摘要：［目的］為了解青蒿（Artemisia annua L.）查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）基因家族的分子進(jìn)化特性及其在不同組織部位的表達(dá)情況。［方法］從Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)下載CHS 蛋白HMM 模型，并使用HUMMER 3. 0、Blastp 和CD-search 鑒定出青蒿基因組中的CHS 基因家族成員。采用TBtools、EXPASy、CELLO v. 2. 5、MEGA 7. 0、MEME、SOPMA、SWISSMODEL 和PlantCARE 等軟件對(duì)其氨基酸與堿基序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過(guò)8 個(gè)不同組織部位的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì) AaCHS 基因家族成員進(jìn)行表達(dá)分析。［結(jié)果］青蒿基因組中共有16 個(gè)AaCHS 基因家族成員，蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示AaCHS 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，將其分為4 個(gè)組，基因結(jié)構(gòu)分析顯示所有AaCHS 基因蛋白均具有外顯子，數(shù)量為2～4，內(nèi)含子數(shù)量為0～2，其中8 個(gè)AaCHS 基因不具有內(nèi)含子。啟動(dòng)子順式作用元件分析表明該基因家族成員啟動(dòng)子上含有大量光響應(yīng)、植物激素響應(yīng)元件；CD-search 驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)AaCHS 蛋白均有Chalsti-synt_N 結(jié)構(gòu)域。［結(jié)論］AaCHS 家族成員表達(dá)分析結(jié)果表明，16 個(gè)AaCHS 基因在不同組織和光處理下表達(dá)不同。GO 富集結(jié)果得到GO 二級(jí)分類(lèi)的生物過(guò)程和分子功能，生物過(guò)程共富集了80 條序列；細(xì)胞組分共富集了19 條序列，其中二級(jí)分類(lèi)過(guò)程細(xì)胞質(zhì)中富集了11 條序列，數(shù)量最多，與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致；推測(cè)AaCHS 基因在細(xì)胞質(zhì)中調(diào)控黃酮類(lèi)化合物的累積。通過(guò)青蒿光調(diào)控差異表達(dá)分析，推測(cè)AaCHS7、AaCHS10 在青蒿受到紅光光處理中起正向調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：青蒿； CHS 基因家族； 光調(diào)控； 基因表達(dá)； 差異基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)：R932；S567.219 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-8151（2024）01-0001-13

青蒿（Artemisia annua L.）是菊科的成員，具有相當(dāng)大的藥用、觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。青蒿素以青蒿為提取來(lái)源，是目前治療瘧疾的最有效的藥物。瘧疾是由原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)瘧原蟲(chóng)引起的毀滅性疾?。?］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2015 年的數(shù)據(jù)，約有33億人面臨感染瘧疾的風(fēng)險(xiǎn)，12 億人處于高風(fēng)險(xiǎn)［3］。有研究表明青蒿素和黃酮類(lèi)化合物在治療包括瘧疾在內(nèi)的各種疾病方面具有協(xié)同作用［4-5］。黃酮類(lèi)化合物作為植物抗毒素或抗氧化劑，具有清除活性氧（ROS）的能力［6］，并保護(hù)植物免受非生物和生物脅迫的損害，包括UV 照射、冷脅迫、病原體感染和昆蟲(chóng)取食［7-9］。許多青蒿素和類(lèi)黃酮生物合成途徑的酶的增加，通常與產(chǎn)物豐度增加相關(guān)聯(lián)［10］。但在青蒿中對(duì)于它們的生物合成途徑及調(diào)控的研究報(bào)導(dǎo)還比較少，所以探究青蒿中黃酮化合物合成途徑關(guān)鍵基因及其表達(dá)具有重要意義。

