唐 蓉，陳駿飛，楊海泉，楊峻松，周于瑩，劉畢琴，史 巧,*，李 宏

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南昆明 650223；2.云南易門山里香食品有限責任公司，云南玉溪 651109；3.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，云南昆明 650201）

乳酸菌與酵母菌是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中常見的微生物群，以酵母菌或乳酸菌單一菌種發(fā)酵的產(chǎn)品感官特性較為單一，限制了產(chǎn)品的個性化及競爭性[1-2]。通過乳酸菌和酵母菌聯(lián)合作用能夠獲得更為豐富的代謝產(chǎn)物并提高發(fā)酵效率，共同作用賦予傳統(tǒng)發(fā)酵食品獨特的風味、色澤和質(zhì)地[3]。酵母菌與乳酸菌組合發(fā)酵食品簡單且高效，也越來越受到市場的青睞[4]。目前，泡菜發(fā)酵菌劑的研究已經(jīng)取得了較好進展，但相關研究多以乳酸菌發(fā)酵為主，運用乳酸菌和酵母菌共發(fā)酵的研究相對較少，陳安特等[5]在蘿卜泡菜中加入釀酒酵母明顯提高了泡菜風味。陳偲等[6]在發(fā)酵白菜中添加釀酒酵母提高了食用安全性。所以開發(fā)有效的乳酸菌和酵母菌共發(fā)酵菌劑對于提升泡菜的品質(zhì)和風味至關重要。

受冷藏、冷鏈條件及消費水平等因素的限制，傳統(tǒng)泡菜在常溫貯藏、流通和銷售過程中質(zhì)量不穩(wěn)定，容易發(fā)生褐變、質(zhì)地變軟和風味下降等問題，嚴重影響產(chǎn)品品質(zhì)[7-8]。目前工業(yè)生產(chǎn)中多采用巴氏殺菌和添加防腐劑的方法來延長泡菜貨架期，但可能導致泡菜營養(yǎng)及風味損失嚴重，且長期攝入防腐劑存在健康隱患[9-10]。開發(fā)優(yōu)質(zhì)泡菜發(fā)酵菌劑以延長零添加泡菜貨架期、提高泡菜安全性是泡菜發(fā)展的必然趨勢。在泡菜發(fā)酵時加入酵母菌不僅可以提升酸菜的風味，且在成品的儲存過程中也起著關鍵的作用，酵母菌對糖的利用率最高可達99%以上，可充分利用蔬菜原料中可發(fā)酵的糖，與腐敗菌和乳酸菌形成競爭，還能將乳酸作為碳源消耗掉，可防止泡菜腐敗和過酸，有利于延長產(chǎn)品的保藏期[11-13]。利用生物拮抗來延長食品保質(zhì)期不僅可以保障食品安全，對食物的口感以及風味影響也較小[14]。因此，為了提升低鹽低酸泡菜產(chǎn)品的風味品質(zhì)，本實驗室前期對不同泡菜來源的乳酸菌和酵母菌分離株進行耐受性及發(fā)酵性能的篩選，并考察乳酸菌和不同酵母菌的組合對泡菜品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)運用腸膜明串珠菌菌株L5 和少孢哈薩克斯坦酵母菌菌株M1 的組合相較于L5 和其他酵母菌的組合發(fā)酵的低酸泡菜風味更好，安全性更高。

本研究基于前期結果，進一步對比雙菌共發(fā)酵，乳酸菌單獨發(fā)酵及自然發(fā)酵條件下芥菜及成品加速保藏期間的理化指標變化，探究添加特定酵母菌對泡菜發(fā)酵過程和保藏期品質(zhì)的影響，給泡菜工業(yè)化生產(chǎn)菌劑提供更多的選擇，為延長低添加泡菜保質(zhì)期提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮芥菜 購自云南昆明菜市場；菌株樣品分離自云南不同來源的發(fā)酵蔬菜，于-80 ℃保存；少孢哈薩克斯坦酵母（Kazachstania exigua）M5保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCCNo62817；MRS 培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）青島海博生物技術有限公司；鹽酸、乳酸、氫氧化鈉、乙酸鋅、硫酸鋅、酚酞、亞鐵氰化鉀 天津市致遠化學試劑有限公司；所有化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

