李玥 王興榮 張彥軍 王紅梅 祁旭升

收稿日期：2024 - 01 - 18

基金項(xiàng)目：蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（2022-RC-64）；甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研條件建設(shè)及成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃）（2021GAAS04）；2022年省級(jí)重點(diǎn)人才項(xiàng)目（農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)利用與人才培養(yǎng)）（2022RCXM083）；甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項(xiàng)目（2023GAAS34）。

作者簡(jiǎn)介：李? ?玥（1987 — ），女，山東濟(jì)南人，助理研究員，碩士，主要從事大豆種質(zhì)資源與遺傳育種研究工作。Email： lyue31@126.com。

通信作者：祁旭升（1966 — ），男，甘肅會(huì)寧人，研究員，主要從事大豆種質(zhì)資源與遺傳育種研究工作。Email： qixusheng6608@sina.com。

摘要：為篩選出大豆萌發(fā)期抗旱性鑒定的適宜試驗(yàn)條件，以大豆品種隴中黃601、懇鑒豆15、九農(nóng)29、長(zhǎng)農(nóng)16為供試材料，采用蛭石法和濾紙法進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，運(yùn)用內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internally Transcribed Spacer，ITS）序列分析法進(jìn)行發(fā)芽床篩選，測(cè)定各供試大豆品種的發(fā)芽率、硬實(shí)豆數(shù)、發(fā)霉豆數(shù)，并進(jìn)行了蛭石濕度和PEG-6000濃度篩選。結(jié)果表明，蛭石法發(fā)芽試驗(yàn)?zāi)苊黠@減少大豆發(fā)芽試驗(yàn)中產(chǎn)生霉菌的種類與數(shù)量，適宜在大豆萌發(fā)期抗旱性鑒定中應(yīng)用。且在蛭石濕度為170%、PEG-6000濃度為22%的條件下，不同大豆品種間的發(fā)芽率差異比較明顯，硬實(shí)豆數(shù)和發(fā)霉豆數(shù)少，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，可作為大豆萌發(fā)期抗旱性鑒定試驗(yàn)的適宜條件。且在此條件下，4個(gè)供試大豆品種的抗旱性表現(xiàn)由強(qiáng)到弱依次為隴中黃601、九農(nóng)29、長(zhǎng)農(nóng)16、懇鑒豆15。

關(guān)鍵詞：大豆；萌發(fā)期；抗旱性鑒定；蛭石法；發(fā)芽床；蛭石濕度；PEG-6000濃度

中圖分類號(hào)：S565.1? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? 文章編號(hào)：2097-2172（2024）04-0337-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.04.007

Study on the Methods for Drought Resistance Identification of Different Soybean Varieties at Germination Stage

LI Yue， WANG Xingrong， ZHANG Yanjun， WANG Hongmei， QI Xusheng

［1. Crop Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Innovation in the Cold and Arid Northwest Region， Ministry of Agriculture and Rural Affairs

（Jointly Established by the Ministry and Province）， Lanzhou Gansu 730070， China］

Abstract： To select appropriate experimental conditions for the identification of drought resistance during the germination period of soybeans， varieties Longzhonghuang 601， Kenjiandou 15， Jiunong 29， and Changnong 16 were used as test materials. Germination tests were conducted using vermiculite and filter paper methods， with screening of germination beds through Internally Transcribed Spacer （ITS） sequence analysis. The germination rate， number of hard beans， and number of moldy beans were measured， along with selection for vermiculite moisture and PEG-6000 concentration. Results showed that the vermiculite method significantly reduced the types and quantities of molds in soybean germination tests， making it suitable for drought resistance identification during the germination period. At a vermiculite moisture of 170% and PEG-6000 concentration of 22%， significant differences in germination rates among the soybean varieties were observed， with fewer hard and moldy beans， providing reliable test data. These conditions are suitable for drought resistance identification tests during the soybean germination period. Under these conditions， the drought resistance of the 4 soybean varieties ranked from strongest to weakest as followed Longzhonghuang 601， Jiunong 29， Changnong 16 and Kenjiandou 15.

