趙 媛,陳 紅,謝 燕,李 寧,金木蘭

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,2020年約占全球所有惡性腫瘤新發(fā)病例的2.2%,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。其中,伴肉瘤樣分化的腎細(xì)胞癌常被稱為肉瘤樣腎細(xì)胞癌(sarcomatoid renal cell carcinoma, sRCC),該腫瘤呈低分化或未分化狀態(tài),通常為WHO/ISUP 4級,進(jìn)展迅速,生物學(xué)行為較常見的腎癌更具侵襲性,預(yù)后較差,大多數(shù)患者在1年內(nèi)死于腫瘤轉(zhuǎn)移[1]。盡管靶向治療有效延長了晚期RCC患者的生存期,但該治療方法對sRCC患者的療效有限。研究表明,RCC中肉瘤樣成分的存在可能導(dǎo)致靶向治療的耐藥性[2]。近年研究發(fā)現(xiàn),PD-1和PD-L1在sRCC中的表達(dá)水平顯著高于非sRCC,提示阻斷PD-1/PD-L1軸可能是一種新的治療策略[3]。研究顯示,在RCC治療中采用PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合靶向治療的療效優(yōu)于單用靶向治療,并且可以有效延長患者的無進(jìn)展生存期和提高客觀緩解率[4]。本研究納入16例sRCC,探討腫瘤組織中PD-L1表達(dá)、腫瘤內(nèi)微血管密度及其與sRCC預(yù)后的關(guān)系,為進(jìn)一步探索sRCC免疫治療及靶向治療方案提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集并篩選2016年1月～2022年12月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院經(jīng)病理確診的16例sRCC患者(癌成分均為透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌)。收集患者臨床病理資料包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、肉瘤樣區(qū)域占比、病理TNM分期、治療及預(yù)后情況。影像學(xué)監(jiān)測腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況。無進(jìn)展生存期 (progression free survival, PFS)定義為患者接受治療至患者出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展或末次隨訪日。總生存期(overall survival, OS)定義為患者術(shù)后至各種原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間或末次隨訪日。本研究經(jīng)北京朝陽醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),遵循《藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《赫爾辛基宣言》實(shí)施。所有患者均知情同意。

1.2 方法組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋,5 μm厚切片,HE染色,光鏡下觀察。免疫組化一抗包括PD-L1、CD31和CD34,其中PD-L1(SP263)購自美國羅氏公司,使用Bench Mark ULTRA全自動免疫組化染色平臺檢測PD-L1的表達(dá),CD31和CD34購自北京中杉金橋公司,免疫組化染色采用EnVision兩步法。

通過免疫組化法檢測PD-L1在sRCC腫瘤細(xì)胞(tumor cell, TC)和腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞(immune cell, IC)中的表達(dá)。IC包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。TC PD-L1判讀：任意強(qiáng)度的、部分或完全細(xì)胞膜PD-L1染色的腫瘤細(xì)胞占標(biāo)本中所有腫瘤細(xì)胞的百分比。腫瘤細(xì)胞質(zhì)染色、腫瘤內(nèi)間質(zhì)及壞死區(qū)域不包含在評判范圍內(nèi)。IC PD-L1陽性判讀：腫瘤區(qū)域內(nèi)、任意強(qiáng)度的、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜PD-L1染色的免疫細(xì)胞所占腫瘤面積的百分比。腫瘤面積包含腫瘤細(xì)胞、腫瘤內(nèi)間質(zhì)及腫瘤周圍連續(xù)性相關(guān)間質(zhì),不包含壞死區(qū)域。采用聯(lián)合陽性評分(combined positive score, CPS)來代表TC及IC聯(lián)合表達(dá),結(jié)果用0～100數(shù)值來表示。當(dāng)計(jì)算結(jié)果超過100時(shí),最終結(jié)果按100來計(jì)算[4]。所有染色的組織樣本均由2名泌尿生殖病理專業(yè)的病理醫(yī)師進(jìn)行復(fù)核。