查爾酮合成酶（CHS）是植物聚酮合酶超家族的成員，其還包括芪合酶（STS）、吖啶酮合酶、吡喃酮合酶、聯(lián)芐基合酶和對(duì)香豆酰三乙酸合酶［11］。黃酮類(lèi)化合物在植物防御中起著重要的作用，而CHS 作為黃酮類(lèi)化合物生物合成的關(guān)鍵酶基因，在調(diào)節(jié)該途徑中起著重要的作用。此外，查爾酮合成酶為在開(kāi)花植物中具有重要作用的黃酮類(lèi)化合物提供起始材料，如提供花色素、抗生素、UV 保護(hù)劑和驅(qū)蟲(chóng)劑［12］。由于CHS 在類(lèi)黃酮生產(chǎn)中的重要性，在植物中已經(jīng)得到了很好的研究，如矮牽牛（Petunia hybrida）CHS 基因家族的每個(gè)成員由2個(gè)外顯子組成，由1 個(gè)大小和序列可變的內(nèi)含子分隔，內(nèi)含子位于保守位置［13］；玉米中的2 個(gè)CHS 基因，具有高度同源的外顯子序列，在編碼區(qū)上游5 ′和下游3 ′序列以及內(nèi)含子中有很大差異［14］；菊花（Chrysanthemum nankingense）中鑒定出16 個(gè)CnCHS 基因家族成員，大多數(shù)含有2 個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，具有Chal-sti-synt_N 和Chal-stisynt_C 結(jié)構(gòu)域，其中CnCHS10 在花器官中的表達(dá)水平高于營(yíng)養(yǎng)組織［15］。芒果（Mangifera indicaL.）中MiCHS4、MiCHS16 和MiCHS17 響應(yīng)UVB和可見(jiàn)光處理［16］。

光作為一個(gè)重要的環(huán)境調(diào)控因子，不僅是植物光合作用的主要能量來(lái)源，同時(shí)也在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［17］。有研究表明不同光質(zhì)處理可使AaCHS 表達(dá)上調(diào)，刺葡萄（Vitisdavidii）中發(fā)現(xiàn)VdCHS2 和VdCHS3 在綠光、藍(lán)光、暖黃光處理下表達(dá)量先升高后降低［18］；非洲菊（Gerbera hybrida）中發(fā)現(xiàn)藍(lán)光和紅光促進(jìn)CHS 基因表達(dá)［19］。

目前，雖然對(duì)于CHS 的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但是AaCHS 基因家族分析未見(jiàn)報(bào)道，其在青蒿中的功能尚不清楚。本研究基于青蒿已公布的參考基因組，鑒定了AaCHS 基因家族成員。本研究驗(yàn)證了這些成員的序列特征、蛋白質(zhì)保守基序、順式作用元件和編碼序列。同時(shí)，還分析了CHS 蛋白結(jié)構(gòu)域及其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，并繪制了在青蒿不同組織器官和光調(diào)控條件下的表達(dá)量熱圖。最后，篩選出在不同光調(diào)控條件下差異表達(dá)的CHS 基因。研究結(jié)果對(duì)挖掘具有特殊功能的青蒿中CHS 基因家族成員具有重要意義。

1 材料與方法

1. 1 AaCHS 基因家族成員鑒定與序列特征分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載青蒿數(shù)據(jù)庫(kù)（PRJNA416223）的全基因組文件、GFF 注釋文件、CDS 序列和蛋白序列。從Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取CHS 結(jié)構(gòu)域種子文件（PF00195），然后在Linux 系統(tǒng)中使用HMMER 3. 2. 1 軟件創(chuàng)建Profile HMM，與青蒿的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，去除冗余序列。接下來(lái)篩選出質(zhì)量較高的基因家族候選基因，要求E-valuelt;1×10?20，并使用clustalW2 對(duì)這些高質(zhì)多序列比對(duì)。隨后利用hmmbuild 構(gòu)建隱馬可夫模型，并使用該新建模型進(jìn)一步篩選完整的CHS 基因家族序列，篩選得到AaCHS 蛋白序列。在NCBI 下載擬南芥CHS 的蛋白質(zhì)序列文件，利用Blastp 軟件包進(jìn)行同源比對(duì)，篩選目標(biāo)物種中identity大于75% 的序列，可篩選得到AaCHS 蛋白序列。最后將Blastp 同源比對(duì)的數(shù)據(jù)和HMMER 篩選過(guò)后的數(shù)據(jù)取交集，得到AaCHS 蛋白。將候選蛋白序列用NCBI 中的CD-Search 功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)候選轉(zhuǎn)錄因子序列進(jìn)行檢驗(yàn)，最終鑒定出AaCHS 基因家族成員。利用在線工具ExPAS 軟件對(duì)AaCHS 基因家族成員的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、等電點(diǎn)、pH 值等基本信息進(jìn)行了分析［20］；利用CELLOv. 2. 5 軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)［21］；利用SOPMA對(duì)AaCHS 基因蛋白質(zhì)α 螺旋、β 轉(zhuǎn)角、延長(zhǎng)線、隨機(jī)線圈進(jìn)行分析［22］ ；利用SWISSMODEL 對(duì)AaCHS 基因蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)［23］。