Key words： Soybean; Germination stage; Drought resistance identification; Vermiculite method; Germination bed; Vermiculite moisture; PEG-6000 concentration

大豆為豆科大豆屬一年生雙子葉草本植物，是世界上最重要的豆類作物，具有食用、飼用和釀造等多種應(yīng)用價(jià)值。大豆生長(zhǎng)期需水較多，水分對(duì)大豆的產(chǎn)量形成具有重要的作用［1 - 2 ］。隨著全球氣候的變化，干旱已成為全球最大的自然災(zāi)害之一，干旱脅迫下作物各時(shí)期的生長(zhǎng)發(fā)育都會(huì)受到影響，成為影響作物產(chǎn)量的重要障礙因子［3 ］。萌發(fā)期是大豆整個(gè)生活史的關(guān)鍵階段，如果萌發(fā)期水分不足，容易出現(xiàn)缺苗斷壟現(xiàn)象，最終導(dǎo)致產(chǎn)量及品質(zhì)降低［4 - 6 ］。萌發(fā)期抗旱性鑒定也是大豆抗旱性鑒定研究的關(guān)鍵，鑒定大豆萌發(fā)期抗旱性、篩選抗旱種質(zhì)資源，對(duì)大豆抗旱品種選育、抗旱機(jī)理及干旱調(diào)控緩解機(jī)制研究具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外研究表明，作物品種間萌發(fā)期的抗旱性存在很大差異。陳學(xué)珍等［7 ］在干旱脅迫下對(duì)20個(gè)大豆品種進(jìn)行芽期抗旱性鑒定，獲得丹豆6、海94和蒙城小黑豆等3份抗旱性種質(zhì)；肖佳雷等［8 ］對(duì)78份大豆種質(zhì)資源進(jìn)行了發(fā)芽期抗旱鑒定，獲得耐旱品種5個(gè)、較耐旱品種18個(gè)；Nayer等［9 ］對(duì)玉米品種704和301進(jìn)行聚乙二醇（PEG-6000）誘導(dǎo)的水分脅迫研究表明，品種704的萌發(fā)率下降幅度高于品種301；Kumar等［10 ］和Delachiave等［11 ］一致認(rèn)為，在干旱脅迫下，作物不同品種間差異顯著；Willanborb等［12 ］ 的研究顯示，包衣種子的萌發(fā)特性受到滲透脅迫的影響。研究者對(duì)不同大豆品種的抗旱性進(jìn)行評(píng)價(jià)研究的結(jié)果顯示，不同品種抗旱性可歸為抗旱型品種、干旱敏感型品種和較抗旱型品種［13 - 16 ］。

利用聚乙二醇（PEG-6000）高滲溶液模擬干旱脅迫來(lái)研究種子萌發(fā)期的抗旱性是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的手段［4， 8， 17 - 20 ］。梁崢等［17 ］在30%的PEG- 6000濃度下研究了大豆子葉中幾種酶活性和可溶性蛋白含量的變化。張榮平等［18 ］采用15%、30%、45%等3種PEG-6000濃度處理大豆種子，研究了各處理對(duì)大豆種子下胚軸脂敘合酶活性及脯氨酸含量的影響。顧龔平等［19 ］采用20%的PEG-6000濃度處理研究了其對(duì)大豆幼苗活力和活性氧代謝的影響。舒英杰等［20 ］認(rèn)為，室內(nèi)采用 PEG-6000 浸種法模擬干旱脅迫鑒定大豆發(fā)芽期耐旱性的適宜濃度為20%～25%。綜上研究結(jié)果認(rèn)為，PEG-6000模擬干旱脅迫的濃度因作物和品種而異，利用濾紙作為基質(zhì)進(jìn)行的發(fā)芽試驗(yàn)，盡管采取了無(wú)菌處理和每天更換溶液，但在PEG-6000脅迫處理下與空白對(duì)照均會(huì)出現(xiàn)硬實(shí)豆和豆粒發(fā)霉的現(xiàn)象，這極大地影響了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，進(jìn)而影響了對(duì)種質(zhì)資源的篩選評(píng)價(jià)。