通過免疫組化法檢測CD31和CD34的表達(dá)情況[5]。單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇的胞膜和(或)胞質(zhì)染色視為陽性,可用于微血管密度(microvessel density, MVD)計(jì)數(shù),不計(jì)瘤細(xì)胞稀少區(qū)、硬化區(qū)及其接近正常組織區(qū)域的微血管數(shù)量。微血管密度計(jì)數(shù)方法：先在100倍光鏡下觀察切片確定腫瘤內(nèi)血管密度最高處,選取CD31、CD34陽性染色較多的熱點(diǎn)區(qū)(5個(gè)),再在200倍光鏡下在各熱點(diǎn)區(qū)范圍內(nèi)進(jìn)行MVD計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)數(shù)資料以率或百分比表示,兩組均數(shù)間的比較應(yīng)用t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier曲線描繪患者的總體生存率。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征16例sRCC臨床病理特征見表1,其中男性12例(75.0%),女性4例(25.0%),男女比為3∶1,年齡31～75歲,中位年齡53.5歲。5例(31.3%)腫瘤位于左腎,11例(68.7%)腫瘤位于右腎。腫瘤最大徑4.0～13.5 cm,中位最大徑7.0 cm。肉瘤樣區(qū)域占腫瘤瘤體5%～70%不等。根據(jù)WHO/ISUP腫瘤分級系統(tǒng),腎細(xì)胞癌伴有肉瘤樣分化WHO/ISUP分級均為G4。病理TNM分期Ⅰ～Ⅳ期患者分別為3例(18.8%)、3例(18.8%)、7例(43.7%)、3例(18.8%)。所有患者均接受腎癌根治術(shù),其中分期為pT1的2例患者術(shù)后定期復(fù)查,未接受其他治療,其余患者在術(shù)后根據(jù)病情變化應(yīng)用了靶向治療或免疫治療。

2.2 MVD檢測結(jié)果對本組16例sRCC進(jìn)行組織學(xué)觀察,16例sRCC腫瘤組織中同時(shí)含有癌和肉瘤樣成分,肉瘤樣區(qū)域腫瘤細(xì)胞呈梭形,彌漫片狀分布(圖1A),癌成分均為透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(圖1B)。腫瘤中微血管呈網(wǎng)狀、管狀散在或彌漫分布,血管形態(tài)差異性較大。CD31免疫組化標(biāo)記的肉瘤樣分化區(qū)域MVD計(jì)數(shù)為68.6±25.8,不伴肉瘤樣分化區(qū)域的MVD計(jì)數(shù)為38.7±16.0,肉瘤樣分化區(qū)域MVD明顯高于不伴肉瘤樣分化的區(qū)域(圖1C、D),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 5,表2);CD34免疫組化標(biāo)記的肉瘤樣分化區(qū)域MVD計(jì)數(shù)為69.5±28.1,周邊不伴肉瘤樣分化區(qū)域MVD計(jì)數(shù)為40.1±18.4,肉瘤樣分化區(qū)域MVD明顯高于不伴肉瘤樣分化的區(qū)域(圖1E、F),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001 5,表2)。

圖1 A.肉瘤樣腎細(xì)胞癌的肉瘤樣區(qū)域：腫瘤細(xì)胞呈梭形,彌漫片狀分布,胞質(zhì)嗜酸性;B.肉瘤樣腎細(xì)胞癌的非肉瘤樣區(qū)域：腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)透明,呈現(xiàn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌形態(tài);C.CD31免疫組化標(biāo)記的肉瘤樣腎細(xì)胞癌肉瘤樣區(qū)域微血管內(nèi)皮細(xì)胞,EnVision法;D. CD31免疫組化標(biāo)記的肉瘤樣腎細(xì)胞癌非肉瘤樣區(qū)域微血管內(nèi)皮細(xì)胞,EnVision法;E.CD34免疫組化標(biāo)記的肉瘤樣腎細(xì)胞癌肉瘤樣區(qū)域微血管內(nèi)皮細(xì)胞,EnVision法;F. CD34免疫組化標(biāo)記的肉瘤樣腎細(xì)胞癌非肉瘤樣區(qū)域微血管內(nèi)皮細(xì)胞,EnVision法;G. PD-L1在肉瘤樣腎細(xì)胞癌肉瘤樣區(qū)域中的表達(dá),EnVision法;H.PD-L1在肉瘤樣腎細(xì)胞癌非肉瘤樣區(qū)域中的表達(dá),EnVision法