DW-86L500 超低溫冰箱（-80 ℃）山東澳柯瑪有限公司；CJ-2S 超凈工作臺、WPL-125BE 電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；HR/T20MM 冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；ZQZY-88AV 全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；Multiskan GO 酶標儀 美國Thermo 公司；YXQ-75SL 高壓蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司；S210 pH 計 梅特勒托利多科技（中國）有限公司；TMS-Touch 質(zhì)構儀 美國FTC 公司；CM-5 臺式色差儀 日本美能達公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芥菜發(fā)酵及保藏 發(fā)酵劑制備：-80 ℃冰箱中取出菌株，乳酸菌于MRS 液體培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)；酵母菌于YPD 液體培養(yǎng)基30 ℃、225 r/min搖床培養(yǎng)，均活化兩代，待生長到對數(shù)生長期使用。將活化好的菌液于4 ℃，6000 r/min 離心10 min，棄去上清液，用無菌生理鹽水重復洗菌體3 次，收集菌體。最后懸浮于與培養(yǎng)液同體積的無菌生理鹽水中，制成菌懸液作為母發(fā)酵劑。

芥菜發(fā)酵：新鮮芥菜整棵清洗并用75%食品級酒精浸泡10 min 進行減菌處理后入壇，按泡菜水體積加入2%白砂糖和3%鹽（菜水比，2:3），接菌量為泡菜水體積的2%（L5+M1 組接種乳酸菌和酵母菌、L5 組只接種乳酸菌、CK 組不接菌），使泡菜水中乳酸菌終濃度大于106CFU/g 泡菜，酵母菌終濃度大于105CFU/g 泡菜，混合1 min 后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱。每個樣品3 個平行。

加速保藏：取經(jīng)理化分析和感官評定的發(fā)酵成熟泡菜直接真空包裝（不添加防腐劑和不經(jīng)巴氏殺菌處理），置于37 ℃恒溫箱中，保藏75 d 后進行理化性質(zhì)和感官評定（恒溫加速時間參考胡曉軍等[15]的方法進行試驗確定）。每個樣品3 個平行。

1.2.2 pH、總酸和活菌數(shù)測定 pH 測定：參考陳偲等[6]的方法，取泡菜發(fā)酵液用pH 計直接測定，每個樣品測定3 個平行?？偹釡y定：參照國標GB 12456-2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》第一法酸堿指示劑滴定法[6]?；罹鷶?shù)測定[16]：取泡菜汁液稀釋涂布于MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 d 后進行乳酸菌計數(shù)；取泡菜汁液稀釋涂布于孟加拉紅固體培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d 后進行酵母菌計數(shù)。

1.2.3 亞硝酸鹽測定 參照國標GB 5009.33-2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》第二法分光光度法[6]。

1.2.4 總酯含量測定 參照張鵬[17]的方法改進后測定。吸取50 mL 發(fā)酵液置入250 mL 回流瓶中，加2 滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L 的NaOH 標準溶液滴定至微紅色，再準確加入25 mL 0.1 mol/L 的NaOH標準溶液。裝上回流冷凝器，于沸水浴中回流皂化0.5 h，取下冷卻，立即用0.1 mol/L 的硫酸標準溶液滴定至紅色剛好消失為終點，記下消耗硫酸標準溶液的體積?？瞻自囼灲M用無酯乙醇替代樣品。計算公式：

式中：X 表示樣品中的總酯含量（以乙酸乙酯計），g/L；c 表示硫酸標準液濃度，mol/L；V0表示空白試驗組消耗的硫酸體積，mL；V1表示樣品組消耗的硫酸體積，mL。

1.2.5 感官評定 由12 人分別對發(fā)酵芥菜的色澤、質(zhì)地、香氣和滋味進行評分，采取盲評模式，滿分為100 分，去除最高分和最低分后，取平均分為發(fā)酵芥菜最后的得分。具體評分標準見表1[18]。

表1 感官評分標準Table 1 Standard of sensory score

1.2.6 質(zhì)構特性測定 參考汪姣玲等[19]的方法改進后測定，用質(zhì)構儀通過質(zhì)地剖面分析法（TPA）對菜梗進行測定。取菜梗，將菜梗切成大小1 cm×1 cm，厚4～6 mm，用于指標測定。每個樣品至少檢測10 個重復。測試條件為：圓盤直徑7.5 cm，探頭P/36R，最大力為500 N，起始力0.75 N，試樣受壓形變30%，探頭回升高度為15 mm，檢測速度60 mm/min。