1. 2 AaCHS 基因家族成員順式作用元件分析

用TBtools 軟件從青蒿的完整基因組序列中提取了16 個(gè)AaCHS 基因起始密碼子上游2000 bp的啟動(dòng)子序列。使用PlantCARE 在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些啟動(dòng)子進(jìn)行了順式作用元件的分析［24］，并最終在Tbtools 軟件中進(jìn)行了可視化展示。

1. 3 AaCHS 家族成員保守結(jié)構(gòu)域分析

使用MEGA7 中ClustalW 工具對(duì)AaCHS 蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，然后利用Weblogo 軟件獲取其標(biāo)識(shí)。最后，通過(guò)在線網(wǎng)站MEME 和TBtools軟件對(duì)AaCHS 蛋白保守基序motif 進(jìn)行分析［25］。

1. 4 AaCHS 家族成員系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

在MEGA7 中，以多序列比對(duì)的結(jié)果先計(jì)算遺傳距離，之后在MEGA7 軟件的phylogeny（系統(tǒng)進(jìn)化）中使用鄰接法（NJ）法，設(shè)置其為Poisson model模型，此外設(shè)置bootstrap（n=1000）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析［26］。

1. 5 AaCHS 基因家族成員表達(dá)分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載青蒿不同部位的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRP129502）以及青蒿光調(diào)控轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（Pro-ject： PRJNA435470）。使用Trimmomatic 軟件去除測(cè)序數(shù)據(jù)中質(zhì)量較低的序列，并利用FastQC 軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為Fastq 格式。使用hisat2重新構(gòu)建索引文件，并將其與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在Fastq 格式下進(jìn)行比對(duì)。最后，通過(guò)定量分析計(jì)算得到TPM 值，進(jìn)行l(wèi)og10（TPM+1）后生成基因表達(dá)量矩陣［27］。最后在TBtools 中對(duì)該矩陣進(jìn)行歸一化處理并進(jìn)行可視化分析。

1. 6 AaCHS 基因家族成員GO 注釋

根據(jù)eggNOG-mapper 在線網(wǎng)站，對(duì)青蒿蛋白序列進(jìn)行GO 注釋?zhuān)米⑨屛募圆町惢蜃鳛楹Y選范圍，得到AaCHS 基因功能注釋文件，再通過(guò)Rstudio 進(jìn)行可視化。

1. 7 AaCHS 基因家族成員差異基因分析

差異表達(dá)基因在Linux 系統(tǒng)下使用R 語(yǔ)言，使用BiocManager 中edgeR 軟件包進(jìn)行差異表達(dá)分析，所得差異表達(dá)基因的P-Value 去除NA 值，并對(duì)篩選出的AaCHS 基因家族成員進(jìn)行標(biāo)記，使用enhancedvolcano R 包進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與分析