本研究利用不同發(fā)芽床、不同濃度的 PEG- 6000 模擬干旱脅迫篩選處理濃度和不同蛭石濕度等試驗(yàn)條件，分析適于進(jìn)行大豆種子萌發(fā)期抗旱性鑒定的條件，以期為利用滲透脅迫鑒定大豆種子萌發(fā)期的抗旱性提供依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

供試大豆材料為隴中黃601、懇鑒豆15、九農(nóng)29、長(zhǎng)農(nóng)16，均由國(guó)家作物種質(zhì)資源庫(kù)（甘肅分庫(kù)）提供，其中隴中黃601田間表現(xiàn)抗旱性較高，懇鑒豆15抗旱性較弱。供試蛭石（1～3 mm）和PEG-6000（Molecular Biology Grade）均采購(gòu)于蘭州博域生物科技有限責(zé)任公司。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 濾紙法發(fā)芽試驗(yàn)? ? 選擇大小、色澤一致，飽滿、種皮完好的大豆種子，用10% NaClO溶液消毒15 min，然后用無(wú)菌水沖洗4～5次。按照30粒/皿的標(biāo)準(zhǔn)置于直徑為15 cm、鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，分別加入30 mL體積濃度為20%、21%、22%、23%、24%的PEG-6000溶液，置于光照培養(yǎng)箱中在（25±1）℃、光照16 h的條件下催芽培養(yǎng)，利用稱重法每天向培養(yǎng)皿中補(bǔ)充加水。3次重復(fù)。

1.2.2? ? 蛭石法發(fā)芽試驗(yàn)? ? 按照設(shè)定的蛭石濕度（110%、130%、150%、170%、190%）將蛭石分別與溶劑（無(wú)菌水/濃度為20%、21%、22%、23%、24%的PEG-6000溶液）混合均勻后，各取35 g平鋪在直徑為15 cm培養(yǎng)皿中，按照30粒/皿的標(biāo)準(zhǔn)均勻放置用濕巾揉搓干凈的大豆種子，再覆蓋一層混合均勻的蛭石至培養(yǎng)皿上邊緣，用保鮮膜包好，在保鮮膜上扎10個(gè)小孔，放入人工培養(yǎng)箱中，在溫度為23 ℃、相對(duì)濕度為85%、光照16 h的條件下催芽培養(yǎng)。3次重復(fù)。

1.3? ?蛭石濕度確定

蛭石濕度=（溶液體積×100）/蛭石干重

發(fā)芽培養(yǎng)按照1.2.2 蛭石法發(fā)芽試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行。共設(shè)5個(gè)蛭石濕度，分別為110%、130%、150%、170%、190%，3次重復(fù)。于培養(yǎng)第7天統(tǒng)計(jì)大豆發(fā)芽數(shù)、硬實(shí)豆數(shù)、發(fā)霉豆數(shù)，并計(jì)算各大豆品種的發(fā)芽率。

1.4? ?PEG-6000適宜濃度確定

共設(shè)5個(gè)PEG-6000濃度處理，分別為20%、21%、22%、23%、24%。3次重復(fù)。以1.3確定的蛭石濕度準(zhǔn)備培養(yǎng)基質(zhì)，于培養(yǎng)第7天統(tǒng)計(jì)大豆發(fā)芽數(shù)、硬實(shí)豆數(shù)、發(fā)霉豆數(shù)，并計(jì)算各大豆品種的發(fā)芽率。

1.5? ?ITS序列分析

將2種方法中出現(xiàn)的不同顏色、不同形態(tài)的霉菌采用 Qiagen DNeasy PowerSoil Pro Kit（Cat No. 47014 /47016） 進(jìn)行核酸提取，檢測(cè)核酸完整度和濃度后送蘇州佳世生物技術(shù)有限公司進(jìn)行ITS序列分析。使用高保真酶對(duì)DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，并使用Invitrogen Qubit 4.0 熒光定量?jī)x進(jìn)行濃度定量。使用KAPA Hyper Prep Kit 進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，使用 Illumina NovaSeq 進(jìn)行測(cè)序。

