李曉華 鄭志剛

福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院 1 乳腺外科 2 普通外科,福建省福州市 350009

肝癌是一種嚴(yán)重威脅全球公共衛(wèi)生的高度致命惡性腫瘤,特征為快速生長、高度浸潤性和廣泛轉(zhuǎn)移。肝癌的診斷常在晚期,限制了有效治療的機(jī)會。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告,肝癌已成為全球第四大癌癥致死原因,每年導(dǎo)致近一百萬人死亡,給全球衛(wèi)生系統(tǒng)和患者家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)[1]?，F(xiàn)有治療方法包括手術(shù)、放射、化療等,但晚期患者的治療效果有限[2]。因此,尋找新的治療策略和靶點(diǎn)以提高患者的生存率和生活質(zhì)量至關(guān)重要。組蛋白修飾控制著染色質(zhì)的功能,而JMJD2家族成員(特別是JMJD2E)是調(diào)節(jié)這些修飾的關(guān)鍵?？梢越獬旧|(zhì)的緊密結(jié)合,從而激活與細(xì)胞增殖、生長和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的基因,這種活動可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中致癌基因的過度表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤生長和擴(kuò)散[3]。microRNA-372(miR372)已被證明在幾種人類癌癥中發(fā)揮重要作用。同時,在多種癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了JMJD2E對miR372的調(diào)控作用[4]。本研究主要探討JMJD2E在肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制,以及其與miR372之間的調(diào)控關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 體外肝癌細(xì)胞生長影響檢測 為了深入探究JMJD2E對肝癌細(xì)胞增殖的影響,筆者構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)JMJD2E的Hep3B細(xì)胞株。為了驗(yàn)證JMJD2E對細(xì)胞增殖的潛在抑制作用,筆者設(shè)計了CCK8實(shí)驗(yàn)來定量分析細(xì)胞活力。此外,為了評估其對細(xì)胞克隆能力的影響,筆者進(jìn)行了菌落形成效率實(shí)驗(yàn),其中細(xì)胞被種植在平皿中,允許形成可見菌落,進(jìn)一步以結(jié)晶紫染色和計數(shù)來確定菌落數(shù)量,這些實(shí)驗(yàn)的設(shè)計旨在模擬細(xì)胞在無限制條件下的生長能力。

1.2 體內(nèi)肝癌細(xì)胞生長影響檢測 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,筆者采用了異種移植模型來評估JMJD2E在活體內(nèi)對肝癌細(xì)胞生長的影響。通過將JMJD2E轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞懸浮液注射到Balb/C小鼠的皮下,筆者建立了腫瘤生長模型。腫瘤生長被定期監(jiān)測,隨后腫瘤被摘除并稱重,以物理量度來評估腫瘤體積變化。此外,筆者對摘除的腫瘤進(jìn)行了詳盡的組織學(xué)分析,包括HE染色,以確定腫瘤的細(xì)胞學(xué)特征和異質(zhì)性,從而提供對JMJD2E在體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞生長效果的直接證據(jù)。

1.3 JMJD2E對miR372表達(dá)影響檢測 考慮到miR372在肝癌發(fā)展中的潛在角色,筆者采用了一系列分子生物學(xué)技術(shù)來研究JMJD2E如何調(diào)節(jié)其表達(dá)。利用RT-PCR和Western blotting,筆者定量分析了miR372及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平。通過CHIP實(shí)驗(yàn),筆者評估了JMJD2E對miR372啟動子區(qū)域結(jié)合蛋白的影響。EMSA和RIP實(shí)驗(yàn)被用來研究特定蛋白與miR372啟動子區(qū)域的相互作用,以及這些相互作用對miR372表達(dá)調(diào)節(jié)的潛在影響。這些技術(shù)的綜合使用使筆者能夠全面地分析JMJD2E對miR372表達(dá)的調(diào)控作用。

2 結(jié)果

2.1 JMJD2E在體外抑制肝癌細(xì)胞生長 筆者研究了JMJD2E對Hep3B肝癌細(xì)胞生長的影響。通過建立兩個Hep3B細(xì)胞株,一個作為對照組(轉(zhuǎn)染pCMV6-AC-GFP),另一個過表達(dá)JMJD2E(轉(zhuǎn)染pCMV6-AC-GFP-JMJD2E),筆者通過RT-PCR和Western blotting確認(rèn)了JMJD2E的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,JMJD2E顯著抑制了細(xì)胞的增殖(見圖1a),過量的JMJD2E顯著減少了生長肝癌細(xì)胞Hep3B含量(見圖1b)。同時,JMJD2E顯著抑制了菌落形成(見圖1c),BrdU標(biāo)記的增殖率也顯著降低(見圖1d)。驗(yàn)證了JMJD2E能減緩Hep3B細(xì)胞的惡性生長。