2. 1 AaCHS 基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

AaCHS 基因家族成員鑒定以Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的CHS 結(jié)構(gòu)域序列（PF00195）靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，與Blastp 2 次篩選求交集，最后使用NCBI 中CDsearch功能篩選得到16個(gè)CHS 蛋白（表1），根據(jù)命名規(guī)則將其基因依次命名為AaCHS1～AaCHS16［28］。對(duì)該基因家族成員蛋白長(zhǎng)度、分子量、等電點(diǎn)、親水性平均值、脂肪指數(shù)、亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明AaCHS15 蛋白長(zhǎng)度最長(zhǎng)為516 個(gè)氨基酸，AaCHS3 蛋白長(zhǎng)度最短為266 個(gè)氨基酸；分子量為29 392. 96～56 149. 6 Da；親水性平均值從?0. 149（AaCHS16）到0. 432（AaCHS15）；脂肪指數(shù)最高的為99. 97 （AaCHS2） ，最小的為89. 60（AaCHS12）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示所有AaCHS蛋白都定位在細(xì)胞質(zhì)中（表1）。根據(jù)AaCHS基因家族成員蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)信息表（表2），可見(jiàn)α 螺旋為39. 47%～56. 98%；β 轉(zhuǎn)角4. 84%～8. 64%；延長(zhǎng)線13. 18%～20. 30%；隨機(jī)線圈25. 00%～36. 50%。由二級(jí)結(jié)構(gòu)可知，β 轉(zhuǎn)角均小于50%，可知AaCHS基因家族成員結(jié)構(gòu)疏松。根據(jù)AaCHS 基因家族成員三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖（圖1），再次證明了AaCHS蛋白結(jié)構(gòu)。

2. 2 AaCHS 基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了研究不同植物之間CHS 基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，我們使用鄰接法（NJ）對(duì)包括青蒿（Artemisia annua）16 條、雷蒙德氏棉（Gossypiumraimondii）3 條、毛果楊（Populus trichocarpa）3 條、銀中楊（Populus alba×P. Berolinensis）11 條和大豆（Glycine max）2 條在內(nèi)的5 個(gè)物種共35 條CHS蛋白序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖2）。通過(guò)這項(xiàng)分析，我們將CHS 蛋白劃分為5 個(gè)亞族：亞族Ⅰ（圖2 中綠色部分）中包含CHS 蛋白數(shù)量最多，其中包含雷蒙德氏棉、大豆和毛果楊全部CHS 蛋白，還包含青蒿CHS 蛋白（AaCHS1、AaCHS7、AaCHS10）；亞族Ⅱ（圖2 中紅色部分）中只包含青蒿CHS 蛋白（AaCHS5、AaCHS6、AaCHS8）；亞族Ⅲ（圖2 中藍(lán)色部分）中只包含剩余的青蒿CHS 蛋白（AaCHS14、AaCHS16），亞族Ⅴ（圖2 中粉色部分）中銀中楊蛋白和青蒿CHS 蛋白（AaCHS9、AaCHS12、AaCHS15）聚為一支，雷蒙德氏棉、大豆和毛果楊都屬于雙子葉植物。因此這些物種的CHS 基因家族成員之間存在較為密切的進(jìn)化關(guān)系，并且歸類(lèi)在同一類(lèi)別。

2. 3 AaCHS 基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件及鑒定分析

利用TBtools 軟件對(duì)AaCHS 基因家族成員的編碼序列基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示16 個(gè)AaCHS 基因中有8 個(gè)沒(méi)有非編碼區(qū)，而所有16 個(gè)基因均包含CDS 外顯子（圖3d），經(jīng)CD-search 鑒定后發(fā)現(xiàn)16 個(gè)AaCHS 成員均有Chal-sti-synt_N結(jié)構(gòu)（圖3c）。通過(guò)使用PlantCARE 在線網(wǎng)站對(duì)青蒿CHS 基因家族成員的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析，研究了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約2000 bp 的序列。根據(jù)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了77 個(gè)順式作用元件（圖3d），其中也包括常見(jiàn)元件TATA-box、CAAT-box 以及Abox，這些元件中部分元件與生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)、植物激素以及光響應(yīng)相關(guān)（圖4），其中與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的元件有6 種，包含有參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)（O2-site）、調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過(guò)程（CCAAT-box）等；與逆境脅迫有關(guān)的元件有4種，包括低溫響應(yīng)順式作用元件（LTR）、抗病和脅迫響應(yīng)元件（TC-rich repeats）、厭氧誘導(dǎo)作用元件（ARE）；與植物激素有關(guān)的元件有7 種，其中包括參與ABA 調(diào)節(jié)的基因表達(dá)（ABRE）、水楊酸順式作用元件（TCA-element）、茉莉酸響應(yīng)元件（CGTCA-motif）等；光響應(yīng)元件種類(lèi)最多有16種，其中包括調(diào)控靶基因的表達(dá)（MRE）、植物響應(yīng)外界環(huán)境刺激的通用調(diào)控元件（G-box）。利用MEME 在線網(wǎng)站在AaCHS 基因家族成員中找到12 個(gè)保守基序（Motif 1～Motif 12），通過(guò)對(duì)圖5 中的保守基序分析，結(jié)果表明：根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，在亞族Ⅱ 中，3 個(gè)CHS 基因（AaCHS5、AaCHS6 和AaCHS8）有相同的10 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域；亞族Ⅰ中的3 個(gè)CHS 基因（AaCHS1、AaCHS7 和AaCHS10）有相同的11 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域；而在亞族Ⅳ 中，AaCHS2、AaCHS4、AaCHS11 和AaCHS13 均具有相同的11 個(gè)保守基序，亞族Ⅴ中AaCHS15 僅有2 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，AaCHS9 和AaCHS12 中除了Motif7 外的7 個(gè)保守基序均相同；亞族Ⅲ 中AaCHS14 和AaCHS12 除了Motif 11 的10 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域均相同（圖3b）。