1.2.7 色差測定 用色差儀測量菜表面的色值，測量前用美能達標準白色反射鏡校準。每個樣本在5 個隨機位置進行測量，且重復3 次。色差（ΔE）計算如下：

式中：ΔE表示色差變化值；L*代表明暗度，L0代表明暗度初始值；a*代表紅綠色，a0代表紅綠色初始值；b*代表黃藍色，b0代表黃藍色初始值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)通過Graphpad Prism8.2.1 軟件進行計算繪圖，并使用IBM SPSS Statistics26 進行顯著性檢驗，P＜0.05 表示有顯著性差異，P＜0.01 表示有極顯著差異，結果以平均值±標準差（）表示。

2 結果與分析

2.1 芥菜發(fā)酵期間pH 和總酸的變化

泡菜的理化指標對泡菜品質(zhì)具有重要影響，由圖1A 可知，各組pH 在0～3 d 之間均急速下降，第12 d 開始趨于穩(wěn)定；發(fā)酵結束時L5 單獨發(fā)酵組的pH 最低，自然發(fā)酵組的pH 最高。發(fā)酵前期各組的乳酸菌迅速生長產(chǎn)酸較多，pH 下降較快，隨著泡菜汁液中的營養(yǎng)元素逐漸消耗，后期乳酸菌生長緩慢則pH 下降緩慢。由圖1B 可知，各組的總酸含量在整個發(fā)酵過程中均逐漸增加，其中L5 單獨發(fā)酵組的總酸含量在整個發(fā)酵過程中均處于較高狀態(tài)，至發(fā)酵結束時達到3.50±0.02 g/kg，而L5+M1 共發(fā)酵組從發(fā)酵9 d 開始增加緩慢，在發(fā)酵結束時穩(wěn)定在2.46±0.01 g/kg，且顯著低于其他兩組（P＜0.05）。特定酵母菌可能對乳酸菌構成一定拮抗作用，抑制其生長產(chǎn)酸的同時還可以消耗乳酸，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的醇類物質(zhì)可與有機酸反應產(chǎn)生酯類芳香成分，所以添加酵母菌會降低泡菜中總酸含量[13,20]。陳安特等[5]的研究中接種釀酒酵母也可以提高pH，降低泡菜發(fā)酵后期總酸含量。

圖1 泡菜發(fā)酵過程中的pH 和總酸變化Fig.1 Changes of pH and total acid during paocai fermentation

2.2 芥菜發(fā)酵期間乳酸菌和酵母菌活菌數(shù)的變化

發(fā)酵過程的活菌數(shù)變化如圖2 所示，經(jīng)過減菌處理有效減少了蔬菜本底細菌和酵母菌，各組乳酸菌活菌數(shù)均先增加后降低，第6 d 的活菌數(shù)最多，L5 單獨發(fā)酵組高達8.94±0.03（lg CFU/mL）；發(fā)酵結束時各組均降至較低水平，且共發(fā)酵組的乳酸菌活菌數(shù)顯著低于其他兩組（P＜0.05）。自然發(fā)酵組和L5 單獨發(fā)酵組在發(fā)酵過程中未檢測到酵母菌，L5+M1 共發(fā)酵組在發(fā)酵過程中的酵母菌活菌數(shù)逐漸降低，但發(fā)酵結束時仍有3.48±0.02（lg CFU/mL）。發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量的增加導致pH 降低和總酸含量增加，同時乳酸菌自身的生長隨著產(chǎn)酸量的增加而受到抑制[21]。與乳酸菌相比，酵母菌受酸度的影響更大，大多數(shù)真菌的耐酸性較差，所以酵母菌活菌數(shù)隨著總酸含量的增加而降低得較明顯[22]。此外，酵母菌在無氧環(huán)境下生長代謝會與乳酸菌競爭利用還原糖，將糖類分解為乙醇，抑制發(fā)酵環(huán)境中腐敗菌生長繁殖的同時還能一定程度上抑制乳酸菌生長[23]。

圖2 泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌和酵母菌活菌數(shù)變化Fig.2 Changes of lactic acid bacteria and yeast count during paocai fermentation

2.3 芥菜發(fā)酵期間總酯含量的變化

如圖3 所示，L5+M1 共發(fā)酵組的總酯含量在整個發(fā)酵過程中均處于較高狀態(tài)，在第3 d 達到峰值，隨后開始逐漸降低，但在發(fā)酵結束時總酯含量仍有3.79±0.05 g/kg，自然發(fā)酵組的總酯含量在整個發(fā)酵過程中逐漸增加，但均低于L5+M1 共發(fā)酵組，L5 單獨發(fā)酵組的總酯含量在整個發(fā)酵過程中均較低。You 等[24]的研究中少孢哈薩克斯坦酵母（Kazachstania exigua）生長代謝與異戊醇、正己醇和β-苯乙醇等調(diào)味高級醇的產(chǎn)生具有很大的相關性，也是產(chǎn)生己酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸乙酯等風味物質(zhì)或促進其形成的最重要的微生物。李默等[25]從自然發(fā)酵錦州小菜中分離出的優(yōu)良酵母菌也具有較好的產(chǎn)酯能力。

