳尾蕨與井欄邊草的浸膏得率分別為6.3%和7.0%。

2.2 體外藥效實驗研究

測定2 種不同基原藥材粗提取物對RAW 264.7細胞的毒性。將細胞快速解凍，復(fù)蘇。用適合的培養(yǎng)基加到適合種板的狀態(tài)，接種于96 孔板中，用2 種浸膏稀釋至5、2.5、1.25、0.625、0.3 125 mg/mL，培養(yǎng)細胞24 h 后加入10%的CCK-8 溶液測定吸光度，計算細胞存活率。最后采用Griess 法測定NO。

2.3 體內(nèi)藥效實驗研究

2.3.1 動物分組及給藥 將72 只ICR 小鼠在新環(huán)境中喂養(yǎng)1 周后，隨機分為9 組：空白對照組、模型組、陽性藥組、鳳尾蕨與井欄邊草總提物高劑量組（10 g/kg）、中劑量組（5 g/kg）、低劑量組（2.5 g/kg），每組8 只。采用灌胃方式給藥，空白對照組、模型組和陽性藥組則灌胃等體積的生理鹽水，給藥頻率為每天1 次，共7 d。陽性藥組腹腔注射地塞米松（6 mg/kg）。2 h 后，除對照組腹腔注射等體積的生理鹽水外，其余各組小鼠均采用腹腔注射LPS（50 μg/kg）和D-gal（400 mg/kg）誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷。禁食不禁水6 h 后，收集血液和肝臟，一部分肝臟放入組織固定液中，其余肝臟置于低溫保存。

2.3.2 血清生化指標檢測 血液采集結(jié)束后，提取血清，用于檢測腎臟中重要酶指標ALT、AST，炎癥指標TNF-α、IL-6，氧化應(yīng)激指標SOD 和MDA。

2.3.3 肝臟組織病理學(xué)檢測 取肝組織相同部位用組織固定液固定后進行修塊，流水沖洗24 h，用乙醇進行脫水30 min，二甲苯透明10 min，石蠟包埋后切片、烤片、脫蠟水化，經(jīng)HE 染色后脫水透明，烘干后封片，最后觀察情況。

2.4 藥效實驗結(jié)果

2.4.1 不同基原鳳尾草粗提物對細胞存活率及LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細胞釋放NO 含量的影響 鳳尾蕨與井欄邊草在藥物濃度為0.625 mg/mL 時，既能夠保證細胞接近100%的存活率，又能夠顯著降低NO 的釋放，說明鳳尾蕨與井欄邊草均有抗炎的作用。見圖1。

圖1 2種基原藥材對細胞存活率及NO釋放量的影響

2.4.2 體內(nèi)實驗炎癥氧化應(yīng)激指標影響 通過檢測血清指標ALT、AST、IL-6、TNF-α，發(fā)現(xiàn)鳳尾蕨與井欄邊草10 g/kg 時，能夠顯著降低血清中ALT 與AST 的活力，顯著降低炎癥因子IL-6 和TNF-α的水平。檢測肝臟中氧化應(yīng)激指標SOD 與MDA 時發(fā)現(xiàn)，均能顯著降低MDA的含量，提高SOD酶活性。見圖2。

圖2 2種基原藥材對生化指標的影響

2.4.3 不同給藥組別對肝組織病理學(xué)影響 通過觀察肝臟病理切片，正常組肝細胞胞漿完整，肝索清晰；模型組紋路不清晰，組織間隙充血，粘連，細胞浸潤比較嚴重。給予鳳尾蕨、井欄邊草和陽性藥地塞米松后，肝細胞壞死面積明顯減輕。見圖3。

圖3 肝組織病理切片

2.5 質(zhì)量控制方法研究

16 批鳳尾草全草藥材，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘國躍教授鑒定為鳳尾蕨科鳳尾蕨屬植物鳳尾蕨Pteris creticaL.var.nervosa 與 井 欄 邊 草Pteris multifidaPoir.，樣品采集信息見表1。