圖1 JMJD2E在體外抑制肝癌細(xì)胞生長

2.2 JMJD2E在體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞生長 筆者進(jìn)一步在Balb/C小鼠模型中研究了JMJD2E的體內(nèi)效果(Balb/C小鼠腋下皮下注射轉(zhuǎn)染了pCMV6-AC-GFP、pCMV6-AC-GFP-JMJD2E的Hep3B細(xì)胞后形成的異種移植腫瘤)。JMJD2E的過表達(dá)顯著減少了小鼠體內(nèi)異種移植腫瘤的重量(見圖2a、b),并且腫瘤組織學(xué)分析腫瘤切片蘇木精—伊紅(HE)染色結(jié)果顯示低分化細(xì)胞減少(見圖2c)。這些結(jié)果表明,JMJD2E在體內(nèi)也能抑制肝癌細(xì)胞的生長。

圖2 JMJD2E在體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞生長

2.3 JMJD2E在表觀遺傳學(xué)上減弱miR372的表達(dá) 考慮到JMJD2E與miR372在肝癌中可能的負(fù)相關(guān)關(guān)系,筆者檢查了JMJD2E對miR372表達(dá)的影響。筆者在轉(zhuǎn)染了pCMV6-AC-GFP-JMJD2E的Hep3B細(xì)胞系中,觀察到JMJD2E的過表達(dá)(見圖3a)。筆者發(fā)現(xiàn)JMJD2E促進(jìn)了H3K36me3和DNMT1與miR372啟動子的相互作用,增加了甲基化(見圖3b、c)。此外,筆者發(fā)現(xiàn)JMJD2E促進(jìn)了miR372啟動子區(qū)域的甲基化(見圖3d)。JMJD2E還減少了CRE元件的活性及多個轉(zhuǎn)錄因子的負(fù)載(見圖3e～g),并抑制了CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)的形成,影響了CREB、P300、RNApolII進(jìn)入該環(huán)(見圖3h)。這導(dǎo)致了miR372各個成熟階段的顯著降低(見圖3i、j)。這些發(fā)現(xiàn)支持了JMJD2E通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制抑制miR372,從而可能影響肝癌細(xì)胞的惡性行為。

圖3 JMJD2E在表觀遺傳學(xué)上減弱miR372的表達(dá)

3 討論

肝癌是一種高度惡性的癌癥,尋找有效的治療靶點(diǎn)對于提高患者生存率至關(guān)重要[5]。本研究探討了組蛋白去甲基化酶JMJD2E在肝癌細(xì)胞中的作用及其與miR372的關(guān)系。首先,筆者通過轉(zhuǎn)染穩(wěn)定的Hep3B細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)JMJD2E的高表達(dá)顯著抑制了細(xì)胞的增殖和生長,并降低了集落形成效率。此外,異種移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了JMJD2E的抑制效應(yīng)。在分子水平上,JMJD2E過表達(dá)導(dǎo)致JMJD2E mRNA和蛋白的顯著降低。筆者進(jìn)一步研究了JMJD2E對miR372的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,JMJD2E促進(jìn)了miR372啟動子區(qū)域的甲基化,并降低了關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子如CREB、P300和RNApolII在該區(qū)域的負(fù)載。這導(dǎo)致了miR372的表達(dá)和成熟的顯著降低?？偟膩碚f,本研究揭示了JMJD2E在抑制肝癌細(xì)胞的生長和在表觀遺傳學(xué)水平上減弱miR372的表達(dá)中的關(guān)鍵作用,為肝癌治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和策略。