圖3 泡菜發(fā)酵過程中總酯含量的變化Fig.3 Changes of total ester content during paocai fermentation

2.4 芥菜發(fā)酵期間亞硝酸鹽含量的變化

由圖4 可知，各組的“亞硝峰”均出現(xiàn)在發(fā)酵第3 d，隨后逐漸下降，但均未超過《食品中污染物限量國家標準》的規(guī)定含量（20 mg/kg）[26]。其中自然發(fā)酵組峰值最高為8.30±0.04 mg/kg，L5+M1 共發(fā)酵組峰值最低為2.26±0.04 mg/kg，發(fā)酵第15 d，所有組別中亞硝酸鹽含量都下降到3 mg/kg 以下，遠低于標準限量值。接菌發(fā)酵組泡菜發(fā)酵前期亞硝酸鹽含量遠低于自然發(fā)酵組可能是因為乳酸菌生長旺盛使泡菜快速酸化，在酸性條件下亞硝酸根離子可與氫離子結合形成亞硝酸，發(fā)生自身歧化反應生成二氧化氮和一氧化氮，從而使亞硝酸鹽含量逐漸降低[27]。在整個發(fā)酵過程中接菌發(fā)酵組亞硝酸鹽含量均低于自然發(fā)酵組，與任亭等[28]的研究結果一致。

圖4 泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.4 Changes of nitrite content during paocai fermentation

2.5 發(fā)酵芥菜保藏期理化性質(zhì)的變化

低酸低鹽泡菜在保藏期間可能會出現(xiàn)過度酸化、變色等現(xiàn)象，導致其口感變差、貨架期縮短[29]。保藏期內(nèi)理化指標測定結果如表2 所示，自然發(fā)酵組和L5 單獨發(fā)酵組的pH 極顯著下降（P＜0.01），L5+M1 共發(fā)酵組顯著下降（P＜0.05）；總酸含量均極顯著增加（P＜0.01），但L5+M1 共發(fā)酵組仍維持相對較低狀態(tài)；L5 單獨發(fā)酵組的總酯含量顯著增加（P＜0.05），L5+M1 共發(fā)酵組總酯含量極顯著增加（P＜0.01），且高于L5 單獨發(fā)酵組49.76%；自然發(fā)酵組和L5 單獨發(fā)酵組的亞硝酸鹽含量均極顯著降低（P＜0.01），L5+M1 共發(fā)酵組亞硝酸鹽含量顯著降低（P＜0.05）；自然發(fā)酵組和L5 單獨發(fā)酵組出現(xiàn)異味，感官總分也均極顯著下降（P＜0.01），但L5+M1 共發(fā)酵組仍維持較好的口感和風味，感官總分顯著高于其他兩組（P＜0.05），三組泡菜均未脹袋。帶入包裝的微生物組成、數(shù)量和初始理化性質(zhì)是影響保藏期品質(zhì)的主要因素?？傮w上，L5+M1 共發(fā)酵組在保藏期內(nèi)能維持較低的酸度和亞硝酸鹽含量以及較高的總酯含量和感官評分，可能是因為帶入酵母菌產(chǎn)生的醇類物質(zhì)與部分有機酸發(fā)生酯化反應生成芳香族化合物，增加香味的同時也防止了泡菜過酸[23,30-31]。（P＜0.01）。

表2 泡菜保藏期內(nèi)理化性質(zhì)的變化Table 2 Changes of physical and chemical properties during paocai storage

2.6 發(fā)酵芥菜保藏期質(zhì)構特性的變化

質(zhì)地是影響消費者接受度的重要因素，對芥菜發(fā)酵和保藏過程中的硬度、彈性和咀嚼性進行了分析（圖5）。與新鮮芥菜相比，各組芥菜在發(fā)酵后和保藏期內(nèi)硬度、彈性和咀嚼性均顯著降低（P＜0.05）。不同組在發(fā)酵結束時的質(zhì)構也有差異，自然發(fā)酵組的硬度顯著高于其他兩組（P＜0.05）；自然發(fā)酵組和L5+M1 共發(fā)酵組的彈性和咀嚼性沒有顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于L5 單獨發(fā)酵組（P＜0.05）。保藏期內(nèi)自然發(fā)酵組和L5 單獨發(fā)酵組出現(xiàn)軟化，但L5+M1 共發(fā)酵組的硬度、彈性和咀嚼性均顯著高于其他兩組（P＜0.05），在保藏期間能夠維持較好的質(zhì)地。