2. 4 AaCHS 家族成員表達(dá)分析

為了研究AaCHS 基因家族成員的表達(dá)模式，我們對(duì)不同部位組織（嫩葉、老葉、根、表皮、花蕾、種子、花、毛狀體）青蒿轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析（圖6a）。研究結(jié)果顯示，AaCHS10 和AaCHS16屬于亞族Ⅲ，其在嫩葉、老葉、表皮、花蕾、種子、花和毛狀體均顯著上調(diào)；在青蒿嫩葉中AaCHS14 顯著上調(diào)。此外對(duì)AaCHS 基因家族成員進(jìn)行光調(diào)控分析（圖6b），結(jié)果表明，AaCHS16 在白光和遠(yuǎn)紅光條件下均顯著上調(diào)，在藍(lán)光條件下表達(dá)上調(diào)；AaCHS10 在藍(lán)光、紅光和白光條件下均有表達(dá)，在黑暗下幾乎不表達(dá)，這表明藍(lán)光、紅光和白光會(huì)促進(jìn)AaCHS10 的表達(dá)；AaCHS6 在白光條件下表達(dá)均上調(diào)，這些結(jié)果能為進(jìn)一步研究 AaCHS 基因家族成員的功能提供借鑒。

2. 5 AaCHS 基因家族成員GO 注釋

用eggNOG-mapper 在線網(wǎng)站對(duì)青蒿蛋白序列進(jìn)行GO 注釋?zhuān)訟aCHS 基因蛋白為篩選范圍，AaCHS 基因進(jìn)行功能注釋。選取P-valuelt;0. 05且富集Count 最多的前12 個(gè)GO 二級(jí)分類(lèi)過(guò)程，AaCHS 基因在GO 的二級(jí)分類(lèi)的生物過(guò)程（biologicalprocess，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）2 個(gè)大類(lèi)并將其注釋?zhuān)▓D7）。從圖5 可見(jiàn)，生物過(guò)程共富集了80 條序列；細(xì)胞組分共富集了19 條序列，其中包括的細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）富集了11 條序列，數(shù)量最多；而在生物過(guò)程中富集了細(xì)胞成分組裝（cellular component assembly）、細(xì)胞發(fā)育過(guò)程（cellular developmental process）、解剖結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生（anatomical structure morphogenesis）、細(xì)胞成分的生物生成（cellular component biogenesis）、內(nèi)膜系統(tǒng)（endomembrane system）、多細(xì)胞生物體的發(fā)育（multicellular organism development）、細(xì)胞成分組織（cellular component organization）、多細(xì)胞生物體的過(guò)程（multicellular organismal process）、細(xì)胞成分的組織或生物發(fā)生（cellular componentorganization or biogenesis）、解剖結(jié)構(gòu)的發(fā)展（anatomical structure development）、發(fā)育過(guò)程（developmental）均富集了最多的8 條序列。