表2 肉瘤樣腎細(xì)胞癌中肉瘤樣區(qū)域與非肉瘤樣區(qū)域MVD計(jì)數(shù)及PD-L1表達(dá)情況

2.3 PD-L1表達(dá)情況16例sRCC中肉瘤樣區(qū)域與非肉瘤樣區(qū)域PD-L1染色結(jié)果顯示(圖1G、H,表1),肉瘤樣區(qū)域PD-L1的CPS為34.7±26.9,非肉瘤樣區(qū)域PD-L1的CPS為25.9±27.6。肉瘤樣區(qū)域PD-L1的表達(dá)水平高于非肉瘤樣區(qū)域,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.357 6,表2)。

2.4 隨訪及預(yù)后對所有患者進(jìn)行隨訪,中位隨訪時(shí)間36.5個(gè)月(10～84個(gè)月),14例患者出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展,其中7例患者死亡,患者總體生存曲線見圖2。

圖2 16例肉瘤樣腎細(xì)胞癌患者的總體生存曲線圖

3 討論

sRCC是一種去分化的癌,它并不是一個(gè)獨(dú)立的組織學(xué)類型,任何RCC亞型都可能伴有肉瘤樣成分,其復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率高,總體預(yù)后差。傳統(tǒng)療法對sRCC的療效不佳,中位OS約為19個(gè)月[6]。對于sRCC,目前尚無有效的系統(tǒng)治療方法。隨著靶向治療藥物(如舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、阿昔替尼等)的出現(xiàn),RCC患者的預(yù)后生存得到了一定程度的改善[7]。分子靶向藥物的主要作用機(jī)制是通過抑制腫瘤血管生成來抑制腫瘤生長。血管生成是指腫瘤附近血管的增殖和出芽,在腫瘤的增殖和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[8]。MVD是最常用的量化腫瘤內(nèi)血管生成的參數(shù),也是衡量腫瘤血管生成的金標(biāo)準(zhǔn),在肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌中是公認(rèn)的預(yù)后相關(guān)因素[9-11]。然而,一些研究發(fā)現(xiàn),在RCC患者中MVD與OS之間無明顯相關(guān)性[5]。Yao等[12]認(rèn)為RCC中存在兩種微血管類型：未分化型微血管和分化型微血管。該研究認(rèn)為分化型微血管比例越高,惡性程度越低,預(yù)后越好;未分化型微血管比例越高,惡性程度越高,預(yù)后越差,即未分化型MVD是RCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。臨床對檢測MVD計(jì)數(shù)的常用指標(biāo)為CD31和CD34。CD31是泛內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物,不僅與新形成的微血管有關(guān),也涉及腫瘤中已有的血管。CD34常在血管周細(xì)胞中表達(dá),但在正常血管內(nèi)皮和淋巴內(nèi)皮中表達(dá)較少,因此能突出顯示較小的、不成熟的微血管或單一的內(nèi)皮細(xì)胞[5]。本研究發(fā)現(xiàn),sRCC中血管密度增加,尤其是CD34標(biāo)記的未成熟血管數(shù)量增加,MVD計(jì)數(shù)高于非肉瘤樣區(qū)域,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001 5),提示sRCC可能從抑制血管生成的靶向治療中獲益。

隨著腫瘤免疫治療的發(fā)展,免疫治療被認(rèn)為是治療高危腎癌的一種有前景的治療方法。研究發(fā)現(xiàn),sRCC中PD-1和PD-L1的表達(dá)量明顯高于普通病理類型的腎癌,同時(shí)腫瘤相關(guān)淋巴細(xì)胞的浸潤也較高。Kawakami等[3]發(fā)現(xiàn),與非肉瘤性4級透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌相比,伴肉瘤樣分化的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的PD-L1表達(dá)更高。該研究表明,sRCC中PD-1/PD-L1的表達(dá)比例可能比非sRCC更高。本研究對16例sRCC腫瘤組織進(jìn)行了PD-1和PD-L1免疫組化染色,所有患者腫瘤組織PD-L1均有不同程度表達(dá),且肉瘤樣區(qū)域的陽性百分比均高于非肉瘤樣區(qū)域,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；诒狙芯拷Y(jié)果及其他研究報(bào)道,sRCC患者有可能從免疫治療中獲益。