表1 鳳尾草全草樣品采集信息

2.5.1 性狀 鳳尾蕨植株高50～70 cm。根莖短而直立或斜升，粗約1 cm，先端被黑褐色鱗片。葉片卵圓形，長25～30 cm，寬15～20 cm，一回羽狀；先端漸尖并有銳鋸齒，基部闊楔形。主脈下面強度隆起，禾稈色，光滑。側(cè)脈兩面均明顯，稀疏，斜展，單一或從基部分叉。葉干后紙質(zhì)，綠色或灰綠色。

井欄邊草植株高30～45 cm。根莖較短，直立，葉片緊密呈簇狀生長，葉片卵狀長圓形，一回羽狀葉，葉邊緣比較柔軟但不整齊，并且呈鋸齒狀，頂部葉片為三瓣，垂直向下延伸。主脈兩面均隆起，顏色呈淡棕色。葉片干后形如草的質(zhì)地，顏色為暗綠色。見圖4。

圖4 原植物及其干燥植株藥材、粉末圖

2.5.2 顯微鑒別

2.5.2.1 制片方法 將植物組織進行修剪，溫水浴煮泡發(fā)1 h，用固定液FAA 固定［20］。

2.5.2.2 鳳尾草根橫截面 根橫切面呈類圓形，細胞排列緊密，呈類梯形。表皮為一列薄壁細胞，基本組織中有4 個分體中柱，周韌型，基本對稱。維管束木質(zhì)化、木栓化和角質(zhì)化細胞被番紅染液染紅，在偏光鏡下顯紅色［21］。

2.5.2.3 鳳尾蕨莖橫截面 莖橫切面呈蝴蝶形，內(nèi)部有2 個似海馬細胞的分體呈 “八” 字形排列，從邊緣往里部，細胞交錯排列，往里面有木質(zhì)細胞，在顯微鏡下顯橙紅色。

2.5.2.4 鳳尾蕨葉脈及葉橫截面 中脈上部凹陷，呈兩山峰狀，下部凸出。表皮為一列薄壁細胞，被角質(zhì)層，內(nèi)側(cè)均有3～5 層厚壁細胞。維管束呈類三角形，周韌型。管胞1～2 層，呈淡紅色，在偏光鏡下呈亮紅色。見圖5。

圖5 鳳尾蕨根莖葉橫截面顯微圖

2.5.2.5 鳳尾蕨顯微粉末鑒別 粉末呈淡黃綠色。葉表皮細胞波浪彎曲狀。孢子囊柄長短不一，為4～6 個細胞，一般為2 列。呈近橢圓形，基部略窄，孢子呈三角形，呈棕紅色光芒。管胞可見網(wǎng)狀或梯狀紋孔。根狀莖鱗葉細胞為棕色薄壁細胞，長多邊形。見圖6。

圖6 鳳尾蕨粉末顯微鑒別圖

2.5.2.6 井欄邊草根橫截面 井欄邊草根部橫截面細胞排列緊密，外圍細胞較厚，在顯微鏡下顯橙紅色。內(nèi)部有幾層薄壁細胞，呈無色透明狀。整個橫截面呈圓形，有4 個小型弧狀的分體，內(nèi)部分布著薄壁細胞，且大小不一。

2.5.2.7 井欄邊草莖葉橫截面 莖橫切面呈蝴蝶形，內(nèi)部有2 個似海馬細胞的分體呈 “V” 字形排列，從邊緣往里部，細胞交錯排列，往里面有木質(zhì)細胞，在顯微鏡下顯橙紅色。見圖7。

圖7 井欄邊草根莖葉橫截面顯微圖

2.5.2.8 井欄邊草粉末顯微鑒別 粉末呈淡暗綠色。孢子呈三角形［22］；管胞可見網(wǎng)狀或梯狀紋孔；根狀莖鱗葉細胞為棕色薄壁細胞，長多邊形。見圖8。

圖8 井欄邊草粉末顯微鑒別圖

2.5.3 薄層色譜鑒別 取本品粉末2 g，加入甲醇30 mL，超聲15 min，冷卻，濾過，補重蒸干，加入純水復(fù)溶，用二氯乙烷萃取至無色，取下層萃取液蒸干復(fù)溶，作為供試品溶液。吸取供試品溶液，對照藥材溶液，對照品溶液，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷∶正丁醇∶乙酸（16∶1∶1）為展開劑，展開。置紫外光燈254 nm 下檢視檢。結(jié)果表明，上述條件能夠較好地將各斑點分離，顯色較清晰。見圖9。