2. 6 AaCHS 基因家族成員差異基因分析

基于青蒿在不同光照下的調(diào)控，將青蒿在藍(lán)光、紅光、白光、遠(yuǎn)紅光調(diào)控的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)作為實(shí)驗(yàn)組，黑暗條件作為對(duì)照組，依次進(jìn)行差異基因表達(dá)分析并將其分為4 組，第1 組為藍(lán)光和黑暗條件下差異表達(dá)分析；第2 組為紅光和黑暗條件下差異表達(dá)分析；第3 組為白光和黑暗條件下差異表達(dá)分析；第4 組為遠(yuǎn)紅光和黑暗條件下差異表達(dá)分析。將分組過(guò)后的2 組青蒿器官進(jìn)行差異表達(dá)分析；在Linux 系統(tǒng)下使用R 語(yǔ)言，利用BiocManager中的edgeR 軟件包對(duì)差異表達(dá)分析，將所得差異表達(dá)基因的P-Value 去除NA 值，將既是差異表達(dá)基因又是AaCHS 基因家族成員篩選出來(lái)，使用enhancedvolcanoR 包將其可視化，以Log10FCgt;2. 0且P-Valuegt;0. 05 為閾值篩選差異表達(dá)基因。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如圖8b，AaCHS7、AaCHS10 是紅光和黑暗條件下差異表達(dá)分析下的正向差異表達(dá)基因，其Log10FC 值均大于2. 0 且P-Value 值大于0. 05；而在另外3 組（圖8a、圖8c、圖8d）中均未發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因。

3 討 論

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)植物次生代謝產(chǎn)物。黃酮類(lèi)生物合成途徑包括類(lèi)苯丙素途徑和類(lèi)黃酮途徑。查爾酮合成酶（CHS）是苯丙素類(lèi)化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，在植物中普遍存在。它在類(lèi)苯丙素途徑的初始步驟中起作用，并使3 個(gè)丙二酰-CoA 分子與1 個(gè)4-香豆酰-CoA 分子縮合以產(chǎn)生柚皮素查爾酮，其是各種類(lèi)黃酮的前體［28-31］。因此，研究查爾酮合成酶基因?qū)τ谶M(jìn)一步分析影響青蒿中類(lèi)黃酮化合物合成的環(huán)節(jié)十分必要。本研究對(duì)青蒿中CHS 基因家族進(jìn)行了識(shí)別，并進(jìn)一步分析了AaCHS 基因家族成員的理化性質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因序列、進(jìn)化關(guān)系及不同組織部位AaCHS 基因表達(dá)模式。在青蒿中共發(fā)現(xiàn)16 個(gè)AaCHS 基因家族成員，本研究還對(duì)AaCHS 蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，包括蛋白質(zhì)大小、分子量、等電點(diǎn)、平均親水性系數(shù)及亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16 個(gè)AaCHS 蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)；大多數(shù)為酸性不親水蛋白。對(duì)AaCHS 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，包括α 螺旋、β 轉(zhuǎn)角、延長(zhǎng)線、隨即線圈分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16 個(gè)AaCHS 蛋白的β 轉(zhuǎn)角均低于50%，說(shuō)明16 個(gè)AaCHS 蛋白結(jié)構(gòu)疏松；對(duì)AaCHS 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)可視化分析，證明了這一觀點(diǎn)。通過(guò)鄰接法（NJ）對(duì)5 個(gè)植物物種（包括青蒿、雷蒙德氏棉等）的35條CHS 蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析后發(fā)現(xiàn)，所有AaCHS 被劃分為5 個(gè)亞族，并與銀中楊CHS 蛋白親緣關(guān)系更近，推測(cè)他們具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)［32］；對(duì)AaCHS 基因序列分析發(fā)現(xiàn)：16 條AaCHS 基因有7 條沒(méi)有內(nèi)含子，剩余基因的內(nèi)含子數(shù)量為0～2個(gè)，16 條基因均包含CDS 外顯子，含有2～5 個(gè)外顯子，何夢(mèng)媛等［33］與本研究結(jié)果類(lèi)似。另外，在所有青蒿AaCHS 基因上游啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)最常見(jiàn)的元件是光反應(yīng)元件，其次是植物激素響應(yīng)元件，最后是生長(zhǎng)發(fā)育和逆境相關(guān)元件。本研究在AaCHS 基因中找到12 個(gè)保守基序（Motif 1～Motif12），通過(guò)對(duì)其分析發(fā)現(xiàn)：根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，在亞族Ⅱ 中，3 個(gè)CHS 基因（AaCHS5、AaCHS6、AaCHS8）有相同的10 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域；亞族Ⅰ中的3 個(gè)CHS 基因（AaCHS1、AaCHS7、AaCHS10）有相同的11 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域；而在亞族Ⅳ 中，AaCHS2、AaCHS4、AaCHS11 和AaCHS13 均具有相同的11 個(gè)保守基序；亞族Ⅲ 中AaCHS14 和AaCHS12 除了Motif 11 的10 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域均相同；亞族Ⅴ 中AaCHS15 僅有2 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，AaCHS9 和AaCHS12 中除了Motif 7，其它7 個(gè)保守基序均相同。在亞族Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 和Ⅳ 中，除了AaCHS3 外的AaCHS 家族成員均具有相同的10個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)進(jìn)化樹(shù)劃分的亞族成員，其保守結(jié)構(gòu)域存在高度保守性，推測(cè)它們有共同的起源，此外不同亞族成員間也發(fā)生了進(jìn)化，如圖3b 中的Motif 11。