1.6? ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用 Microsoft Excel 2013 整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用IBM SPSS 19 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?萌發(fā)試驗(yàn)發(fā)芽床確定

濾紙法發(fā)芽試驗(yàn)和蛭石法發(fā)芽試驗(yàn)均于試驗(yàn)第7天分別出現(xiàn)5種和2種不同顏色、不同形態(tài)的霉菌（封三圖1），對(duì)其進(jìn)行基因組DNA提取，并將提取的DNA樣品送蘇州佳世生物技術(shù)有限公司進(jìn)行ITS序列分析，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)（Raw reads）進(jìn)行過(guò)濾處理，對(duì)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行去接頭、拼接、過(guò)濾、去嵌合體，得到有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。將有效數(shù)據(jù)與真菌UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)（https： //unite.ut.ee）按照97%的相似度進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行物種分類，獲得物種匹配數(shù)。ITS序列分析結(jié)果（封三圖2）顯示，濾紙法發(fā)芽試驗(yàn)共出現(xiàn)9個(gè)屬（嗜熱真菌屬、德克酵母屬、念珠菌、根酶菌屬、布氏白粉菌屬、馬拉色菌屬、曲霉菌屬、青霉菌屬、維多利亞維希尼克氏酵母）的真菌，蛭石法發(fā)芽試驗(yàn)共出現(xiàn)3個(gè)屬（根酶菌屬、曲霉菌屬、青霉菌屬）的真菌，而且蛭石法發(fā)芽試驗(yàn)中匹配上的霉菌數(shù)明顯比濾紙法的少。由此可見(jiàn)，蛭石法發(fā)芽試驗(yàn)?zāi)苊黠@減少霉菌種類與數(shù)量，可保證發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，蛭石法發(fā)芽試驗(yàn)取消了清洗種子和每天加水的步驟，明顯降低了試驗(yàn)工作量和試驗(yàn)投入成本。綜上認(rèn)為，蛭石發(fā)芽床更適宜進(jìn)行大豆萌發(fā)期抗旱性研究，蛭石法可替代溶液濾紙法應(yīng)用于大豆萌發(fā)期的抗旱性研究。

2.2? ?蛭石濕度的確定

由圖3可知，隨著蛭石濕度的增加，各供試大豆品種的發(fā)芽率均呈先增加再降低的趨勢(shì)。其中在170%的蛭石濕度條件下，各供試大豆品種發(fā)芽率均達(dá)到90%以上（圖3-A）。在該條件下，懇鑒豆15的硬實(shí)豆數(shù)為3.0粒，隴中黃601、長(zhǎng)農(nóng)16、九農(nóng)29的硬實(shí)豆數(shù)均為0（圖3-B）；懇鑒豆15、長(zhǎng)農(nóng)16的發(fā)霉豆數(shù)均為2.0粒；隴中黃601、九農(nóng)29的發(fā)霉豆數(shù)均為0（圖3-C）。根據(jù)以上結(jié)果，最終確定發(fā)芽試驗(yàn)最佳蛭石濕度為170%。

2.3? ?PEG-6000濃度篩選

從表1可以看出，4個(gè)大豆品種在不同PEG-6000濃度處理下發(fā)芽率均受到不同程度的抑制。當(dāng)PEG-6000濃度達(dá)到23%以上時(shí)，4個(gè)供試大豆品種的平均發(fā)芽率均低于45%，出苗率過(guò)低，幼苗生活力極差，已失去生產(chǎn)意義，不適合用于模擬干旱脅迫。PEG-6000濃度為22%時(shí)，4個(gè)供試大豆品種的發(fā)芽率均在50%以上，且出現(xiàn)發(fā)霉豆數(shù)和硬實(shí)豆數(shù)的比例均低于PEG-6000濃度為20%、21%的處理，而硬實(shí)豆數(shù)和發(fā)霉豆數(shù)情況的存在，會(huì)嚴(yán)重影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，因此在發(fā)芽試驗(yàn)中應(yīng)盡可能降低硬實(shí)豆數(shù)和發(fā)霉豆數(shù)所占的比例。當(dāng)PEG-6000濃度為22%時(shí)，不同大豆品種的發(fā)芽率有明顯差異，其中隴中黃601與其余品種差異均達(dá)顯著水平；九農(nóng)29與懇鑒豆15差異不顯著，但與長(zhǎng)農(nóng)16差異達(dá)顯著水平；懇鑒豆15與長(zhǎng)農(nóng)16差異不顯著。由此可見(jiàn)，22%的PEG-6000濃度適合作為模擬干旱脅迫的PEG濃度。且在此濃度脅迫下，4個(gè)供試大豆品種的抗旱性表現(xiàn)由強(qiáng)到弱依次為隴中黃601、九農(nóng)29、長(zhǎng)農(nóng)16、懇鑒豆15，與田間表現(xiàn)一致。