圖9 16批鳳尾草薄層色譜鑒別圖（254 nm）

2.5.4 水分、總灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物測定 按照2020 年版《中國藥典》一部附錄方法測定了16 批鳳尾蕨藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物。見表2。

表2 鳳尾蕨水分、灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物測定結(jié)果 %

2.5.5 含量測定

2.5.5.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗 使用Cosmosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液（17∶83）為流動相，流速1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長348 nm，進樣量10 μL，對照品溶液和供試品溶液的HPLC 色譜見圖10。

圖10 對照品溶液和供試品溶液的HPLC色譜

2.5.5.2 供試品溶液的制備 取鳳尾蕨藥材粉末（過4 號篩）約0.5 g，精密稱定，加入70%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲45 min，冷卻，稱重，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，得續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.5.5.3 對照品溶液的制備 取對照品適量，精密稱定，加入甲醇配制成含木犀草素-7-O-蕓香糖苷濃度為0.060 1 mg/g 與木犀草素-7-O-葡萄糖苷濃度為0.014 1 mg/g 的對照品溶液。

2.5.5.4 線性關(guān)系考察 精密稱取木犀草素-7-O-蕓香糖苷與木犀草素-7-O- 葡萄糖苷對照品，加甲醇將木犀草素-7-O-蕓香糖苷配制成1、4、8、16、64、256 μg/mL 濃度，將木犀草素-7-O-葡萄糖苷配制成1.7、7.1、14.1、28.2、56.5、113 μg/mL 濃度對照品溶液，進樣10 μL，按上述色譜條件測定，以峰面積值為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)與范圍見表3。

表3 鳳尾蕨中2種指標性成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5.5.5 精密度試驗 取 “2.5.5.3” 項對照品溶液，按 “2.5.5.1” 項下色譜條件于同1 d 內(nèi)連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，木犀草素-7-O-蕓香糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為0.17%和0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.5.6 重復(fù)性試驗 取同一批藥材6 份，按 “2.5.5.2” 項下供試品溶液制備方法和 “2.5.5.1” 項HPLC 測定方法進行分析，記錄2 種成分的峰面積，代入標準曲線計算樣品中各成分的含量。結(jié)果顯示，木犀草素-7-O-蕓香糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷含量的RSD分別為1.97%和3.57%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液按上述色譜條件分別于 0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，木犀草素-7-O-蕓香糖苷峰面積平均值的RSD為2.29%，木犀草素-7-O-葡萄糖苷峰面積平均值的RSD為4.68%，結(jié)果表明供試品溶液中木犀草素-7-O-蕓香糖苷和木犀草素-7-O-葡萄糖苷均穩(wěn)定。

2.5.5.8 色譜柱耐用性 取同一供試品溶液按上述色譜條件分別用Global Chromatography C18、依利特Hypersil ODS 和Cosmosil C18色 譜 值 進 樣 分 析，木犀草素-7-O-蕓香糖苷的RSD為4.41%，木犀草素-7-O-葡萄糖苷的RSD為5.00%。

2.5.5.9 回收率試驗 精密稱取已知含量同一批鳳尾蕨樣品6 份各0.5 g，精密稱定，再加入適量的木犀草素-7-O-蕓香糖苷與木犀草素-7-O-葡萄糖苷對照品，木犀草素-7-O-蕓香糖苷加樣回收率為100.49%～107.20%，平均加樣回收率為104.02%，RSD為2.75%；木犀草素-7-O-葡萄糖苷的回收率為90.52%～95.10%，平均加樣回收率為92.49%，RSD為1.92%。見表4。