以鉑為基礎(chǔ)的藥物如順鉑(cisplatin,CP)是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的一線化療藥物。相關(guān)研究結(jié)果顯示,JMJD2去甲基化酶是克服NSCLC CP耐藥性的潛在治療靶點(diǎn)[6]。Chen等[7]研究顯示,JMJD2D在多發(fā)性惡性腫瘤,特別是結(jié)直腸癌(CRC)和肝細(xì)胞癌(HCC)的進(jìn)展中也是一種成熟的表觀遺傳促進(jìn)因子。LI等[8]研究人員發(fā)現(xiàn),JMJD2A通過下調(diào)腫瘤抑制因子miR-491-5p促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長并抑制細(xì)胞凋亡。因此,JMJD2家族在多種癌癥類型中的異常表達(dá)與癌癥的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)。深入了解JMJD2酶家族在癌癥發(fā)展中的確切作用和分子機(jī)制將有助于揭示新的治療靶點(diǎn)和癌癥干預(yù)策略,為癌癥患者的治療提供新的希望[9]。筆者的研究揭示了JMJD2E在人肝癌細(xì)胞株Hep3B中的抑制作用。通過轉(zhuǎn)染穩(wěn)定的Hep3B細(xì)胞株,筆者證實(shí)了JMJD2E的高表達(dá)能夠顯著減少Hep3B細(xì)胞的增殖和生長。這一現(xiàn)象在分子水平上得到了支持,因?yàn)镴MJD2E的過表達(dá)導(dǎo)致了JMJD2E mRNA和蛋白的顯著降低。此外,集落形成實(shí)驗(yàn)和BrdU陽性率測定結(jié)果均表明,JMJD2E的高表達(dá)可顯著降低Hep3B細(xì)胞的集落形成效率和增殖活性。更具意義的是,筆者的體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了JMJD2E的抑制效應(yīng),因?yàn)镴MJD2E的過表達(dá)使異種移植物腫瘤的生長明顯減緩,同時還導(dǎo)致了腫瘤組織中低分化細(xì)胞的減少,表明JMJD2E在調(diào)控肝癌細(xì)胞生長方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

Lin等[10]研究觀察表明,miR372通過miR372-YB-1-β-catenin-LEF/TCF4-PKM2-erbB-2軸激活癌細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)-細(xì)胞周期蛋白 E-P21/Cip1復(fù)合物來促進(jìn)肝臟周期進(jìn)程,提示miR372可以作為肝癌的一種新的治療靶點(diǎn)。另一項(xiàng)研究結(jié)果表明,miR-372抑制了在肝癌中高度表達(dá)的 ATAD2的表達(dá),并在肝癌發(fā)展中發(fā)揮了原癌基因的作用[11]。同時,在多種癌癥類型中,miR-372的過表達(dá)已被觀察到,特別是在肝癌、乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌等腫瘤中。這種過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力的增強(qiáng)相關(guān),可能通過抑制抑癌基因的表達(dá)以及促進(jìn)癌基因的表達(dá)來推動腫瘤生長和擴(kuò)散[12]。筆者進(jìn)一步研究了JMJD2E與miR372之間的調(diào)控機(jī)制,特別是在表觀遺傳學(xué)水平上。前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)JMJD2E在人肝癌組織中與miR372呈負(fù)相關(guān),因此筆者對JMJD2E是否能夠減弱miR372的表達(dá)進(jìn)行了深入探究。本研究發(fā)現(xiàn),在JMJD2E過表達(dá)的Hep3B細(xì)胞中,JMJD2E促進(jìn)了H3K36me3與miR372啟動子之間的相互作用,這可能導(dǎo)致miR372的抑制。此外,JMJD2E還增加了DNMT1與miR372啟動子之間的相互作用,導(dǎo)致miR372啟動子區(qū)域的甲基化增加。這些結(jié)果表明JMJD2E通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和甲基化狀態(tài),以及對關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子如CREB、P300和RNApolII的調(diào)控,抑制了miR372的正常表達(dá)和成熟?？傮w而言,JMJD2E在表觀遺傳學(xué)水平上對miR372的抑制作用揭示了其在肝癌發(fā)展中的潛在重要性。

總之,組蛋白去甲基化酶JMJD2E可抑制肝癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展,其機(jī)制可能與抑制miR372的表達(dá)相關(guān)。這些研究結(jié)果不僅有助于深入理解JMJD2E在肝癌中的作用機(jī)制,還為肝癌治療和相關(guān)疾病的治療策略提供了新的見解和潛在靶點(diǎn)。然而,仍需進(jìn)一步研究以確定JMJD2E與miR372之間的分子交互作用的詳細(xì)機(jī)制,并且需要進(jìn)一步研究確定其在肝癌發(fā)展中的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。