3? ?討論與結(jié)論

種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)發(fā)育的前提，是對(duì)環(huán)境因素最為敏感的階段。隨著環(huán)境干旱的不斷加重，對(duì)種子萌發(fā)的影響也越來(lái)越大。目前，多數(shù)學(xué)者們采用PEG-6000模擬干旱脅迫用于篩選和鑒定作物的抗旱性，并在小麥、棉花、玉米、苜蓿、紫蘇等作物上篩選到了抗旱性較好的品種［21 - 25 ］。李鳳珍等［26 ］采用濾紙法發(fā)芽床，經(jīng)20% PEG-6000滲透脅迫處理，篩選出強(qiáng)抗旱性品種小紅麥；魯守平等［27 ］在 PEG-6000 模擬干旱脅迫條件下篩選出抗旱性較強(qiáng)的烏拉爾甘草1號(hào)和烏拉爾甘草2號(hào)。本研究采用PEG-6000模擬干旱法研究了大豆種質(zhì)資源抗旱性鑒定方法，將發(fā)芽床由普遍使用的濾紙?zhí)鎿Q為蛭石，大大降低了大豆較難解決的萌發(fā)發(fā)霉豆數(shù)和硬實(shí)豆數(shù)問(wèn)題，提高了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。最終確定大豆萌發(fā)期PEG-6000最適脅迫濃度為22%、蛭石最適濕度為170%。在該試驗(yàn)條件下，降低了大豆萌發(fā)期研究中出現(xiàn)的較難解決的發(fā)霉豆數(shù)和硬實(shí)豆數(shù)問(wèn)題，提高了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，并可減少試驗(yàn)工作量和投入成本。由此可見(jiàn)，蛭石法可替代溶液濾紙法用于大豆萌發(fā)期的抗旱性研究。

ITS序列分析結(jié)果表明，蛭石法發(fā)芽試驗(yàn)?zāi)苊黠@減少大豆發(fā)芽試驗(yàn)中霉菌的種類與數(shù)量，更適宜進(jìn)行大豆萌發(fā)期抗旱性研究。在蛭石濕度為170%、PEG-6000濃度為22%條件下，不同大豆品種間發(fā)芽率差異比較明顯，硬實(shí)豆數(shù)和發(fā)霉豆數(shù)少，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，適合作為進(jìn)行大豆萌發(fā)期抗旱性鑒定的適宜試驗(yàn)條件。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，4個(gè)供試大豆品種的抗旱性表現(xiàn)由強(qiáng)到弱依次為隴中黃601、九農(nóng)29、長(zhǎng)農(nóng)16、懇鑒豆15，這與田間表現(xiàn)一致。

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［20］ 舒英杰，周玉麗，時(shí)俠清，等.? 大豆種子發(fā)芽期耐旱性鑒定的適宜PEG-6000濃度篩選［J］．? 大豆科學(xué)，2015（1）：56-59．

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［25］ 李? ?丹，石瀏芃.? PEG-6000 模擬干旱脅迫對(duì)紫蘇種子萌發(fā)的影響［J］．? 寒旱農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，1（12）：167-170．

［26］ 李鳳珍，馬曉崗．? PEG 處理下青海栽培小麥萌發(fā)期及幼苗期抗旱性研究［J］．? 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（21）：44-48．

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