圖5 泡菜保藏期內(nèi)質(zhì)構的變化Fig.5 Changes of texture during paocai storage period

硬度與細胞膨壓和細胞壁結構有關，發(fā)酵過程中原果膠被果膠酶水解生成可溶性果膠或進一步水解成果膠酸，會使細胞之間粘結性降低，硬度下降，且酸性環(huán)境有利于促進原料中的果膠水解為果膠酸[5,32-33]。本研究中共發(fā)酵組保藏期內(nèi)硬度高于其他兩組可能是因為總酸含量較低，一定程度上抑制了原果膠的水解。與本研究結果一致，四川泡菜[34]在發(fā)酵過程中硬度和嚼勁也有所下降，腌制大白菜[8]在貯藏過程中硬度逐漸降低。

2.7 發(fā)酵芥菜保藏期色澤的變化

良好的色澤可以增加泡菜的感官品質(zhì)，增強視覺吸引力，對其品質(zhì)的提升有積極影響，樣品總色差值可以評判樣品外觀顏色變化程度。新鮮芥菜、發(fā)酵結束和保藏期間可以觀察到明顯的顏色差異（圖6），發(fā)酵結束各組的亮度值L*沒有顯著差異（P＞0.05），自然發(fā)酵組的紅綠值a*和黃藍值b*顯著低于其他兩組（P＜0.05），L5+M1 共發(fā)酵組的b*值最大，黃色度較高；但與新鮮芥菜相比各組由綠色變?yōu)辄S色，L*值均顯著降低（P＜0.05），a*和b*值均顯著升高（P＜0.05）。保藏期內(nèi)自然發(fā)酵組與L5 單獨發(fā)酵組發(fā)生褐變，顏色變暗，L*和b*值顯著降低（P＜0.05），色差變化值ΔE也較大；L5+M1 共發(fā)酵組的L*、b*值最大，顏色較亮、較黃，且與發(fā)酵結束時無顯著差異（P＞0.05），色差變化值ΔE也顯著低于其他兩組（P＜0.05），色澤最接近發(fā)酵結束時。

圖6 泡菜保藏期內(nèi)色差的變化Fig.6 Changes in color during paocai storage period

乳酸菌和酵母菌等發(fā)酵產(chǎn)生酶、有機酸和色素等代謝產(chǎn)物影響發(fā)酵蔬菜最終色澤的形成，發(fā)酵過程中一些微生物產(chǎn)生的酶可水解蔬菜中的類黃酮和類胡蘿卜素等天然色素，產(chǎn)生的功能代謝物能減少氧化等對色澤的影響[35-37]。除此之外，葉綠素、類胡蘿卜素等維持泡菜色澤的色素受酸性環(huán)境影響較大，過酸環(huán)境中容易被降解，從而導致泡菜變色[38]。本研究添加酵母菌對維持泡菜保藏期色澤具有有益作用，可能是因為酵母菌發(fā)酵過程中緩沖了過酸環(huán)境并產(chǎn)生了具有護色作用的代謝物，但其護色機制還需進一步研究。

3 結論

本研究接種少孢哈薩克斯坦酵母（Kazachstania exigua）M1 與腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）L5 共發(fā)酵泡菜能夠降低總酸和亞硝酸鹽含量、增加總酯含量，獲得更高的感官評分，且在保藏期內(nèi)總酸含量增加較少、總酯含量增加較多、亞硝酸鹽含量進一步降低，仍能維持低酸狀態(tài)和較高的感官評分，可有效解決泡菜過度酸化的問題；質(zhì)地和色澤也與發(fā)酵結束時更接近，能保持較高的脆度和較好的色澤。本研究結果說明通過人工接種適當?shù)娜樗峋徒湍妇M合能提升并維持泡菜保藏期的品質(zhì)，為生產(chǎn)低鹽低酸泡菜和減少化學添加提供參考依據(jù)。后續(xù)將對特征風味物質(zhì)、菌株間的相互作用等進行進一步試驗。

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