表4 鳳尾草樣品2種指標性成分含量測定結(jié)果 mg/g

2.6 樣品含量測定

精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，16 批鳳尾蕨中木犀草素-7-O-蕓香糖苷的含量為0.078 2～8.867 3 mg/g，木犀草素-7-O-葡萄糖苷的含量為0.112 2～2.997 1 mg/g。

3 討論

本研究采用LPS/D-gal誘導(dǎo)ICR小鼠急性肝炎，肝損傷指標ALT、AST、TNF-α、IL-6、MDA 水平顯著升高，SOD 水平顯著降低。鳳尾蕨與井欄邊草在給藥量均為10 g/kg 時，能夠顯著降低AST、ALT、TNF-α、IL-6 的水平，井欄邊草抵御氧化應(yīng)激的效果比鳳尾蕨效果好，井欄邊草能夠顯著提高SOD 的活性。鳳尾蕨與井欄邊草均能夠顯著降低MDA 含量，起到保護肝組織，減輕氧化應(yīng)激。實驗結(jié)果表明，2 種基原鳳尾草均可通過降低相關(guān)炎癥因子水平，發(fā)揮保肝作用［23］。本研究確定了鳳尾蕨提取物對急性肝炎的保護和治療作用，為鳳尾草治肝損傷提供科學(xué)理論依據(jù)。

在薄層色譜鑒別中，經(jīng)過多次試驗，對展開劑三氯甲烷、甲醇、正丁醇、乙酸進行條件摸索，最終選用硅膠GF254薄板。三氯甲烷∶正丁醇∶乙酸（16∶1∶1）為展開劑條件，同時進行方法學(xué)考察，分別考察溫度25 ℃和濕度34%、溫度19 ℃和濕度52%、溫度4 ℃和濕度75%的3 種不同展開環(huán)境，結(jié)果表明該鑒別方法耐用性良好，色譜圖Rf值適中，且分離度好。在對含量測定方法的提取方法、提取溶媒、提取時間、流動相系統(tǒng)的實驗考察中，得出最佳的含量測定方法為70%的甲醇超聲提取45 min，乙腈-0.1%甲酸進行洗脫最佳。各峰的保留時間適中，實驗重復(fù)性較好，有利于含量測定。

根據(jù)16 批樣品的測定結(jié)果，結(jié)合2020 年版《中國藥典》中同類藥材標準［24］，取均值上浮20%為10.9%，綜合分析確定鳳尾草水分不得高于10.9%，16 批次樣品全部合格，合格率為100%，建議規(guī)定鳳尾草水分測定不得超過10.9%；總灰分均值為12.5%，取均值上浮20%為15.0%，16 批次樣品中14 批合格，合格率為87.5%；酸不溶性灰分平均值為8.1%，取均值上浮20%為9.8%。16 批次樣品中13 批合格，合格率為81.3%，建議規(guī)定鳳尾草總灰分不得超過15.0%，酸不溶灰分不超過10.0%；醇溶性浸出率均值為20.4%，取均值下浮20%為16.3%，16 批次樣品全部合格，合格率為100%，建議規(guī)定鳳尾草醇溶性浸出物不得少于16.3%，鳳尾草樣品中木犀草素-7-O-葡萄糖苷含量的平均值為0.13%，取平均值下浮80%，合格批次16 批，合格率為81.3%。木犀草素-7-O-葡萄糖苷平均值為0.10%，取平均值下浮60%，確定含量限度值為0.04%，合格批次16 批，合格率為81.3%。建議規(guī)定鳳尾草中木犀草素-7-O-蕓香糖苷（C27H30O15）不得少于0.06%，木犀草苷（C21H20O11）不得少于0.04%。

通過定量犀草素-7-O-蕓香糖苷，合理規(guī)范藥材，并發(fā)現(xiàn)其具有治療急性肝損傷的作用。在薄層色譜研究中，使用蕨類植物特征性成分蕨素C 與對照藥材進行定性鑒別，為后期對藥材假偽的判定提供依據(jù)。