為了深入探究AaCHS 基因在不同組織部位中可能發(fā)揮的功能，通過(guò)挖掘NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中青蒿8 個(gè)不同組織部位（嫩葉、老葉、根、表皮、花蕾、種子、花、毛狀體）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們篩選出了16 個(gè)AaCHS 基因家族成員，并發(fā)現(xiàn)它們?cè)诟鱾€(gè)組織中均沒(méi)有表達(dá)下調(diào)情況，與Shen 等［34］研究結(jié)果類(lèi)似，證明了我們篩選到的AaCHS 基因家族成員是可靠的。生物信息學(xué)分析顯示，AaCHS 蛋白序列高度保守，它們的Motif 分布也支持了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，AaCHS10 和AaCHS16在嫩葉、老葉、表皮、花蕾、種子、花和毛狀體均顯著上調(diào)；在青蒿嫩葉中AaCHS14 基因顯著上調(diào)；AaCHS2、AaCHS3、AaCHS4、AaCHS11 和AaCHS13 聚在一起，其表達(dá)水平類(lèi)似，推測(cè)它們可能有共同的起源并且序列保守［35］，Hassani 等［36］研究發(fā)現(xiàn)查爾酮合成酶在青蒿的芽中顯著表達(dá)，與本研究所得結(jié)論一致。為進(jìn)一步了解不同光質(zhì)對(duì)AaCHS 表達(dá)的調(diào)控，對(duì)藍(lán)光、黑暗、紅光、遠(yuǎn)紅光、白光5 個(gè)條件下AaCHS 家族基因表達(dá)模式進(jìn)行了分析。遠(yuǎn)紅光處理下，AaCHS1～AaCHS15的表達(dá)量都很低，推測(cè)在青蒿生長(zhǎng)發(fā)育和逆境適應(yīng)過(guò)程中，它們可能并未發(fā)揮作用，但這一推測(cè)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，與黑暗條件相比，光誘導(dǎo)可以顯著提升植物體內(nèi)CHS 基因表達(dá)量。比如，與黑暗處理相比，藍(lán)光誘導(dǎo)能夠顯著增加AaCHS10 基因的表達(dá)量，Kitazaki 等［37］通過(guò)分析萵苣葉的代謝途徑發(fā)現(xiàn)，在藍(lán)光下CHS 表達(dá)量顯著上調(diào)，這與本研究所得結(jié)果一致。白光誘導(dǎo)則能顯著提高AaCHS10 和AaCHS16 基因的表達(dá)量。而在紅光處理下，AaCHS16 的表達(dá)受到抑制，賴(lài)恭梯等［18］研究發(fā)現(xiàn)刺葡萄經(jīng)紅光處理后CHS 表達(dá)水平降低，與本研究所得結(jié)果一致。CHS 與植物體內(nèi)的類(lèi)黃酮等次生代謝物的生成有關(guān)，其活性與類(lèi)黃酮含量緊密相連［38］。因此，可以推測(cè)，作為環(huán)境因素之一的光質(zhì)，可能是通過(guò)影響植物體內(nèi)CHS 基因表達(dá)量，進(jìn)而影響青蒿中黃酮類(lèi)物質(zhì)的生成。這些結(jié)果也為深入研究AaCHS基因的功能，及光調(diào)控下黃酮化合物生物合成的調(diào)控機(jī)制提供了參考。