在組織學(xué)方面,腎細(xì)胞癌具有豐富的血管和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞。因此,抗血管生成靶向藥物和免疫檢查點(diǎn)抑制劑有望在腎癌聯(lián)合治療中發(fā)揮協(xié)同增效作用。研究顯示,靶向藥物聯(lián)合PD-1/PD-L1抑制劑在晚期RCC的治療中獲得了良好的療效。例如,KEYNOTE-426臨床研究對帕博利珠單抗和阿昔替尼聯(lián)合與舒尼替尼單藥治療晚期腎細(xì)胞癌療效進(jìn)行了比較。有研究顯示,與舒尼替尼相比,聯(lián)合治療組患者的PFS明顯延長(15.4個(gè)月vs11.1個(gè)月,P<0.000 1),客觀緩解率顯著提高(59.3%vs35.7%,P<0.000 1),并且無論患者PD-L1的表達(dá)狀況如何,聯(lián)合治療組均可獲益[13-14]。CLEAR研究顯示,侖伐替尼聯(lián)合帕博利珠單抗與舒尼替尼相比,患者的PFS得到明顯延長(23.9個(gè)月vs9.2個(gè)月,P<0.001),聯(lián)合治療組的OS也優(yōu)于舒尼替尼組(P=0.005),并且聯(lián)合治療組的客觀緩解率達(dá)71%,明顯優(yōu)于其他藥物的臨床研究數(shù)據(jù)[15]。因此,聯(lián)合靶向治療和免疫治療,與單獨(dú)使用靶向治療或免疫治療相比,可有效改善晚期RCC的治療效果。一項(xiàng)研究顯示,與65例單獨(dú)接受舒尼替尼治療的sRCC患者相比,74例接受伊匹單抗聯(lián)合納武單抗治療的患者中位PFS、中位OS、完全緩解率和局部緩解率均顯著增加[16]。因此,靶向治療聯(lián)合免疫治療也可能成為sRCC潛在有效的治療方法。

本研究顯示,采用靶向治療聯(lián)合免疫治療的sRCC患者,相比于單獨(dú)采用靶向治療者,PFS與OS均有所提升。例如,例13在腎癌根治術(shù)后第50個(gè)月發(fā)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展,應(yīng)用靶向聯(lián)合免疫治療,目前隨訪69個(gè)月病情平穩(wěn),相比于同為pT3期、僅追加靶向治療的患者,其預(yù)后明顯改善。例14在腎癌根治術(shù)后第16個(gè)月發(fā)現(xiàn)腫瘤肺轉(zhuǎn)移,應(yīng)用索拉非尼靶向治療,未聯(lián)合免疫治療,于術(shù)后第25個(gè)月去世;而同為pT4期的例15,在腎癌根治術(shù)后第19個(gè)月發(fā)現(xiàn)腫瘤肺轉(zhuǎn)移,應(yīng)用靶向治療聯(lián)合免疫治療,目前隨訪30個(gè)月患者仍生存,腫瘤控制平穩(wěn)。例16在腎癌根治術(shù)后第8個(gè)月時(shí)腫瘤復(fù)發(fā),應(yīng)用靶向治療聯(lián)合免疫治療后,于第29個(gè)月去世;而同為pT4期且復(fù)發(fā)后未聯(lián)合免疫治療的例14,其復(fù)發(fā)后生存期僅9個(gè)月,兩者相比,前者復(fù)發(fā)后生存期更長(21個(gè)月vs9個(gè)月),提示靶向聯(lián)合免疫治療在延長sRCC患者OS方面可能發(fā)揮潛在改善作用。

綜上,sRCC較為少見,患者預(yù)后較差,靶向聯(lián)合免疫治療可能是此類患者臨床治療方案中的一項(xiàng)重要選擇。然而,本研究樣本量小,可能存在選擇偏差,未來還需要更大樣本的前瞻性研究來驗(yàn)證本研究的結(jié)果。