根據(jù)eggNOG-mapper 在線網(wǎng)站，對(duì)AaCHS基因進(jìn)行GO 注釋?zhuān)訟aCHS 基因蛋白作為篩選范圍，對(duì)AaCHS 基因進(jìn)行功能注釋?zhuān)瑢⑵浞譃樯镞^(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellularcomponent，CC）2 個(gè)大類(lèi)，其中生物過(guò)程共富集了90 條序列；細(xì)胞組分共富集了19 條序列，其中包括的細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）富集了11 條序列，數(shù)量最多，與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致；推測(cè)AaCHS 基因在細(xì)胞質(zhì)中調(diào)控黃酮類(lèi)化合物的累積。為了研究AaCHS 基因家族成員在不同光照下的差異表達(dá)，將青蒿在藍(lán)光、紅光、白光、遠(yuǎn)紅光調(diào)控的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)作為實(shí)驗(yàn)組，而黑暗條件則作為對(duì)照組。根據(jù)差異基因表達(dá)火山圖結(jié)果顯示，AaCHS7、AaCHS10 是紅光和黑暗條件下差異表達(dá)分析下的正向差異表達(dá)基因。推測(cè)它們?cè)谇噍锸艿郊t光處理中起正向調(diào)控作用。此外，蔡偉等［39］對(duì)魚(yú)腥草中的2 種材料（魚(yú)腥草6 號(hào)和7 號(hào)）進(jìn)行了差異表達(dá)分析，并篩選出4 個(gè)基因。本研究采用相同的篩選方法，即通過(guò)比較試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異表達(dá)情況來(lái)確定目標(biāo)基因。然而，在藍(lán)光、白光、遠(yuǎn)紅光以及黑暗條件下，未篩選出AaCHS 差異表達(dá)基因。

4 結(jié)論

本研究在青蒿基因組中發(fā)現(xiàn)了16 個(gè)CHS 基因家族成員，并且這些家族成員有12 個(gè)保守的基序。通過(guò)序列分析，發(fā)現(xiàn)AaCHS 家族相對(duì)較為保守，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也比較松散；其含有大量激素、逆境、生長(zhǎng)和光響應(yīng)元件；有8 條沒(méi)有非編碼區(qū)，16條均包含CDS 外顯子；CD-search 驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)AaCHS 蛋白均有Chal-sti-synt_N 結(jié)構(gòu)域；系統(tǒng)進(jìn)化分析將青蒿（16 條）、雷蒙德氏棉（3 條）、毛果楊（3 條）、銀中楊（11 條）、大豆（2 條）在內(nèi)的5 個(gè)物種CHS 蛋白劃分為5 個(gè)亞族。對(duì)AaCHS 基因家族成員表達(dá)分析，AaCHS10 和AaCHS16 在嫩葉、老葉、表皮、花蕾、種子、花和毛狀體均顯著上調(diào)；在青蒿嫩葉中AaCHS14 基因顯著上調(diào)。對(duì)AaCHS 進(jìn)行光調(diào)控分析，發(fā)現(xiàn)與黑暗處理相比，藍(lán)光誘導(dǎo)能顯著提高AaCHS10 基因的表達(dá)量，白光誘導(dǎo)則能顯著提高AaCHS10 和AaCHS16 基因的表達(dá)量。AaCHS 基因進(jìn)行GO 功能注釋?zhuān)患Y(jié)果分為2 個(gè)大類(lèi)BP 和CC，其中包括的細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）富集了11 條序列，數(shù)量最多，與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致，推測(cè)AaCHS 基因在細(xì)胞質(zhì)中調(diào)控黃酮類(lèi)化合物的累積。通過(guò)差異表達(dá)分析，AaCHS7、AaCHS10 是紅光和黑暗條件下差異表達(dá)分析下的正向差異表達(dá)基因，推測(cè)其在青蒿受到紅光處理中起正向調(diào)控作用。

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（編輯：呂俊俐）